袁燕 宋鵬飛 菅博書 崔穆峰

摘要 采用酸水解法測(cè)定蒜頭果蛋白的氨基酸組成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蒜頭果蛋白的氨基酸組成豐富，含有17種氨基酸。根據(jù)其精確分子量推算，得出每個(gè)蒜頭果蛋白分子的各氨基酸殘基數(shù)約為503個(gè)。其中酸性和堿性氨基酸殘基含量分別為23.06%和13.32%，說(shuō)明蒜頭果蛋白是一種酸性蛋白質(zhì)；親水作用較強(qiáng)的氨基酸殘基占總氨基酸殘基數(shù)的50.3%，說(shuō)明該蛋白在水溶液中的溶解性比較好，便于用09%生理鹽水溶解其干粉樣品，為蒜頭果蛋白作為藥品的開發(fā)利用提供了便利條件。

關(guān)鍵詞 蒜頭果蛋白；酸水解；氨基酸組成

中圖分類號(hào) Q517? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2023）14-0192-02

作者簡(jiǎn)介 袁燕（1975—），女，江西新余人，副教授，博士，從事蛋白質(zhì)的分離純化及分子作用機(jī)制研究。

蒜頭果（Malania oleifera Chun et S.Lee）又名猴子果、山桐果、馬蘭后（壯語(yǔ)）等［1］，屬于鐵青樹科（Olacaceae）蒜頭果屬，是我國(guó)特有的單種屬稀有植物［2］，已被列為國(guó)家二級(jí)保護(hù)樹種、廣西重點(diǎn)保護(hù)野生植物［3］。在自然界分布很窄，僅見于我國(guó)廣西西部的大新、龍州、右江流域各縣和云南東部的富寧、廣南等地。蒜頭果種子中富含油脂，含油率高達(dá)670%，主要成分為油酸、硬脂酸和棕櫚酸，可作為合成麝香酮的理想原料，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值［4-5］。

蒜頭果蛋白是從蒜頭果種子中分離純化出來(lái)的一種新的Ⅱ型核糖體失活蛋白。該蛋白具有非常強(qiáng)的抗腫瘤活性，對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞的半抑制濃度（IC50）為1.54×10-10 mol/L，其IC50值均遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于具有抗腫瘤、抗病毒活性的天花粉蛋白（4.10×10-5 mol/L）和廣譜抗癌藥物順鉑（1.59×10-6 mol/L），說(shuō)明該蛋白具有用于免疫毒素治療癌癥的應(yīng)用前景［6］。由于蒜頭果蛋白的氨基酸序列還未知，為了更清楚地了解其抗腫瘤活性及結(jié)構(gòu)的關(guān)系，該研究采用酸水解法測(cè)定蒜頭果蛋白的氨基酸組成，為后續(xù)研究蒜頭果蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 設(shè)備與試劑

氨基酸自動(dòng)分析儀（日立835-50型）；蛋白純化系統(tǒng)（KTA Explorer 100，Amersham）；Milli-Q純水機(jī)（MILLIRORE公司）；萬(wàn)分之一天平（Sartorius，BP110S）。100 μmol/L 17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液（Beckman）；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蒜頭果蛋白樣品的獲取。

將200 g蒜頭果種子去外殼，按種仁與20 mmol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖液1∶5比例用組織搗碎機(jī)搗碎，紗布過(guò)濾，離心（8 000 r/min，4 ℃），上清液用30%～80%硫酸銨分段鹽析，離心（8 000 r/min，4 ℃），沉淀用20 mmol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖液溶解，在蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)上過(guò)柱體積為20 mL的疏水色譜層析柱［HiprepTM phenyl FF（High sub）］，用ddH2O按0～100%線性梯度洗脫，280 nm紫外檢測(cè)，流速為4 mL/min，每管5 mL自動(dòng)收集［7］。樣品純度用12.0% SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

1.2.2 蒜頭果蛋白樣品的水解。準(zhǔn)確稱取1.000 mg蒜頭果蛋白樣品于水解試管中，加6 mol/L HCl溶液2～4 mL，混勻后放入冷凍劑中，冷凍3～5 min后抽真空，充入氮?dú)?0 s，立即旋緊蓋子，110 ℃水解22 h，待玻璃管冷卻后開管，水解液在70～80 ℃水浴中蒸干，加少量蒸餾水再蒸干，重復(fù)3次［8］。

1.2.3 蒜頭果蛋白氨基酸組成的測(cè)定。將HCl揮發(fā)后的樣品用適量pH 2.2檸檬酸鈉緩沖液溶解，0.4 μm微孔濾膜抽濾或13 000 r/min離心15 min，濾液或上清液于氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行分析各氨基酸的含量［9］。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒜頭果蛋白樣品的獲取

圖1為蒜頭果蛋白樣品在蛋白純化系統(tǒng)上分離純化的色譜層析圖。從圖1可以看出，主要有4個(gè)峰，分別標(biāo)為峰I、峰Ⅱ、峰Ⅲ和峰Ⅳ，通過(guò)SDS-PAGE電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)峰Ⅳ即為蒜頭果蛋白，收集峰Ⅳ溶液，真空冷凍干燥成干粉，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 蒜頭果蛋白氨基酸組成分析

