董偉清 劉莉莉 蔣慧萍 邱祖楊 何芳練

摘 要：淀粉分支酶（starch branching enzyme， SBE）在支鏈淀粉生物合成中發(fā)揮關(guān)鍵作用，直接影響淀粉的含量和結(jié)構(gòu)。芋（Colocasia esculenta）是一種主要的塊莖類作物，在世界上熱帶和亞熱帶地區(qū)廣泛栽培。目前，SBE 在芋中的研究很少，對SBE 基因在芋中的數(shù)量、分子結(jié)構(gòu)特征和表達(dá)模式還不清楚。本研究首次對芋SBE 基因進(jìn)行了全面分析，鑒定了3 個(gè)SBE 基因（CeSBE1、CeSBE2 和CeSBE3）。CeSBE1、CeSBE2 和CeSBE3 蛋白氨基酸數(shù)量分別為828、845和598，分子質(zhì)量分別為92 956.71、95 625.13、69 169.16 Da，等電點(diǎn)分別為5.22、5.41 和7.36。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示3個(gè)CeSBE 蛋白分別在3 個(gè)不同的亞群。基因結(jié)構(gòu)分析顯示，CeSBE1、CeSBE2 和CeSBE3 外顯子數(shù)量分別為16、22、10；保守結(jié)構(gòu)域分析表明，CeSBE1 和CeSBE2 均具有alpha-amylase_C 和alpha-amylase 結(jié)構(gòu)域及7 個(gè)motif，而CeSBE3具有alpha-amylase 和CBM_48 結(jié)構(gòu)域及3 個(gè)motif。CeSBE 基因啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件分析表明，共預(yù)測到55 個(gè)順式作用元件，其中29 個(gè)具有功能注釋，涉及光響應(yīng)、激素響應(yīng)、植物生長發(fā)育及環(huán)境壓力等相關(guān)元件。在不同組織中，3 個(gè)CeSBE 基因均能在所有組織中表達(dá)，其中CeSBE2 在球莖和葉片顯著表達(dá)（P<0.05）；在球莖不同發(fā)育階段中，CeSBE2 在所有的發(fā)育階段均有較高的表達(dá)量，呈現(xiàn)先升高后降低的表達(dá)趨勢，在球莖發(fā)育120 d 的表達(dá)量達(dá)到峰值。

球莖不同發(fā)育階段總淀粉和支鏈淀粉含量增加與CeSBE2 表達(dá)量趨勢一致，說明CeSBE2 可能是芋支鏈淀粉生物合成的關(guān)鍵基因。本研究結(jié)果可為芋的產(chǎn)量、品質(zhì)和營養(yǎng)性狀的遺傳改良提供基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：芋；淀粉分支酶；生物信息學(xué)分析；表達(dá)分析

中圖分類號：S632.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

淀粉是高等植物主要的儲存多糖，由直鏈淀粉和支鏈淀粉構(gòu)成，是人們?nèi)粘ｏ嬍持刑妓衔锏闹饕獊碓碵1-2]。淀粉通常存在于谷類作物和塊莖類作物中， 如水稻（ Oryza sativa ） 、小麥（Triticum aestivum）、玉米（Zea mays）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）、木薯（Manihot esculenta）和芋（Colocasia esculenta）等[3-8]。支鏈淀粉是淀粉的主要組分，占總淀粉的75%～85%[9]。支鏈淀粉生物合成涉及的酶有淀粉合成酶（starch synthase，SS）、淀粉分支酶（starch branching enzyme，SBE）和淀粉脫分支酶（starch debranching enzyme，DBE）[10]，其中SBE 在淀粉含量、結(jié)構(gòu)以及物理特性方面起著關(guān)鍵作用[1， 11]。SBE 屬于α-淀粉酶家族，具有α-淀粉酶催化結(jié)構(gòu)域（A 結(jié)構(gòu)域）、氨基N-末端和羧基C-末端結(jié)構(gòu)域，主要分類為3種類型（SBE1、SBE2 和SBE3），其中SBE1 和SBE2 的功能研究得較為清楚[11]。SBE1 將直鏈淀粉濃縮成長的葡聚糖鏈，SBE2 主要利用短葡聚糖鏈為底物合成支鏈淀粉，而SBE3 的功能仍然不明確[12]。

