袁燕 宋鵬飛 菅博書 崔穆峰
摘要 采用酸水解法測(cè)定蒜頭果蛋白的氨基酸組成,結(jié)果發(fā)現(xiàn),蒜頭果蛋白的氨基酸組成豐富,含有17種氨基酸。根據(jù)其精確分子量推算,得出每個(gè)蒜頭果蛋白分子的各氨基酸殘基數(shù)約為503個(gè)。其中酸性和堿性氨基酸殘基含量分別為23.06%和13.32%,說(shuō)明蒜頭果蛋白是一種酸性蛋白質(zhì);親水作用較強(qiáng)的氨基酸殘基占總氨基酸殘基數(shù)的50.3%,說(shuō)明該蛋白在水溶液中的溶解性比較好,便于用09%生理鹽水溶解其干粉樣品,為蒜頭果蛋白作為藥品的開發(fā)利用提供了便利條件。
關(guān)鍵詞 蒜頭果蛋白;酸水解;氨基酸組成
中圖分類號(hào) Q517? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611(2023)14-0192-02
作者簡(jiǎn)介 袁燕(1975—),女,江西新余人,副教授,博士,從事蛋白質(zhì)的分離純化及分子作用機(jī)制研究。
蒜頭果(Malania oleifera Chun et S.Lee)又名猴子果、山桐果、馬蘭后(壯語(yǔ))等[1],屬于鐵青樹科(Olacaceae)蒜頭果屬,是我國(guó)特有的單種屬稀有植物[2],已被列為國(guó)家二級(jí)保護(hù)樹種、廣西重點(diǎn)保護(hù)野生植物[3]。在自然界分布很窄,僅見于我國(guó)廣西西部的大新、龍州、右江流域各縣和云南東部的富寧、廣南等地。蒜頭果種子中富含油脂,含油率高達(dá)670%,主要成分為油酸、硬脂酸和棕櫚酸,可作為合成麝香酮的理想原料,具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[4-5]。
蒜頭果蛋白是從蒜頭果種子中分離純化出來(lái)的一種新的Ⅱ型核糖體失活蛋白。該蛋白具有非常強(qiáng)的抗腫瘤活性,對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞的半抑制濃度(IC50)為1.54×10-10 mol/L,其IC50值均遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于具有抗腫瘤、抗病毒活性的天花粉蛋白(4.10×10-5 mol/L)和廣譜抗癌藥物順鉑(1.59×10-6 mol/L),說(shuō)明該蛋白具有用于免疫毒素治療癌癥的應(yīng)用前景[6]。由于蒜頭果蛋白的氨基酸序列還未知,為了更清楚地了解其抗腫瘤活性及結(jié)構(gòu)的關(guān)系,該研究采用酸水解法測(cè)定蒜頭果蛋白的氨基酸組成,為后續(xù)研究蒜頭果蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)打下基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 設(shè)備與試劑
氨基酸自動(dòng)分析儀(日立835-50型);蛋白純化系統(tǒng)(KTA Explorer 100,Amersham);Milli-Q純水機(jī)(MILLIRORE公司);萬(wàn)分之一天平(Sartorius,BP110S)。100 μmol/L 17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液(Beckman);其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
1.2 試驗(yàn)方法
1.2.1 蒜頭果蛋白樣品的獲取。
將200 g蒜頭果種子去外殼,按種仁與20 mmol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖液1∶5比例用組織搗碎機(jī)搗碎,紗布過(guò)濾,離心(8 000 r/min,4 ℃),上清液用30%~80%硫酸銨分段鹽析,離心(8 000 r/min,4 ℃),沉淀用20 mmol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖液溶解,在蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)上過(guò)柱體積為20 mL的疏水色譜層析柱[HiprepTM phenyl FF(High sub)],用ddH2O按0~100%線性梯度洗脫,280 nm紫外檢測(cè),流速為4 mL/min,每管5 mL自動(dòng)收集[7]。樣品純度用12.0% SDS-PAGE電泳檢測(cè)。
1.2.2 蒜頭果蛋白樣品的水解。準(zhǔn)確稱取1.000 mg蒜頭果蛋白樣品于水解試管中,加6 mol/L HCl溶液2~4 mL,混勻后放入冷凍劑中,冷凍3~5 min后抽真空,充入氮?dú)?0 s,立即旋緊蓋子,110 ℃水解22 h,待玻璃管冷卻后開管,水解液在70~80 ℃水浴中蒸干,加少量蒸餾水再蒸干,重復(fù)3次[8]。