2.2.1 氨基酸組成分析。從圖2和表1可以看出，蒜頭果蛋白的氨基酸組成豐富，含有17種氨基酸組分。根據(jù)各氨基酸的摩爾百分比和蒜頭果蛋白精確分子量（61 875 Da）推算出在蒜頭果蛋白分子中各種氨基酸的個(gè)數(shù)，總和為503個(gè)。其中脂肪族氨基酸基為86.88%（共437個(gè)）；芳香族氨基酸殘基為5.76%（共29個(gè)）；雜環(huán)族氨基酸占7.36%（共37個(gè)）。酸性氨基酸殘基及其酰胺為23.06%（共116個(gè)）；堿性氨基酸殘基為13.32%（共67個(gè)），說(shuō)明蒜頭果蛋白是一種酸性蛋白質(zhì)，這與蒜頭果蛋白的等電點(diǎn)為5.5是一致的。

在蒜頭果蛋白總氨基酸殘基數(shù)中，以天冬氨酸（67個(gè)）為最多，達(dá)14.4%，這里可能包括天門冬酰胺，因?yàn)樘扉T冬酰胺在有酸或堿存在下容易水解并生成天冬氨酸。天冬氨酸和含量排第三的谷氨酸（可能包括谷氨酰胺）同屬于酸性氨基酸［6］，一般帶負(fù)電荷，以酸根形式存在，在蛋白質(zhì)內(nèi)以鹽鍵形式與正電荷基團(tuán)連接。谷氨酸的帶負(fù)電荷的γ-羧基常位于蛋白質(zhì)分子表面，能與鈣結(jié)合，可能蒜頭果蛋白含有非常高的鈣離子。

在總氨基酸殘基數(shù)中，殘基數(shù)排第三的是絲氨酸（49個(gè)），它與含量比較高的蘇氨酸（32個(gè)）同屬于羥基氨基酸。由于側(cè)鏈帶有極性基團(tuán)，具有一定的親水性。氨基酸殘基帶有羥基側(cè)鏈者化學(xué)上比較活潑，常作為活性殘基而進(jìn)行研究其功能具有十分重要的意義。

2.2.2 疏水性和親水性分析。從表1可以看出，蒜頭果蛋白中具有較強(qiáng)疏水作用的亮氨酸（39個(gè)）、纈氨酸（36個(gè)）、脯氨酸（29個(gè)）、異亮氨酸（20個(gè)）、苯丙氨酸（16個(gè)）和甲硫氨酸（2個(gè)）等殘基占總氨基酸殘基數(shù)的29.7%，說(shuō)明蒜頭果蛋白的疏水作用比較強(qiáng)，這與“1.2.1”試驗(yàn)中用疏水色譜層析柱一步就可以將該蛋白分離純化出來(lái)的結(jié)果是一致的。

此外，蒜頭果蛋白中具有較強(qiáng)親水作用的絲氨酸（49個(gè)）、蘇氨酸（32個(gè)）、天冬氨酸（67個(gè)）、谷氨酸（49個(gè)）、精氨酸（47個(gè)）和賴氨酸（12個(gè)）等殘基占總氨基酸殘基數(shù)的50.3%，由此可以推斷蒜頭果蛋白在水溶液中的溶解性比較好，便于用0.9%生理鹽水溶解蒜頭果蛋白干粉樣品，為蒜頭果蛋白作為藥品的使用提供了便利條件。

3 討論與結(jié)論

蛋白質(zhì)氨基酸組成的測(cè)定方法主要有酸水解、堿水解和酶水解，在水解過(guò)程中，逐漸降解成分子量越來(lái)越小的肽段，直到最后成為氨基酸的混合物。酶水解不產(chǎn)生消旋作用，也不破壞氨基酸，但水解不徹底，需要幾種酶協(xié)同作用才能使蛋白質(zhì)完全水解，且需要時(shí)間較長(zhǎng)，所以主要用于蛋白質(zhì)部分水解，在氨基酸組成測(cè)定中用的較少。堿水解一般與5 mol/L NaOH共煮10～20 h，可使蛋白質(zhì)完全水解，但水解過(guò)程中多數(shù)氨基酸遭到不同程度的破壞，且產(chǎn)生消旋現(xiàn)象，不過(guò)色氨酸卻是穩(wěn)定的［10］。酸水解是氨基酸組成測(cè)定方法中最常用的方法，其優(yōu)點(diǎn)是不引起消旋作用，得到的是L-氨基酸，缺點(diǎn)是色氨酸完全被沸酸所破壞，羥基氨基酸（絲氨酸、蘇氨酸）有一小部分被分解，同時(shí)酰胺基被水解下來(lái)［11］。該研究采用酸水解法測(cè)定蒜頭果蛋白的氨基酸組成，雖然在該試驗(yàn)中沒(méi)有色氨酸、天門冬酰胺和谷氨酰胺的數(shù)據(jù)，但根據(jù)蒜頭果蛋白精確分子量已推算出每個(gè)蛋白質(zhì)分子中各氨基酸殘基數(shù)的近似值為503個(gè)，是一種酸性蛋白質(zhì)，可能含有非常高的鈣離子，疏水作用比較強(qiáng)，水溶性也很好，此結(jié)果為后期深入研究蒜頭果蛋白結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

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