許多SBE 基因表達(dá)和功能研究揭示了其在支鏈淀粉生物合成和植物生長發(fā)育中的作用。例如，板栗（Castanea mollissima）SBE 基因在果實(shí)發(fā)育過程中表達(dá)量顯著增加，與支鏈淀粉的合成和果實(shí)發(fā)育密切相關(guān)[13] ； 在缺乏SBEIIa 的玉米（Z. mays）中，葉片淀粉的分支急劇減少，葉片表現(xiàn)出嚴(yán)重的類似衰老的表型[14] ； 在水稻（O. sativa）中，通過抑制SBEI 和SBEIIb 基因的表達(dá)，降低了支鏈淀粉含量，將直鏈淀粉含量從25%提高到約60%，但同時(shí)由于淀粉結(jié)構(gòu)的改變，抑制了水稻幼苗的生長[9， 15]；在木薯（M. esculenta）中，通過抑制SBE1 和SBE2 的表達(dá)，降低了支鏈淀粉含量，增加了直鏈淀粉和抗性淀粉的含量[16-17]。

芋是一種主要的塊莖類作物，在熱帶和亞熱帶地區(qū)廣泛栽培[18]。淀粉是芋球莖的主要碳水化合物，占干物質(zhì)含量的70%～80%[19]，而支鏈淀粉又是總淀粉的主要組成部分[8， 20]。芋支鏈淀粉的生物合成和積累對芋球莖的產(chǎn)量、品質(zhì)以及營養(yǎng)價(jià)值具有重要的意義。因此，有必要在全基因組范圍內(nèi)鑒定與支鏈淀粉生物合成有關(guān)的關(guān)鍵候選基因，以促進(jìn)芋產(chǎn)量的提高和品質(zhì)改良。本研究從芋基因組中鑒定了3 個(gè)SBE 基因，對其分子特征、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、保守結(jié)構(gòu)、基因結(jié)構(gòu)、順式作用元件和時(shí)空表達(dá)模式進(jìn)行分析，為芋的產(chǎn)量、品質(zhì)和營養(yǎng)性狀的遺傳改良提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試芋材料為芋新品種荔浦芋1 號，該品種為魁芋類型（檳榔芋），以母芋為主要食用器官，具有產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)和耐儲藏等特點(diǎn)。選擇播種90 d 的葉片、葉柄、球莖和根用于CeSBE 基因的空間表達(dá)分析；選擇播種30 d（S1）、60 d（S2）、90 d（S3）、120 d（S4）、150 d（S5）、180 d（S6）、210 d（S7）、240 d（S8）的球莖用于CeSBE 基因的時(shí)序性表達(dá)分析。所有樣品均設(shè)置3 次生物學(xué)重復(fù)，液氮速凍后于–80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 CeSBE 蛋白的鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析 分別從TAIR 數(shù)據(jù)庫（http：//www.arabidopsis.org）和RGAP 數(shù)據(jù)庫（http：//rice.plantbiology.msu.edu）下載擬南芥和水稻的SBE 家族蛋白序列，使用HMMER 3.0 軟件以擬南芥和水稻SBE 家族蛋白序列為模板構(gòu)建隱馬爾可夫模型。通過建立的模型搜尋芋參考基因組（Niue2， https：//db.cngb.org/search/project/PRJNA328799/）的所有蛋白序列，找出潛在的CeSBE 蛋白。此外，使用BLASTp軟件（版本：2.10.1）將擬南芥和水稻SBE 蛋白序列與芋所有的蛋白序列進(jìn)行比對，E-value 設(shè)為1E-20。將上述獲得的CeSBE 蛋白序列進(jìn)行合并去冗余，去冗余后的蛋白序列作為候選的CeSBE家族蛋白序列。使用NCBI 保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫（CDD）（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）和Pfam 數(shù)據(jù)庫（https：//pfam.xfam.org/）進(jìn)一步驗(yàn)證候選CeSBE 蛋白序列的保守結(jié)構(gòu)域。使用mafft 軟件（版本：v7.427）對來自芋（C. esculenta）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（O. sativa）、馬鈴薯（S. tuberosum）、玉米（Z. mays）、小麥（T. aestivum）、番茄（Solanumlycopersicum）和葡萄（Vitis vinifera）的SBE 蛋白進(jìn)行多序列比對，然后利用MEGA 7 軟件的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（Bootstrap 值為1000）。

1.2.2 CeSBE 蛋白特性和基因結(jié)構(gòu)分析 使用ExPASy-ProtParam 軟件（ http：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測CeSBE 蛋白的理化性質(zhì)；使用MEME 5.4.1 軟件（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）預(yù)測CeSBE 蛋白的保守motif，然后使用InterProScan 數(shù)據(jù)庫（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/）對預(yù)測的motif 進(jìn)行功能注釋；使用NCBI 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）和Pfam 數(shù)據(jù)庫（http：//pfam.xfam.org/）預(yù)測CeSBE蛋白的保守結(jié)構(gòu)域； 使用GSDS 2.0 軟件（http：//gsds.gao-lab.org/）預(yù)測CeSBE 基因的結(jié)構(gòu)特征； 使用PlantCARE 數(shù)據(jù)庫（ http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對CeSBE 基因上游2 kb 序列預(yù)測啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件。

