陳曉燕 王瑩瑩 羅金鍵

結(jié)腸癌是臨床常見消化道惡性腫瘤,多發(fā)于40歲以上中年人群,男性居多,其病死率較高,現(xiàn)已成為我國第四大癌癥死因,且隨著國內(nèi)飲食習(xí)慣的改變,其發(fā)病率亦成上升趨勢,嚴重威脅人民生命安全[1]。目前,臨床治療結(jié)腸癌多采用外科手術(shù)配合放化療,效果并不理想,且存在術(shù)后創(chuàng)傷、化療耐藥及毒副作用等諸多不足[2]。鷹嘴豆芽素A(biochanin A,BCA)是傳統(tǒng)中草藥紅車軸草的主要有效成分,可抗炎、抗菌、抗氧化、調(diào)節(jié)血糖、抑制組織增生[3]。有學(xué)者認為[4],BCA可抑制膠質(zhì)母細胞瘤細胞活性,誘導(dǎo)細胞周期G1期停滯,增強替莫唑胺抗癌作用,提示其具有抗腫瘤活性。然而,目前關(guān)于BCA對于結(jié)腸癌的治療作用鮮有報道,且缺乏對應(yīng)的機制研究。本研究采用BCA干預(yù)結(jié)腸癌細胞,觀察其對該細胞增殖、遷移的影響,并探討可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 人結(jié)腸癌HCT-116細胞系,購自中國科學(xué)院上海細胞庫。

1.1.2 藥物、主要試劑、儀器 BCA(純度:98%,上海信裕生物科技有限公司);MTT試劑盒(上海恒斐生物科技有限公司);Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)通路激活劑SB216763[愛必信(上海)生物科技有限公司];兔抗人糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β)、β-catenin一抗(日本MBL公司)。GENios酶標儀(瑞士Tecan公司);E100顯微鏡(日本Nikon株式會社)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 取冷凍保存的人結(jié)腸癌HCT-116細胞,復(fù)蘇后置于RPMI-1640培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗),37 ℃,5% CO2條件下培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng),取對數(shù)期細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2 MTT法測定HCT-116細胞增殖活性(半數(shù)抑制濃度) 取對數(shù)期HCT-116細胞,胰酶消化、重懸,調(diào)整細胞密度為1×105個/mL接種至6孔板,待細胞融合至80%,加入不同終濃度(5,10,20,40,80,160 μmol/L)BCA溶液,培養(yǎng)48 h后每孔加入新制備MTT溶液20 μL,培養(yǎng)2 h后棄上清,每孔加入DMSO 150 μL,振蕩20 min后靜置2 h,酶標儀測定490 nm處各孔吸光度(A)值,計算細胞抑制率(%)=(1-各濃度A值/對照細胞A值)×100%,畫出折線圖得出半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.2.3 細胞干預(yù)、分組[5]取對數(shù)期HCT-116細胞,胰酶消化、重懸,待其生長至貼壁,隨機分為對照組、BCA組、SB216763組、聯(lián)合組,對照組置于RPMI-1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng),BCA組培養(yǎng)基中加入BCA DMSO溶液(終濃度40 μmol/L),SB216763組培養(yǎng)基中加入SB216763 DMSO溶液(終濃度20 μmol/L),聯(lián)合組加入BCA DMSO溶液(終濃度40 μmol/L)、SB216763 DMSO溶液(終濃度20 μmol/L)。各組設(shè)置5個復(fù)孔,培養(yǎng)48 h后進行后續(xù)實驗。

1.2.4 MTT法檢測各組增殖能力 取培養(yǎng)48 h后的各組細胞,胰酶消化、重懸,調(diào)整細胞密度為1×106個/mL接種至96孔板,分別于培養(yǎng)24、48、72 h時,加入新制備MTT溶液20 μL,培養(yǎng)2 h后棄上清,每孔加入DMSO 150 μL,振蕩20 min后靜置2 h,酶標儀測定490 nm處各孔吸光度值。

1.2.5 劃痕實驗檢測各組遷移能力 取培養(yǎng)48 h后的各組細胞,胰酶消化、重懸,調(diào)整細胞密度為1×106個/mL接種至6孔板,培養(yǎng)至貼壁后棄去培養(yǎng)基,無菌移液槍頭沿孔中心位置豎直畫一條直線劃痕,PBS沖去邊緣碎片,加入完全培養(yǎng)基培育,光鏡下拍照記錄培養(yǎng)0 h劃痕寬度與培養(yǎng)24 h劃痕寬度,計算各組遷移率=(培養(yǎng)0 h劃痕寬度-培養(yǎng)24 h劃痕寬度)/培養(yǎng)0 h劃痕寬度×100%。

