陳永成，陳涵，周倩彤，張卓欣*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與風景園林學(xué)院，廣東廣州 510630；2.中國科學(xué)院華南植物園，廣東廣州 510630）

石荷葉組（sect.IrregularesHaworth）屬于虎耳草科（Saxifragaceae）虎耳草屬（SaxifragaL.），現(xiàn)組內(nèi)有18 種[1-2]，廣泛分布于東亞地區(qū)，以中國和日本為主要分布區(qū)域[3]。石荷葉組植物均為多年生直立草本；掌狀葉基生，具長柄，葉肉內(nèi)多具碳酸鈣結(jié)晶體，葉背具紫紅色斑點或無；聚傘花序圓錐狀，花兩側(cè)對稱[3-5]。其在形態(tài)上頗為獨特，是廣受歡迎的園藝植物，也常作為中草藥使用[6-9]?；⒍荩⊿. stolonifera）別名石荷葉，喜生于陰暗潮濕處，其葉中含有巖白菜素、槲皮甙、槲皮素和沒食子酸等活性物質(zhì)，具有治療中耳炎、緩解牙痛、解熱排毒、抑菌消炎等功效，是歷史上沿用已久的中草藥材[10-15]。但民間供藥并不嚴格按照可藥用種類，藥材種類因地而異，存在用藥普遍卻難以鑒別的問題，特別是虎耳草一類可全草入藥的廣布中藥材，在中藥材炮制過程中丟失部分植物體生活特征，更加難以區(qū)分。

HARA 在《Nova Flora Japonica》中詳細記錄了5種日本產(chǎn)物種，包括8 變種、4 變型[16]。根據(jù)《中國植物志》第34 卷記載，石荷葉組植物在中國有7 種及3 變種[5]。在《Flora of China》第8 卷中，我國的石荷葉組物種修訂為7 種及4 變種[3]。石荷葉組雖然僅是虎耳草屬中的一個較小類群，但是作為虎耳草屬內(nèi)唯一擁有兩側(cè)對稱花的類群，對于研究整個虎耳草屬起源、演化歷史及形態(tài)分類方面具有重大意義。但自石荷葉組劃分以來，石荷葉組內(nèi)種的數(shù)目和劃分一直存在較多爭議。潘錦堂用葉背具紫紅色或褐色斑點作為蒙自虎耳草（S. mengtzeana）的主要分類特征[3,5]。但虎耳草（S. stolonifera）、大橋虎耳草（S. daqiaoensis）、卵心葉虎耳草（S. epiphylla）及一些新發(fā)表的種也具有葉背面斑點[1-2,4]，而石荷葉組葉片背面斑點的形態(tài)性狀、解剖結(jié)構(gòu)及性狀分布卻未見有進一步的研究論述。葉背面斑點具有作為石荷葉組種間分類依據(jù)的潛力，并可能具有一定的生物學(xué)意義。

因此，本研究通過對虎耳草屬石荷葉組的葉表皮斑點形態(tài)和解剖結(jié)構(gòu)等形態(tài)學(xué)研究，對組內(nèi)種類的斑點特征進行統(tǒng)計分析，為虎耳草屬的形態(tài)學(xué)分類研究、中藥材鑒定提供一定的理論依據(jù)與指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

為了驗證葉背面具斑點是虎耳草屬石荷葉組在虎耳草科中特有的一種形態(tài)特征，本研究的取樣范圍擴大到狹義虎耳草科。實驗材料為虎耳草科植物葉片16 種、3 變種、1 變型，其中亭閣草屬（MicranthesHaworth）植物2 種、金腰屬（ChrysospleniumTourn.ex L.）1 種、峨屏草屬（TanakaeaFranch. & Sav.）1 種、虎耳草屬山羊臭組（Saxifragasect.CiliataeHaworth）植物5 種和1 變種、虎耳草屬石荷葉組（Saxifragasect.IrregularesHaworth）植物7 種和2 變種、1 變型，具體見表1。葉片取材自臘葉標本和野外采集的活體材料，均保存在廣州市華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風景園林學(xué)院植物標本館（CANT）中。

表1 實驗材料表

1.2 試劑與儀器

番紅，分析純，福州飛凈生物科技有限公司；石蠟，化學(xué)純，德國Leica 公司；無水乙醇，分析純，廣州市政欣化工科技有限公司；二甲苯，分析純，廣州嘉樂化工有限公司；固綠染色液，分析純，福州飛凈生物科技有限公司；FAA 固定液，實驗純，蘭杰柯科技有限公司；樹膠，顯微鏡用級別，上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司；明膠，分析純，江蘇亞泰化工有限公司；甲醛，分析純，蚌埠市精誠化工有限責任公司；50%戊二醛，分析純，西安天茂化工有限公司。