1.2.3 CeSBE 基因的轉(zhuǎn)錄組分析 對CeSBE 基因在不同組織、球莖不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況進(jìn)行分析。課題組前期對芋發(fā)育90 d 的葉片、葉柄、球莖和根開展了轉(zhuǎn)錄組測序，從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中提取CeSBE 基因的FPKM 值，分析CeSBE 基因在不同組織的表達(dá)差異；同時(shí)，在前期研究中，課題組還對球莖發(fā)育30、60、90、120、150、240 d的球莖組織開展了轉(zhuǎn)錄組研究[8]，從球莖發(fā)育的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中提取CeSBE 基因的FPKM 值，分析CeSBE 基因在球莖不同發(fā)育階段的表達(dá)差異。利用CeSBE 基因的FPKM 值，在百邁克云平臺（ https：//international.biocloud.net/zh/software/tools/detail/small/305）繪制CeSBE 基因在不同組織和球莖不同發(fā)育階段的聚類熱圖。

1.2.4 CeSBE 基因的熒光定量RT-PCR 分析 使用植物多糖多酚總RNA 提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司，DP441]提取所有樣品的總RNA，使用 TIANScriptⅡcDNA 第一鏈合成試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司，KR107]將提取的總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA 第一鏈。以不同組織和球莖不同發(fā)育階段的cDNA 為模板，使用AnalytikJena qTOWERE2.2 熒光定量PCR 儀進(jìn)行熒光定量RT-PCR 試驗(yàn)。根據(jù)芋CeSBE 基因序列信息，利用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)熒光定量RT-PCR引物（表1），以芋Actin 基因?yàn)閮?nèi)參基因[21]。使用2×ChamQUniversal SYBR qPCR Master Mix 試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司，Q711-02）進(jìn)行熒光定量RT-PCR 試驗(yàn)。反應(yīng)體系為：SYBRGreen Master Mix 10 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，模板cDNA 1.0 μL，雙蒸水補(bǔ)足20.0 μL。

熒光定量RT-PCR 反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性3 min，每循環(huán)95 ℃ 15 s，57 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，45 個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品3 次重復(fù)。采用2-ΔΔCT 法計(jì)算基因的相對表達(dá)量[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 CeSBE 蛋白的鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析

在芋基因組（Niu2）中共鑒定到3 個(gè)SBE 基因，分別命名為CeSBE1（Taro_034516）、CeSBE2（Taro_009230）和CeSBE3（Taro_053106）。

CeSBE1、CeSBE2 和CeSBE3 蛋白氨基酸數(shù)量分別為828、845、598，分子質(zhì)量分別為92 956.71

Da、95 625.13 Da、69 169.16 Da，等電點(diǎn)分別為5.22、5.41 和7.36。CeSBE 蛋白在氨基酸數(shù)量、分子質(zhì)量和等電點(diǎn)的差異可能反映其在各種生物過程中的功能差異。

為了研究芋CeSBE 蛋白的進(jìn)化關(guān)系，將27個(gè)SBE 蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，包括3 個(gè)芋CeSBE、2 個(gè)擬南芥AtSBE、3 個(gè)水稻OsSBE、3個(gè)馬鈴薯StSBE、3 個(gè)玉米ZmSBE、7 個(gè)小麥TaSBE、3 個(gè)番茄SlSBE 和3 個(gè)葡萄VvSBE。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示（圖1），27 個(gè)SBE 蛋白被分為3 個(gè)群組（Group I、Group II 和Group III）。GroupI 包含10 個(gè)SBE 蛋白，包括芋CeSBE1、水稻OsSBE1、馬鈴薯StSBE1、玉米ZmSBE1、小麥TaSBE1.1/1.2/1.3/1.4 、番茄SlSBE1 和葡萄VvSBE1；Group II 包含11 個(gè)SBE 蛋白，包括芋CeSBE2、水稻OsSBE2、擬南芥AtSBE2.1/2.2、馬鈴薯StSBE2 、玉米ZmSBE2 、小麥TaSBE2.1/2.2/2.3 、番茄SlSBE2 和1 個(gè)葡萄VvSBE2；Group III 包含6 個(gè)SBE 蛋白，包括芋CeSBE3、水稻OsSBE3、馬鈴薯StSBE3、玉米ZmSBE3、番茄SlSBE3 和葡萄VvSBE3。