1.2.3 蒜頭果蛋白氨基酸組成的測(cè)定。將HCl揮發(fā)后的樣品用適量pH 2.2檸檬酸鈉緩沖液溶解,0.4 μm微孔濾膜抽濾或13 000 r/min離心15 min,濾液或上清液于氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行分析各氨基酸的含量[9]。
2 結(jié)果與分析
2.1 蒜頭果蛋白樣品的獲取
圖1為蒜頭果蛋白樣品在蛋白純化系統(tǒng)上分離純化的色譜層析圖。從圖1可以看出,主要有4個(gè)峰,分別標(biāo)為峰I、峰Ⅱ、峰Ⅲ和峰Ⅳ,通過(guò)SDS-PAGE電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)峰Ⅳ即為蒜頭果蛋白,收集峰Ⅳ溶液,真空冷凍干燥成干粉,置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
2.2 蒜頭果蛋白氨基酸組成分析
2.2.1 氨基酸組成分析。從圖2和表1可以看出,蒜頭果蛋白的氨基酸組成豐富,含有17種氨基酸組分。根據(jù)各氨基酸的摩爾百分比和蒜頭果蛋白精確分子量(61 875 Da)推算出在蒜頭果蛋白分子中各種氨基酸的個(gè)數(shù),總和為503個(gè)。其中脂肪族氨基酸基為86.88%(共437個(gè));芳香族氨基酸殘基為5.76%(共29個(gè));雜環(huán)族氨基酸占7.36%(共37個(gè))。酸性氨基酸殘基及其酰胺為23.06%(共116個(gè));堿性氨基酸殘基為13.32%(共67個(gè)),說(shuō)明蒜頭果蛋白是一種酸性蛋白質(zhì),這與蒜頭果蛋白的等電點(diǎn)為5.5是一致的。
在蒜頭果蛋白總氨基酸殘基數(shù)中,以天冬氨酸(67個(gè))為最多,達(dá)14.4%,這里可能包括天門冬酰胺,因?yàn)樘扉T冬酰胺在有酸或堿存在下容易水解并生成天冬氨酸。天冬氨酸和含量排第三的谷氨酸(可能包括谷氨酰胺)同屬于酸性氨基酸[6],一般帶負(fù)電荷,以酸根形式存在,在蛋白質(zhì)內(nèi)以鹽鍵形式與正電荷基團(tuán)連接。谷氨酸的帶負(fù)電荷的γ-羧基常位于蛋白質(zhì)分子表面,能與鈣結(jié)合,可能蒜頭果蛋白含有非常高的鈣離子。
在總氨基酸殘基數(shù)中,殘基數(shù)排第三的是絲氨酸(49個(gè)),它與含量比較高的蘇氨酸(32個(gè))同屬于羥基氨基酸。由于側(cè)鏈帶有極性基團(tuán),具有一定的親水性。氨基酸殘基帶有羥基側(cè)鏈者化學(xué)上比較活潑,常作為活性殘基而進(jìn)行研究其功能具有十分重要的意義。
2.2.2 疏水性和親水性分析。從表1可以看出,蒜頭果蛋白中具有較強(qiáng)疏水作用的亮氨酸(39個(gè))、纈氨酸(36個(gè))、脯氨酸(29個(gè))、異亮氨酸(20個(gè))、苯丙氨酸(16個(gè))和甲硫氨酸(2個(gè))等殘基占總氨基酸殘基數(shù)的29.7%,說(shuō)明蒜頭果蛋白的疏水作用比較強(qiáng),這與“1.2.1”試驗(yàn)中用疏水色譜層析柱一步就可以將該蛋白分離純化出來(lái)的結(jié)果是一致的。
此外,蒜頭果蛋白中具有較強(qiáng)親水作用的絲氨酸(49個(gè))、蘇氨酸(32個(gè))、天冬氨酸(67個(gè))、谷氨酸(49個(gè))、精氨酸(47個(gè))和賴氨酸(12個(gè))等殘基占總氨基酸殘基數(shù)的50.3%,由此可以推斷蒜頭果蛋白在水溶液中的溶解性比較好,便于用0.9%生理鹽水溶解蒜頭果蛋白干粉樣品,為蒜頭果蛋白作為藥品的使用提供了便利條件。
3 討論與結(jié)論
蛋白質(zhì)氨基酸組成的測(cè)定方法主要有酸水解、堿水解和酶水解,在水解過(guò)程中,逐漸降解成分子量越來(lái)越小的肽段,直到最后成為氨基酸的混合物。酶水解不產(chǎn)生消旋作用,也不破壞氨基酸,但水解不徹底,需要幾種酶協(xié)同作用才能使蛋白質(zhì)完全水解,且需要時(shí)間較長(zhǎng),所以主要用于蛋白質(zhì)部分水解,在氨基酸組成測(cè)定中用的較少。堿水解一般與5 mol/L NaOH共煮10~20 h,可使蛋白質(zhì)完全水解,但水解過(guò)程中多數(shù)氨基酸遭到不同程度的破壞,且產(chǎn)生消旋現(xiàn)象,不過(guò)色氨酸卻是穩(wěn)定的[10]。酸水解是氨基酸組成測(cè)定方法中最常用的方法,其優(yōu)點(diǎn)是不引起消旋作用,得到的是L-氨基酸,缺點(diǎn)是色氨酸完全被沸酸所破壞,羥基氨基酸(絲氨酸、蘇氨酸)有一小部分被分解,同時(shí)酰胺基被水解下來(lái)[11]。該研究采用酸水解法測(cè)定蒜頭果蛋白的氨基酸組成,雖然在該試驗(yàn)中沒(méi)有色氨酸、天門冬酰胺和谷氨酰胺的數(shù)據(jù),但根據(jù)蒜頭果蛋白精確分子量已推算出每個(gè)蛋白質(zhì)分子中各氨基酸殘基數(shù)的近似值為503個(gè),是一種酸性蛋白質(zhì),可能含有非常高的鈣離子,疏水作用比較強(qiáng),水溶性也很好,此結(jié)果為后期深入研究蒜頭果蛋白結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系奠定基礎(chǔ)。
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