RM2235切片機、EM AMW 組織處理儀、EP CPD300 臨界點干燥器、EM ACE600 真空鍍膜儀、M165C 體視鏡，德國Leica 公司；BX43 普通光學(xué)顯微鏡，日本Olympus 公司；EVO MA15 掃描電子顯微鏡，德國Zeiss 公司。

1.3 實驗方法

為了清晰、多角度地觀察葉背斑點的表皮及解剖結(jié)構(gòu)，實驗采用徒手切片法、石蠟切片法和葉表皮常規(guī)染色制片法，使用體視鏡、普通光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡用于觀察。

對所采集標本進行整理分類后，使用體視顯微鏡（10×10）對虎耳草屬石荷葉組各種類進行葉表皮斑點形態(tài)觀察及顯微影像拍攝。取新鮮樣本葉片，在原有方法基礎(chǔ)上使用改良的徒手切片法觀察葉片斑點縱切面的結(jié)構(gòu)和顏色[17]。采用石蠟切片法對新鮮葉片的斑點解剖結(jié)構(gòu)進行觀察。實驗采用葉表皮常規(guī)染色制片法觀察葉表皮特征[18]。撕取葉上表皮（腹面）和葉下表皮（背面）組織染色制片后在光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照并測量，之后玻片封邊保存。為了更好地觀察斑點的表皮結(jié)果，本研究使用掃描電子顯微鏡觀察葉表皮微形態(tài)[19]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

通過ImageJ-win 64 對所得各標本影像內(nèi)的斑點數(shù)量、大小及密度等指標進行測量，分析時采取統(tǒng)一視野范圍，像素大小為2 448×1 920。測量斑點數(shù)量時，僅將視野范圍內(nèi)完整斑點視為有效斑點進行記錄，邊緣斑點不計入總數(shù)；斑點大小通過測量圖片內(nèi)所有斑點面積后取其平均值參與后續(xù)數(shù)理統(tǒng)計分析過程；斑點密度為1 mm2內(nèi)的斑點個數(shù)（ind）。

獲取實驗所需葉表皮相關(guān)基礎(chǔ)形態(tài)指標后，所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 25.0 軟件進行方差分析，采用Duncan’s 多重比較方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉斑點形態(tài)結(jié)構(gòu)

使用體視鏡、常規(guī)染色制片法和掃描電子顯微鏡觀察葉腹面和背面表皮細胞發(fā)現(xiàn)，在有葉背斑點的石荷葉組植物中，無論斑點是什么顏色，斑點內(nèi)均有聚集成群的氣孔（圖1C、E）；斑點處表皮細胞明顯小于斑點外表皮細胞（圖1B、E、F、H）。除黑蕊虎耳草、燈架虎耳草、波密虎耳草和青藏虎耳草在葉片上表皮的氣孔有分布外，其余觀察種在上表皮均無氣孔（表2）。

圖1 石荷葉組葉背面斑點解剖結(jié)構(gòu)

表2 葉斑點與氣孔性狀分布

通過徒手切片及石蠟切片觀察斑點解剖結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，斑點下存在一個較大的氣孔下穴結(jié)構(gòu)（氣室），可能是斑點上面的氣孔群聚在一起而產(chǎn)生；伴有大小不一的晶體聚集在氣室上部，葉背面紫色斑點的色素集中在表皮細胞層，斑點處細胞較?。▓D1A）。

2.2 葉斑點性狀分布

在石荷葉組中，大橋虎耳草（S. dapiaoensis）、卵心葉虎耳草（S. epiphylla）、蒙自虎耳草（S.mengtzeana）、龍勝虎耳草（S. kwangsiensis）、虎耳草（S. stolonifera）和日本虎耳草（S. nipponica）有斑點結(jié)構(gòu)，而鏡葉虎耳草（S. fortuneivar.koraiensis）、紅毛虎耳草（S. rufescens）、扇葉虎耳草（S. rufescensvar.flabellifolia）和其他虎耳草科已觀察植物則沒有斑點結(jié)構(gòu)（表2）。斑點形態(tài)為近橢圓或不規(guī)則形；斑點顏色多樣，主要有淡黃色、淡紫色或紫色、白色、淡褐色。斑點顏色在個體水平會發(fā)生變化，其中虎耳草同一個體或居群有多種顏色的斑點，因此單獨進行數(shù)據(jù)分析。斑點區(qū)域較葉表水平面有凸起、凹陷、平整三種類型（表2）。