在芋3 個(gè)CeSBE 中，CeSBE1、CeSBE2 和CeSBE3 分別歸屬于Group I、Group II 和Group III（圖1）。在Group I 中，CeSBE1 與番茄SlSBE、馬鈴薯StSBE 和葡萄VvSBE 形成的分支聚在一起； 在Group II 中， CeSBE2 處于擬南芥AtSBE2.1/2.2、馬鈴薯StSBE2、番茄SlSBE2 和葡萄VvSBE2 形成分支的根部；在Group III 中，CeSBE3 與水稻OsSBE3 和ZmSBE3 形成的分支聚在一起。

2.2 芋CeSBE 基因結(jié)構(gòu)和保守motif 分析

外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)特征分析進(jìn)一步支持了CeSBE 基因的進(jìn)化特征（圖2A）。CeSBE1、CeSBE2和CeSBE3 外顯子數(shù)量分別為16、22、10，說明3 個(gè)CeSBE 基因在進(jìn)化和功能上發(fā)生了差異。為了進(jìn)一步探究CeSBE 蛋白結(jié)構(gòu)多樣性和預(yù)測其功能，使用MEME 5.4.1 軟件在3 個(gè)CeSBE 蛋白中鑒定了7 個(gè)保守的motif，并在InterPro 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行了注釋，所有motif 均注釋為1，4-α-葡聚糖分支酶（ 1，4-alpha-glucan-branching enzyme，IPR037439）（圖2B、表2）。CeSBE1 和CeSBE2均包含所有的7 個(gè)motif，而CeSBE3 只有3 個(gè)motif（motif1、motif2、motif3）（圖2B）。使用NCBI 數(shù)據(jù)庫和Pfam 數(shù)據(jù)庫對芋CeSBE 的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示CeSBE1 包含alphaamylase_C 和alpha-amylase 結(jié)構(gòu)域，CeSBE2 包含alpha-amylase_C、alpha-amylase 和CBM_48 結(jié)構(gòu)域，CeSBE3 包含alpha-amylase 和CBM_48 結(jié)構(gòu)域（表3）。3 個(gè)CeSBE 在外顯子數(shù)量、保守motif 和保守結(jié)構(gòu)域的差異，可能反映了3 個(gè)CeSBE 之間不同的進(jìn)化歷史和功能差異。

2.3 芋CeSBE 基因啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件分析

提取3 個(gè)芋CeSBE 基因CDS 上游2 kb 序列，使用PlantCARE 數(shù)據(jù)庫預(yù)測該區(qū)域的順式作用元件，共預(yù)測到55 個(gè)順式作用元件，其中29 個(gè)具有功能注釋。將具有功能注釋的順式作用元件分為6 類，包括響應(yīng)光、激素的元件以及與環(huán)境壓力、結(jié)合位點(diǎn)、生長發(fā)育和啟動(dòng)子相關(guān)的元件（表4）。響應(yīng)光的順式作用元件有10 個(gè)，其中G-box是3 個(gè)CeSBE 基因共有的，其他如Box 4、GT1-motif、GATA-motif 等在其中的1 個(gè)或2 個(gè)基因出現(xiàn)。響應(yīng)激素的順式作用元件有7 個(gè)，其中AuxRR-core 和TGA-element 為生長素響應(yīng)元件，TGACG-motif 和CGTCA-motif 為茉莉酸甲酯（MeJA）響應(yīng)元件，ABRE 為脫落酸（ABA）響應(yīng)元件，P-box 為赤霉素（GA）響應(yīng)元件，TCA-element 為水楊酸響應(yīng)元件。其他類型順式作用元件如與分生組織表達(dá)有關(guān)的順式調(diào)節(jié)元件CAT-box，參與干旱誘導(dǎo)的MYB 響應(yīng)元件MBS，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游30 bp 附近的核心啟動(dòng)子元件 TATA-box 等。說明芋CeSBE 基因可以響應(yīng)各種環(huán)境變化并協(xié)調(diào)芋的生長發(fā)育，但3 個(gè)CeSBE基因在不同類型的響應(yīng)元件中存在差異。

