郭雪琳，馬鋒鋒，周海佳

空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，西安 710038

流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，預(yù)計到2025年我國糖尿病患者數(shù)量將上升至3億，其中近50%的患者可能發(fā)生心臟功能障礙［1］。糖尿病心肌?。―CM）是糖尿病最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，特征是在沒有冠狀動脈粥樣硬化、高血壓或其他心血管疾病情況下出現(xiàn)的病理性心臟重塑［2］。DCM進展涉及多種機制，包括心肌氧化應(yīng)激、炎癥和心肌細胞缺失，并且氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)也加速了心肌細胞的缺失［3-4］。心肌細胞是心臟最主要的細胞，心肌細胞大量缺失不僅可以引起心肌纖維化，同時也會誘發(fā)心臟功能衰竭。研究顯示，從天然植物熊果葉中萃取出的對苯二酚化合物熊果苷（AR）具有較強的抗氧化應(yīng)激和抗炎特性，在多種心血管疾病中展現(xiàn)了積極的治療作用［5-9］。2022年8月—2023年3月，本研究通過腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）聯(lián)合高糖高脂飲食法建立DCM小鼠模型，并觀察AR對DCM小鼠心肌損傷的影響及其可能的作用機制，為DCM的心肌保護治療提供新的思路?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：清潔級雄性C57BL/6小鼠60只，6～8周齡，體質(zhì)量20～25 g，購自空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（軍）2007-007號。主要藥物及試劑：AR、STZ均購自美國Sigma公司；沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）特異性抑制劑EX527購自美國Sigma公司，SIRT1抗體和SIRT1活性檢測試劑盒均購自美國Abcam公司；膠原蛋白Collagen1、Collagen3引物均由上海生工生物工程科技有限公司設(shè)計合成；氧化應(yīng)激相關(guān)因子超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）均購自南京建成生物工程研究所，活性氧（ROS）檢測試劑盒、超氧化物陰離子熒光探針（DHE）購自美國Invitrogen公司，氧化應(yīng)激標(biāo)志物煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2（NOX2）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4（NOX4）引物均由上海生工生物工程科技有限公司設(shè)計合成；細胞焦亡相關(guān)因子NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NLRP3）和凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（ASC）抗體均購自美國Abcam公司，炎癥相關(guān)因子白細胞介素6（IL-6）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）引物均由上海生工生物工程科技有限公司設(shè)計合成；焦亡信號關(guān)鍵蛋白白細胞介素1β（IL-1β）和白細胞介素18（IL-18）抗體均購自美國Abcam公司，裂解的半胱氨酸蛋白酶1（cleaved Caspase-1）抗體購自美國Cell Signaling公司。

1.2 模型建立與分組處理 將60只雄性C57BL/6小鼠隨機分為Con組、DCM組、DCM+AR組、DCM+AR+EX527組，每組15只。Con組正常飲食飲水，其余三組均建立DCM小鼠模型［10］：給予小鼠高糖高脂飲食1個月后，連續(xù)3 d腹腔注射STZ 60 mg/kg；2周后，通過尾靜脈檢測空腹血糖≥16.7 mmol/L即可認(rèn)為糖尿病模型初步建立成功，后續(xù)仍給予高糖高脂飲食12周，經(jīng)心臟超聲檢查證實成功建立DCM模型。DCM+AR組和DCM+AR+EX527組建模成功后給予AR 50 mg/（kg·d）灌胃12周，同時DCM+AR+EX527組建模后即給予EX527 20 mg/kg腹腔注射，1周/次，共注射11次。

1.3 心臟功能測定 采用VisualSonics 770超聲心動圖儀。取分組處理后的各組小鼠，取仰臥位，異氟烷麻醉，保持心率400～500次/分。采用超聲心動圖儀30 MHz換能器測量左心室收縮功能，計算左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）和左心室短軸縮短率（LVFS）。

1.4 心肌組織病理情況觀察 各組小鼠心臟功能測定完成后腹腔注射巴比妥類藥物進行處死，經(jīng)左側(cè)肋間開胸摘取心臟，在預(yù)冷的PBS中漂洗3次，取部分心臟標(biāo)本直接液氮保存；另一部分心臟標(biāo)本在10%多聚甲醛溶液中浸泡48 h，石蠟包埋，制備厚度為5 μm的切片。①Masson染色：取各組部分心臟組織石蠟切片，脫蠟后再水化，采用Masson三色法染色，膠原纖維被染成藍色、肌纖維被染成紅色，顯微鏡拍照后用Image J軟件評估心肌組織纖維化程度。②天狼星紅染色：取部分心臟組織石蠟切片，脫蠟后再水化，采用天狼星紅染色，膠原被染成紅色、肌纖維被染成黃色，顯微鏡拍照后用Image J軟件評估心肌組織膠原沉積情況。

1.5 心肌組織NF-κB表達 采用免疫熒光染色。取部分心臟組織石蠟切片，脫蠟后再水化；切片抗原修復(fù)后滴加10%山羊血清，常溫封閉1 h；加入抗NF-κB一抗（1∶ 200），4 ℃條件下孵育過夜；加入生物素標(biāo)記的二抗，室溫條件下孵育1 h；將DAPI核染色液滴加到組織切片上，避光水浴，37 ℃條件下孵育15 min；采用Olympus FV1000激光共聚焦顯微鏡拍照，觀察NF-κB紅色熒光強度。