根據(jù)石荷葉組具有斑點各種類之間斑點密度差異，對石荷葉組具有斑點的種類進行對比（表3）。斑點密度以蒙自虎耳草最小，平均密度為（0.37±0.17） ind/mm2；虎耳草最大，平均密度為（1.88±0.24） ind/mm2；虎耳草葉片上斑點密度顯著大于蒙自虎耳草（P＜0.05），為蒙自虎耳草斑點平均密度的5.08 倍。

表3 虎耳草屬石荷葉組斑點大小與斑點密度

根據(jù)斑點大小及斑點密度差異，將具有斑點特征的石荷葉組各種類進行對比（表2，表3）。由表3 可知，6 種具有斑點特征的石荷葉組種類（大橋虎耳草、瓣萼虎耳草、虎耳草、卵心葉虎耳草、蒙自虎耳草、日本虎耳草）在斑點大小這一特征上具有明顯差異。其中，瓣萼虎耳草最小，平均面積為（0.12±0.01） mm2；蒙自虎耳草最大，平均面積為（0.70±0.30） mm2，其斑點顯著大于瓣萼虎耳草（P＜0.05），為萼瓣虎耳草斑點平均面積的5.83 倍。

單獨對所采集到的虎耳草屬石荷葉組中虎耳草標本上新老葉片的斑點大小及斑點密度特征進行對比分析（表3），發(fā)現(xiàn)新葉與老葉在斑點大小與斑點密度上具有顯著差異。其中，虎耳草新葉上的斑點大小為0.17 mm2，老葉上斑點大小為0.27 mm2，可知新葉斑點大小顯著小于老葉（P＜0.05）；在斑點密度方面，新葉斑點密度為2.56 ind/mm2，老葉上斑點密度為1.01 ind/mm2，新葉斑點密度顯著大于老葉（P＜0.05）。在同一虎耳草個體中，新葉葉片上斑點顏色呈現(xiàn)出明顯的紫紅色，而老葉上斑點顏色則趨于暗淡，呈淡紅色或淡綠色。

2.3 氣孔結(jié)構(gòu)特征

觀察虎耳草科18 種植物的氣孔長軸取向，其中龍勝虎耳草、扇葉虎耳草、虎耳草、燈架虎耳草、波密虎耳草、山地虎耳草、青藏虎耳草、蒼山虎耳草、峨屏草均為統(tǒng)一朝向，其余均為無規(guī)則（表2）。所觀察的虎耳草科植物的氣孔外形除波密虎耳草的氣孔器為圓形外，其余均為橢圓形（表2，圖1G）。

根據(jù)DILCHER 對植物氣孔器排列類型的定義，無規(guī)則型氣孔復(fù)合體的描述為保衛(wèi)細胞周圍的鄰近細胞和一般的表皮細胞無差異；平列型為兩個副衛(wèi)細胞完全圍繞著保衛(wèi)細胞，其長軸與保衛(wèi)細胞的長軸平行[20-21]。據(jù)此，本文觀察的石荷葉組氣孔復(fù)合體類型是平列型（圖1D、G）。

3 討論與結(jié)論

3.1 葉下表皮斑點的形態(tài)特異性

虎耳草葉片解剖圖像（圖1A、B）表明斑點下存在一個由氣孔復(fù)合成氣孔群產(chǎn)生的較大氣室，這可能是葉表皮斑點凹凸不平的原因。特別是在干燥標本上，一般可以觀察到凹入的斑點，可能是葉表皮干燥變形后陷入氣室導(dǎo)致，說明斑點凹凸情況必須要使用新鮮葉片進行觀察。在鮮葉上，有的葉片斑點對比下表皮表現(xiàn)為較淺的綠色，也可能是復(fù)合的氣孔下穴內(nèi)有氣體和聚集的晶體，導(dǎo)致反射的光線更多，使斑點顏色泛白。

而紫色或紅色斑點是由表皮細胞中的色素積累形成的（圖1A）。在同一種虎耳草中，斑點顏色也呈現(xiàn)出不同的顏色，這可能與葉片采摘時間、標本保存環(huán)境（溫度、保存時間）及葉片葉齡有關(guān)[22-26]。

虎耳草新葉上斑點顯著小于老葉，而新葉斑點密度則顯著大于老葉，可能與葉片年齡有關(guān)，即隨著葉齡的增大，斑點也隨之增大，進而導(dǎo)致單位面積內(nèi)虎耳草葉片上斑點密度降低[26-27]。