2.4 芋CeSBE 基因表達(dá)模式分析

為了研究CeSBE 基因在芋生長發(fā)育中的功能，根據(jù)課題組前期對芋球莖淀粉的積累規(guī)律，對植株發(fā)育90 d 的不同組織（葉片、葉柄、球莖和根）和球莖不同發(fā)育階段的樣品進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序，從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中提取3 個(gè)CeSBE 基因的FPKM 值，對CeSBE 基因在不同組織和球莖不同發(fā)育階段的表達(dá)模式進(jìn)行了分析（圖3）。在不同組織中，CeSBE2 在球莖的表達(dá)量最高，F(xiàn)PKM值為203.27，其次為葉片和葉柄，F(xiàn)PKM 值分別為108.72 和46.48，根的表達(dá)量最低，F(xiàn)PKM 值僅為3.95；CeSBE1 在葉片的表達(dá)量較高，F(xiàn)PKM值為17.86，在球莖、葉柄和根的表達(dá)量較低，F(xiàn)PKM 值均小于10；CeSBE3 在所有的組織的表達(dá)量均較低，F(xiàn)PKM 值均小于5（圖3A）。在球莖不同發(fā)育階段中，CeSBE2 在所有發(fā)育階段均有較高的表達(dá)量，其中表達(dá)量最高的為S4，F(xiàn)PKM值為128.71；CeSBE1 在球莖發(fā)育前期（S1～S3）的表達(dá)量相對略高，F(xiàn)PKM 值大于9，發(fā)育后期（S4～S8）表達(dá)量較低，F(xiàn)PKM 值小于8；CeSBE3的表達(dá)量在所有發(fā)育階段均較低（FPKM 值小于4）（圖3B）。CeSBE2 在球莖中表達(dá)量最高，且在球莖的所有發(fā)育階段均表現(xiàn)持續(xù)的高表達(dá)，說明其可能在芋球莖發(fā)育和淀粉積累中起關(guān)鍵作用。

2.5 芋CeSBE 基因的qRT-PCR 分析

轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示，3 個(gè)CesBE 基因在芋不同組織和球莖不同發(fā)育階段表現(xiàn)出不同表達(dá)模式，尤其是CeSBE2 在球莖中的表達(dá)量最高，且在球莖不同發(fā)育階段持續(xù)高表達(dá)（圖3）。因此，本研究使用熒光定量RT-PCR 進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性（圖4）。3 個(gè)CeSBE 基因在不同組織中顯示出不同水平的組織特異性表達(dá)。

CeSBE2 在球莖和葉片顯著高表達(dá)（P<0.05），CeSBE1 與CeSBE2 類似，在球莖和葉片顯著表達(dá)（P<0.05），但整體表達(dá)量較低，CeSBE3 在所有的組織中表達(dá)量均較低。在球莖不同發(fā)育階段中，以葉片的表達(dá)量為對照，CeSBE2 在球莖發(fā)育的所有階段均有較高的表達(dá)量，表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢；CeSBE3 與CeSBE2 類似，在所有發(fā)育階段的表達(dá)量均高于葉片，但整體表達(dá)量均較低；CeSBE1 在球莖的S3～S5 階段的表達(dá)量略高于其他發(fā)育階段，但整體表達(dá)量均較低。熒光定量RT-PCR 與轉(zhuǎn)錄組測序分析保持一致的結(jié)果。

2.6 芋球莖發(fā)育過程中CeSBE 基因的表達(dá)與淀粉含量變化分析

在前期研究中，本課題組對芋球莖發(fā)育過程中總淀粉、支鏈淀粉和直鏈淀粉的含量進(jìn)行了測定[8]。總淀粉含量在球莖發(fā)育前期較低， 從3.95 g/100 g（30 d）增加到4.51 g/100 g（60 d），在球莖發(fā)育中期， 淀粉含量迅速增加， 從14.5 g/100 g（90 d）增加到25.4 g/100 g（150 d）；直鏈淀粉含量在球莖發(fā)育過程中緩慢增加，從0.28 g/100 g（30 d）增加到3.76 g/100 g（240 d）；支鏈淀粉含量變化與總淀粉含量變化趨勢一致，在球莖發(fā)育前期較低，從3.67 g/100 g（30 d）增加到3.77 g/100 g（60 d），在球莖發(fā)育中期，支鏈淀粉含量也迅速增加，從13.4 g/100 g（90 d）增加到22.7 g/100 g（150 d）（圖5）。支鏈淀粉在球莖各發(fā)育階段占總淀粉含量的83.59%～92.91%，說明芋球莖總淀粉含量的增加主要由支鏈淀粉含量增加引起。在球莖發(fā)育過程中，CeSBE2 的表達(dá)量遠(yuǎn)高于CeSBE1 和CeSBE3，因此CeSBE2 可能是支鏈淀粉合成的關(guān)鍵基因。在球莖發(fā)育前期，CeSBE2 表達(dá)量較低，此時(shí)球莖支鏈淀粉和總淀粉含量維持在較低水平；在球莖發(fā)育中期，CeSBE2 表達(dá)量迅速升高且在120 d 達(dá)到峰值，此時(shí)支鏈淀粉和總淀粉含量迅速增加；在球莖發(fā)育后期，CeSBE2 表達(dá)量略有下降，支鏈淀粉和總淀粉含量緩慢增加。CeSBE2 表達(dá)量變化與球莖支鏈淀粉和總淀粉含量增加趨勢一致。