1.2.6 血管擬態(tài)形成實驗檢測血管新生能力 Matrigel膠融化后與RPMI-1640培養(yǎng)基等比例混勻,注入96孔板,室溫凝固,取培養(yǎng)48 h后的各組細胞,胰酶消化、重懸,調(diào)整細胞密度為1×104個/mL接種于該孔板,置于37℃恒溫箱中孵育(氣體構(gòu)成:94%氮氣,5% CO2,1%氧氣),12 h后光鏡取5個不重復(fù)視野拍照記錄,經(jīng)圖像處理軟件Image Pro分析血管數(shù)量,取其均值。

1.2.7 免疫印跡法檢測細胞GSK-3β、β-catenin蛋白表達量 取培養(yǎng)48 h后的各組細胞,加入RIPA裂解細胞,移至離心管內(nèi),低溫離心機8 000 r/min離心15 min(離心半徑10 cm),BCA試劑盒定量蛋白。將微量樣本蛋白與4倍體積上樣緩沖液混勻,水浴煮沸5 min變性蛋白,離心取上清,電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜,5%脫脂牛奶封閉2 h,洗膜后加入兔抗人GSK-3β、β-catenin一抗(1∶500),4 ℃搖床孵育過夜,再次洗膜加入二抗(1∶2 000),孵育2 h后洗膜,經(jīng)ECL發(fā)光、暗室顯影,采用凝膠成像分析儀分析條帶灰度值,以GSK-3β、β-catenin蛋白灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值之比代表GSK-3β、β-catenin蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 不同濃度BCA對HCT-116細胞的增殖抑制率、IC50

經(jīng)5,10,20,40,80,160 μmol/L BCA溶液干預(yù)后,HCT-116細胞增殖抑制率逐漸升高,IC50位于40～80 mol/L之間,后續(xù)時實驗均采用40 mol/L作為BCA干預(yù)劑量。見圖1。

圖1 不同濃度BCA對HCT-116細胞的增殖抑制率

2.2 各組細胞增殖能力比較

與對照組比較,BCA組24、48、72 h MTT實驗吸光度值降低(P<0.05),SB216763組24、48、72 h MTT吸光度值升高(P<0.05);與BCA組比較,聯(lián)合組24、48、72 h MTT吸光度值升高(P<0.05);與SB216763組比較,聯(lián)合組24、48、72 h MTT吸光度值降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組細胞MTT吸光度值比較

2.3 各組細胞遷移能力比較

與對照組比較,BCA組細胞遷移率降低(P<0.05),SB216763組細胞遷移率升高(P<0.05);與BCA組比較,聯(lián)合組細胞遷移率升高(P<0.05);與SB216763組比較,聯(lián)合組細胞遷移率降低(P<0.05)。見表2,圖2。

表2 各組細胞遷移率比較

圖2 劃痕實驗觀察各組遷移能力(×100)

2.4 各組細胞血管新生能力比較

與對照組比較,BCA組血管數(shù)量/視野減少(P<0.05),SB216763組血管數(shù)量/視野增加(P<0.05);與BCA組比較,聯(lián)合組血管數(shù)量/視野增加(P<0.05);與SB216763組比較,聯(lián)合組血管數(shù)量/視野減少(P<0.05)。見表3,圖3。

表3 各組細胞血管新生能力比較

圖3 血管擬態(tài)形成實驗檢測管狀結(jié)構(gòu)數(shù)量(×200,標尺20 μm)

2.5 各組細胞GSK-3β、β-catenin蛋白表達量比較

與對照組比較,BCA組GSK-3β蛋白表達量升高、β-catenin蛋白表達量降低(P<0.05),SB216763組GSK-3β蛋白表達量降低、β-catenin蛋白表達量升高(P<0.05);與BCA組比較,聯(lián)合組GSK-3β蛋白表達量降低、β-catenin蛋白表達量升高(P<0.05);與SB216763組比較,聯(lián)合組GSK-3β蛋白表達量升高,β-catenin蛋白表達量降低(P<0.05)。見表4,圖4。