在本研究中，斑點中的氣孔復(fù)合體以DILCHER葉表皮特征體系和王宇飛對該體系的翻譯中的術(shù)語稱為平列型氣孔器[20-21]，在其他虎耳草科及相關(guān)物種的葉表皮研究中，該類型被認為是無規(guī)則型[28-31]。本研究結(jié)合SEM 和葉表皮染色制片方法，可以更加清晰地觀察到細胞的界限，因此可以觀察到兩個平行于氣孔的副衛(wèi)細胞，與前人研究結(jié)果不同。王慧等[28]認為由于虎耳草的氣孔復(fù)合體在斑點內(nèi)，而斑點外面表皮細胞較大，以往對氣孔器術(shù)語在定義虎耳草類群時值得商榷。因此，后續(xù)可以進行表皮細胞發(fā)生觀察，以了解氣孔復(fù)合體分化順序。

3.2 葉下表面斑點的分類學(xué)意義

本研究發(fā)現(xiàn)，8 種虎耳草屬石荷葉組植物中，只有紅毛虎耳草和鏡葉虎耳草沒有葉下表皮斑點，因此《中國植物志》用斑點區(qū)分蒙自虎耳草的論點應(yīng)進行修訂[5]。同時，斑點特征（表2、3）有明顯的種間特性，可用于石荷葉的組下分類和物種劃分。

本研究對虎耳草屬石荷葉組具有斑點結(jié)構(gòu)種類的種間斑點大小關(guān)系進行比較得知，石荷葉組種間斑點大小存在顯著差異。除紅毛虎耳草與鏡葉虎耳草無斑點外，石荷葉組各種類間斑點從大到小依次為蒙自虎耳草>大橋虎耳草>卵心葉虎耳草>虎耳草>日本虎耳草>瓣萼虎耳草。其中，蒙自虎耳草的斑點大小為0.70 mm2，顯著大于同組其他種類虎耳草；瓣萼虎耳草斑點大小為0.12 mm2，顯著小于同組其他種類。故斑點大小可以作為虎耳草屬石荷葉組中部分種類（如蒙自虎耳草及瓣萼虎耳草）的分類特征。而石荷葉組各種類間斑點大小可能與其種類自身特性及其生存環(huán)境有關(guān)，具體機制還需進一步研究。

石荷葉組具有斑點結(jié)構(gòu)植物種間斑點密度從大到小依次為虎耳草>日本虎耳草>瓣萼虎耳草＞卵心葉虎耳草>大橋虎耳草>蒙自虎耳草。其中，虎耳草葉表皮斑點密度最大，為1.88 ind/mm2，顯著大于實驗所測得石荷葉組其余種類；蒙自虎耳草斑點密度最小，為0.37 ind/mm2，其密度與除虎耳草以外該研究內(nèi)石荷葉組其他種類無顯著差異。在本研究中，斑點密度特征僅可用作區(qū)別虎耳草與蒙自虎耳草的分類特征。

以上所述斑點特征均可以用于虎耳草與近緣種的園藝種和中藥材鑒定。

3.3 斑點與氣孔群的生物學(xué)意義

多數(shù)蛾蝶類昆蟲傾向于在健康葉片上產(chǎn)卵，從而為后代提供更好的生存環(huán)境。部分植物能夠通過改變?nèi)~片部位的形態(tài)來抵御有害昆蟲的侵害，如生長于厄瓜多爾的一種彩葉芋（Caladium steudneriifolium）能夠通過在葉子上產(chǎn)生白色斑紋來模擬病株和蟲害后的形態(tài)，以避免害蟲的啃噬侵害[32]。石荷葉組具有斑點種類可能也通過類似的機制進化出葉表面斑點結(jié)構(gòu)，從而躲避昆蟲侵害，避免葉片受到損傷，但后續(xù)需要進一步的生理學(xué)研究驗證該推測。

植物氣孔的分布受環(huán)境影響較大，一般來說，氣孔密度會隨著環(huán)境中水分減少而增加，氣孔面積會隨著環(huán)境中水分減少而呈現(xiàn)小型化發(fā)展[33-35]。氣孔分布面積小而密集能使其在適應(yīng)不同類型氣候時具有更高的靈活性和更廣的適應(yīng)范圍，而氣孔群符合上述植物為適應(yīng)環(huán)境變化所需的氣孔分布類型要求[36]。因此，本研究推測氣孔群作為虎耳草屬石荷葉組的獨特性狀，可能是使得石荷葉組植物既能夠在低海拔潮濕涼爽的半陰生環(huán)境中有較好的長勢，也能夠在高山、高海拔地區(qū)中生存的重要因素之一。