3 討論

盡管芋也是高淀粉作物，但與其他高淀粉類作物如水稻（O. sativa）、馬鈴薯（S. tuberosum）和木薯（M. esculenta）等的研究相比，芋的研究相對較少，特別是在支鏈淀粉生物合成和球莖發(fā)育方面[9， 17， 23]。SBE 是支鏈淀粉生物合成的關(guān)鍵酶，影響淀粉的產(chǎn)量和結(jié)構(gòu)，同時(shí)還在植物生長發(fā)育中發(fā)揮作用[1， 11]。在本研究中，從芋基因組中鑒定了3 個(gè)CeSBE 基因，這與水稻（O. sativa）、玉米（Z. mays）、高粱（Sorghum bicolor）、大麥（Hordeum vulgare）和馬鈴薯（S. tuberosum）等作物的SBE 基因數(shù)量一致[1， 12]。但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，與其他一些作物的SBE 基因數(shù)量存在差異，如擬南芥（A. thaliana）有2 個(gè)SBE 基因，木薯（ M. esculenta ） 有6 個(gè)SBE 基因， 小麥（T. aestivum）有7 個(gè)SBE 基因，香蕉（Musa acuminata）在不同的基因組中SBE 基因也存在差異，A 基因組有7 個(gè)SBE 基因，B 基因組有6 個(gè)SBE 基因[1， 12， 24]。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析，3 個(gè)CeSBE蛋白分別在不同的群組，這與大多數(shù)谷類作物和園藝作物的SBE 分類一致[11]。系統(tǒng)發(fā)育分析得到了基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域分析的進(jìn)一步支持。外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)特征分析顯示3 個(gè)CeSBE 基因的外顯子數(shù)量存在差異，分別為16、22、10，與在香蕉（M. acuminata）上報(bào)道的一致[12]。在保守結(jié)構(gòu)域上，CeSBE1 和CeSBE2 蛋白均包含alpha-amylase_C 和alpha-amylase 兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，CeSBE3 只有alpha-amylase 結(jié)構(gòu)域，這與之前在其他作物上報(bào)道的一致，均為SBE1 和SBE2 的結(jié)構(gòu)域特征高度保守，而SBE3 缺乏部分保守結(jié)構(gòu)域[11]；在保守motif 上，CeSBE1 和CeSBE2 均包含7 個(gè)motif，而CeSBE3 只有3 個(gè)motif，與在木薯（M. esculenta）上報(bào)道的一致[24]。

淀粉代謝受到植物內(nèi)部時(shí)鐘和外部晝夜變化的嚴(yán)格調(diào)節(jié)，SBE 基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)也呈現(xiàn)晝夜波動(dòng)[25-26]。在本研究中共有10 個(gè)順式作用元件為光響應(yīng)元件，與在蘋果（Malus domestica）、菠菜（Spinacia oleracea）、馬鈴薯（S. tuberosum）和擬南芥（A. thaliana）等作物上報(bào)道的一致[11]。除了光響應(yīng)元件外，還有7 個(gè)激素響應(yīng)元件，包括生長素、MeJA、ABA、GA 和水楊酸等，與在木薯上報(bào)道的一致[24]。CeSBE 基因上游包含的順式作用元件說明該基因受環(huán)境和激素的調(diào)控。

已經(jīng)有許多作物的研究表明，SBE 基因在貯藏器官的發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。例如，甘薯（Ipomoea batatas）和板栗（C. mollissima）SBE基因在貯藏器官發(fā)育過程中表達(dá)量持續(xù)增加，直至貯藏器官發(fā)育成熟[13， 27]。在豌豆（Pisum sativum）中，SBEII 的缺失導(dǎo)致種子出現(xiàn)皺褶表型，淀粉生物合成減少50%[28]。在本研究中，只有CesBE2 在球莖不同發(fā)育階段均有較高的表達(dá)水平，說明CeSBE2 可能在球莖發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，支鏈淀粉與總淀粉在球莖不同發(fā)育階段的比例也印證了CeSBE2 的作用，與在蘋果（M.domestica）和香蕉（M. acuminata）上報(bào)道的一致[12， 29]。鑒于SBE 基因在支鏈淀粉生物合成中的關(guān)鍵作用，許多作物通過抑制SBE 基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)高直鏈淀粉新種質(zhì)的創(chuàng)制，目前已經(jīng)在水稻（O. sativa）、玉米（Z. mays）、木薯（M. esculenta）及小麥（T. aestivum）等作物上獲得成功，創(chuàng)制了高直鏈淀粉的種質(zhì)[9， 16-17， 30-31]。本研究結(jié)果為芋品種改良和高直鏈淀粉新種質(zhì)的創(chuàng)制提供了很好的基礎(chǔ)和思路。

參考文獻(xiàn)

[1] TETLOW I J， EMES M J. A review of starch-branching enzymes and their role in amylopectin biosynthesis[J]. IUBMB Life， 2014， 66（8）： 546-558.