表4 各組細胞GSK-3β、β-catenin蛋白表達量比較

圖4 各組細胞GSK-3β、β-catenin蛋白表達量

3 討論

結(jié)腸癌好發(fā)于直腸或直腸與乙狀結(jié)腸交界位置,起始為黏膜層或黏膜下層癌腫,后逐漸侵犯至黏膜下方,直至漿膜層,腔內(nèi)生長或沿腸壁浸潤,部分蔓延至淋巴結(jié),發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移,病灶隨之增大、增多,影響機體全身[6]。結(jié)腸癌早期癥狀較輕,中期則表現(xiàn)為腹部腫塊、血便、乏力,后進展為黃疸、腹水,甚至全身衰竭[7]。纖維素食用過少、紅肉食用過多是結(jié)腸癌的主要危險因素,此外家族遺傳也是其發(fā)病影響因素之一[8]。發(fā)病隱匿、復(fù)發(fā)性強、轉(zhuǎn)移率高是結(jié)腸癌的基本特征,多數(shù)患者確診時已處于晚期,此時已出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移或肝臟轉(zhuǎn)移,治療難度顯著增加[9]。癌細胞高增殖性及高遷移能力是腫瘤轉(zhuǎn)移的主要原因,也是導(dǎo)致患者預(yù)后不佳的重要因素[10]。因此,探尋有效抑制結(jié)腸癌細胞增殖、遷移的藥物,對于結(jié)腸癌治療意義重大。

中醫(yī)治療結(jié)腸癌的歷史久遠,具有其獨特優(yōu)勢。中醫(yī)將結(jié)腸癌歸于“腸澼”、“積聚”、“下痢”等范疇,其病因為素體不足、飲食不結(jié)、陽氣缺損、氣化不調(diào),以致脾胃損傷、運化失司、濕濁生熱、毒邪始聚、滯存腸府,進而發(fā)病,熱毒郁結(jié)是其主因,故應(yīng)以清熱解毒、補氣涼血為主[11]。中藥紅車軸草取自豆科植物紅車軸草干燥花序及帶花枝葉,性微寒,味甘、苦,可清熱、涼血、止咳、消腫,BCA是其含有的一種植物異黃酮,作為天然類雌激素,可誘導(dǎo)癌細胞凋亡,抑制腫瘤血管生成,從而發(fā)揮其抗癌作用[12]。Zhao等[13]研究認為,BCA可降低體外骨肉瘤細胞MG63、U2OS增殖率、抑制其侵襲、遷移能力,提示BCA可作為惡性腫瘤潛在治療藥物。本研究結(jié)果顯示,與對照組比較,BCA組24、48、72 h MTT實驗A值、遷移率降低,血管數(shù)量/視野減少,提示BCA可抑制結(jié)腸癌細胞增殖、遷移及血管新生。

Wnt/β-catenin信號通路是機體內(nèi)一條復(fù)雜的蛋白質(zhì)作用通路,在胚胎發(fā)育及惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色,其中Wnt、GSK-3β、β-catenin是該通路重要組成蛋白[14]。β-catenin是細胞骨架結(jié)構(gòu)蛋白,正常狀態(tài)下與E鈣粘蛋白結(jié)合,發(fā)揮其細胞黏附作用[15]。Wnt是分泌糖蛋白的一種,可在細胞膜上與受體結(jié)合,間接抑制β-catenin拮抗蛋白GSK-3β表達,并促進其失活,大量β-catenin降解受阻而游離在胞質(zhì)中,部分β-catenin進入胞核,與其他轉(zhuǎn)錄因子共同作用,發(fā)揮其誘導(dǎo)細胞癌變、促進血管新生等作用[16]。Tang等[17]研究認為,激活Wnt/β-catenin信號通路可增強結(jié)直腸癌細胞遷移、侵襲,維持其復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移過程中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化能力及癌細胞干性。本研究結(jié)果顯示,與對照組比較,BCA組GSK-3β蛋白表達量升高,β-catenin蛋白表達量降低,增用Wnt/β-catenin通路激活劑SB216763可降低BCA對結(jié)腸癌的治療作用,提示BCA對結(jié)腸癌的治療作用可能與調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)。

綜上所述,BCA可抑制結(jié)腸癌細胞增殖、遷移及血管新生,抑制Wnt/β-catenin信號通路可能是其作用機制之一。