[2] BAYSAL C， HE W， DRAPAL M， VILLORBINA G，MEDINA V， CAPELL T， KHUSH G S， ZHU C， FRASER P D， CHRISTOU P. Inactivation of rice starch branching enzyme IIb triggers broad and unexpected changes in metabolism by transcriptional reprogramming[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2020， 117（42）： 26503-26512.

[3] CAI Y， LI S， JIAO G， SHENG Z， WU Y， SHAO G， XIE L， PENG C， XU J， TANG S， WEI X， HU P. OsPK2 encodes a plastidic pyruvate kinase involved in rice endosperm starch synthesis， compound granule formation and grain filling[J].Plant Biotechnology Journal， 2018， 16（11）： 1878-1891.

[4] WANG Z， MA S， SUN B， WANG F， HUANG J， WANG X，BAO Q. Effects of thermal properties and behavior of wheat starch and gluten on their interaction： a review[J]. International Journal of Biological Macromolecules， 2021， 177：474-484.

[5] ZHONG Y， LI Y， QU J， ZHANG X， SEYTAHMETOVNA S A， BLENNOW A， GUO D. Structural features of five types of maize starch granule subgroups sorted by flow cytometry[J]. Food Chemistry， 2021， 356： 129657.

[6] TIESSEN A， HENDRIKS J H， STITT M， BRANSCHEID A，GIBON Y， FARRé E M， GEIGENBERGER P. Starch synthesis in potato tubers is regulated by post-translational redox modification of ADP-glucose pyrophosphorylase： a novel regulatory mechanism linking starch synthesis to the sucrose supply[J]. Plant Cell， 2002， 14（9）： 2191-2213.

[7] DONG M Y， FAN X W， LI Y Z. Cassava AGPase genes and their encoded proteins are different from those of other plants[J]. Planta， 2019， 250（5）： 1621-1635.

[8] DONG W Q， HE F L， JIANG H P， LIU L L， QIU Z Y. Comparative transcriptome sequencing of taro corm development with a focus on the starch and sucrose metabolism pathway[J]. Frontiers in Genetics， 2021， 12： 771081.

[9] WANG J， HU P， LIN L， CHEN Z， LIU Q， WEI C. Gradually decreasing starch branching enzyme expression is responsible for the formation of heterogeneous starch granules[J]. Plant Physiology， 2018， 176（1）： 582-595.

[10] ZHU J， YU W， ZHANG C， ZHU Y， XU J， LI E， GILBERT R G， LIU Q. New insights into amylose and amylopectin biosynthesis in rice endosperm[J]. Carbohydrate Polymers，2020， 230： 115656-115662.

[11] YU J， WANG K， BECKLES D M. Starch branching enzymes as putative determinants of postharvest quality in horticultural crops[J]. BMC Plant Biology， 2021， 21（1）： 479-494.

[12] MIAO H， SUN P， LIU Q， LIU J， JIA C， ZHAO D， XU B，JIN Z. Molecular identification of the key starch branching enzyme-encoding gene SBE2.3 and its interacting transcription factors in banana fruits[J]. Horticulture Research， 2020，7（1）： 1354-1368.

[13] CHEN L， LU D， WANG T， LI Z， ZHAO Y， JIANG Y，ZHANG Q， CAO Q， FANG K， XING Y， QIN L. Identification and expression analysis of starch branching enzymes involved in starch synthesis during the development of chestnut （Castanea mollissima Blume） cotyledons[J]. PLoS One， 2017， 12（5）： e0177792.

[14] YANDEAU-NELSON M D， LAURENS L， SHI Z， XIA H，SMITH A M， GUILTINAN M J. Starch-branching enzyme IIa is required for proper diurnal cycling of starch in leaves of maize[J]. Plant Physiology， 2011， 156（2）： 479-490.

[15] PAN T， LIN L， WANG J， LIU Q， WEI C. Long branch-chains of amylopectin with B-type crystallinity in rice seed with inhibition of starch branching enzyme I and IIb resist in situ degradation and inhibit plant growth during seedling development： degradation of rice starch with inhibition of SBEI/IIb during seedling development[J]. BMC Plant Biology， 2018， 18（1）： 9-19.

[16] UTSUMI Y， UTSUMI C， TANAKA M， TAKAHASHI S，OKAMOTO Y， ONO M， NAKAMURA Y， SEKI M. Suppressed expression of starch branching enzyme 1 and 2 increases resistant starch and amylose content and modifies amylopectin structure in cassava[J]. Plant Molecular Biology，2022， 108（4/5）： 413-427.

[17] LUO S， MA Q， ZHONG Y， JING J， WEI Z， ZHOU W， LU X， TIAN Y， ZHANG P. Editing of the starch branching enzyme gene SBE2 generates high-amylose storage roots in cassava[J]. Plant Molecular Biology， 2022， 108（4/5）： 429-442.

[18] LU T J， LIN J H， CHEN J C， CHANG Y H. Characteristics of taro （Colocasia esculenta） starches planted in different seasons and their relations to the molecular structure of starch[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2008，56（6）： 2208-2215.

[19] NAGAR C K， DASH S K， RAYAGURU K， PAL U S，NEDUNCHEZHIYAN M. Isolation， characterization， modification and uses of taro starch： a review[J]. International Journal of Biological Macromolecules， 2021， 192： 574-589.

[20] 顧繪， 陳賽男， 李良俊， 程立寶. 芋淀粉分支酶SBE 基因的克隆與表達(dá)分析[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 2016， 43（10）： 2049-2058.

[21] 王立， 殷劍美， 韓曉勇， 張培通， 郭文琦， 李春宏. 芋淀粉合成酶AGPase 基因的克隆及表達(dá)分析[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2016， 43（6）： 1117-1125.

[22] LIVAK K J， SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method[J]. Methods， 2001， 25（4）： 402-408.

[23] TAKEUCHI A， OHNUMA M， TERAMURA H， ASANO K， NODA T， KUSANO H， TAMURA K， SHIMADA H. Creation of a potato mutant lacking the starch branching enzyme gene StSBE3 that was generated by genome editing using the CRISPR/dMac3-Cas9 system[J]. Plant Biotechnology （Tokyo），2021， 38（3）： 345-353.

[24] PEI J， WANG H， XIA Z， LIU C， CHEN X， MA P， LU C，WANG W. Phylogeny and expression pattern of starch branching enzyme family genes in cassava （Manihot esculenta Crantz） under diverse environments[J]. Molecular and Cellular Biochemistry， 2015， 406（1/2）： 273-284.

[25] BAGUMA Y， SUN C， AHLANDSBERG S， MUTISYA J， PALMQVIST S， RUBAIHAYO P R， MAGAMBO M J，EGWANG T G， LARSSON H， JANSSON C. Expression patterns of the gene encoding starch branching enzyme II in the storage roots of cassava （Manihot esculenta Crantz）[J].Plant Science， 2003， 164（5）： 833-839.

[26] GRAF A， SMITH A M. Starch and the clock： the dark side of plant productivity[J]. Trends in Plant Science， 2011， 16（3）：169-175.

[27] HAMADA T， KIM S H， SHIMADA T. Starch-branching enzyme I gene （IbSBEI） from sweet potato （Ipomoea batatas）; encoding starch branching enzyme I （SBEI） in apple （Malus× domestica， Rosaceae） and its phylogenetic relationship to Sbe genes from other angiosperms[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution， 2007， 43（3）： 852-863.

[28] BHATTACHARYYA M K， SMITH A M， ELLIS T H，HEDLEY C， MARTIN C. The wrinkled-seed character of?pea described by Mendel is caused by a transposon-like insertion?in a gene encoding starch-branching enzyme[J]. Cell，?1990， 60（1）： 115-122.

[29] HAN Y， GASIC K， SUN F， XU M， KORBAN S S. A gene?molecular cloning and expression analysis[J]. Biotechnology?Letters， 2006， 28（16）： 1255-1261.

[30] ZHAO Y， LI N， LI B， LI Z， XIE G， ZHANG J. Reduced expression of starch branching enzyme IIa and IIb in maize endosperm by RNAi constructs greatly increases the amylose content in kernel with nearly normal morphology[J]. Planta，2015， 241（2）： 449-461.

[31] LI J， JIAO G， SUN Y， CHEN J， ZHONG Y， YAN L， JIANG D， MA Y， XIA L. Modification of starch composition， structure and properties through editing of TaSBEIIa in both winter and spring wheat varieties by CRISPR/Cas9[J]. Plant Biotechnology Journal， 2021， 19（5）： 937-951.