1.6 SIRT1去乙酰化活性檢測 采用ELISA法。取各組部分液氮中快速冷凍的心臟組織，根據(jù)試劑盒說明書，將SIRT1檢測緩沖液、氟底物肽、NAD和顯影液的混合物在室溫下孵育1 h，使用SpectraMax M5分光光度儀測定吸光度值，計算SIRT1去乙?；钚浴?/p>

1.7 心肌組織ROS、SOD及MDA檢測 取各組部分液氮中快速冷凍的心臟組織，切成厚度為5 μm的冰凍切片；滴加DHE染液，37 ℃避光孵育15 min，采用Olympus FV1000激光共聚焦顯微鏡拍照，Image J軟件分析二氫乙錠熒光相對強度，以此表示ROS表達。取各組部分液氮中快速冷凍的心臟組織，制備心臟組織勻漿，按照試劑盒說明書滴加反應(yīng)液，使用SpectraMax M5分光光度儀進行分光光度分析，以此表示MDA、SOD表達。

1.8 心肌組織IL-6、TNF-α、Collagen1、Collagen3、NOX2、NOX4 mRNA檢測 采用實時熒光定量PCR法。取各組部分液氮中快速冷凍的心臟組織，加入TRIzol試劑提取總RNA，測定其純度及濃度合格，使用SuperScript第一鏈合成系統(tǒng)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。IL-6、TNF-α、Collagen1、Collagen3、NOX2、NOX4及內(nèi)參GAPDH引物序列見表1。采用CFX96實時PCR系統(tǒng)c1000熱循環(huán)儀進行反應(yīng)，2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。

表1 相關(guān)基因及內(nèi)參GAPDH引物序列

1.9 心肌組織SIRT1、NLRP3、ASC、cleaved Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白檢測 采用Westen blotting法。取各組部分液氮中快速冷凍的心臟組織，提取總蛋白。將蛋白按每孔30 μg上樣量在8%～15%SDS-PAGE凝膠中電泳分離，并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上。加入SIRT1、NLRP3、ASC、cleaved Caspase-1、IL-1β、IL-18及內(nèi)參GAPDH一抗（稀釋比例分別為1∶ 1 000、1∶ 1 000、1∶ 1 000、1∶ 500、1∶ 1 000、1∶ 1 000、1∶ 5 000），4 ℃孵育過夜；加入山羊抗兔或羊抗鼠偶聯(lián)二抗，室溫孵育2 h。使用ECL Plus化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)進行顯影，Image J軟件分析條帶灰度值，計算目的蛋白相對表達量。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism 9.0統(tǒng)計軟件。計量資料采用K-S正態(tài)性檢驗，呈正態(tài)分布以表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗，兩重復(fù)測量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量的方差分析；非正態(tài)分布以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠心臟功能比較 與Con組比較，DCM+AR組、DCM組、DCM+AR+EX527組小鼠LVEF、LVFS均降低，以DCM組、DCM+AR+EX527組降低更明顯（P均＜0.05）。見表2。

表2 各組小鼠LVEF、LVFS比較（）

表2 各組小鼠LVEF、LVFS比較（）

注：與Con組比較，*P＜0.05；與DCM+AR組比較，#P＜0.05。

組別Con組DCM+AR組DCM組DCM+AR+EX527組n5 5 5 5 LVEF（%）68.56 ± 4.98 48.34 ± 4.00*33.59 ± 2.94*#34.25 ± 3.85*#LVFS（%）32.87 ± 3.22 23.54 ± 2.78*15.62 ± 1.47*#15.40 ± 1.58*#

2.2 各組小鼠心肌組織病理情況比較 Con組心肌組織無明顯藍色膠原纖維及紅色膠原著色，即無顯著纖維化及膠原沉積；與Con組相比，DCM+AR組、DCM組、DCM+AR+EX527組小鼠均存在心肌組織纖維化程度增加、膠原沉積增多，以DCM組、DCM+AR+EX527組變化更明顯。見OSID碼圖1。

2.3 各組小鼠心肌組織NF-κB表達及SIRT1去乙?；钚员容^ 與Con組比較，DCM+AR組、DCM組、DCM+AR+EX527組小鼠心肌組織NF-κB表達升高、SIRT1去乙酰化活性降低，以DCM組、DCM+AR+EX527組變化更明顯（P均＜0.05）。見表3。

表3 各組小鼠心肌組織NF-κB表達及SIRT1去乙?；钚员容^（）

表3 各組小鼠心肌組織NF-κB表達及SIRT1去乙?；钚员容^（）

注：與Con組比較，*P＜0.05；與DCM+AR組比較，#P＜0.05。

組別Con組DCM+AR組DCM組DCM+AR+EX527組SIRT1去乙酰化活性0.96 ± 0.12 0.73 ± 0.07*0.37 ± 0.12*#0.36 ± 0.12*#n5 5 5 5 NF-κB 1.00 ± 0.13 2.12 ± 0.37*3.79 ± 0.58*#4.06 ± 0.49*#

2.4 各組小鼠心肌組織SOD、MDA、ROS表達比較 與Con組比較，DCM+AR組、DCM組、DCM+AR+EX527組小鼠心肌組織SOD表達均降低，MDA、ROS表達均升高，以DCM組、DCM+AR+EX527組變化更明顯（P均＜0.05）。見表4。

表4 各組小鼠心肌組織SOD、MDA、ROS表達比較（）

表4 各組小鼠心肌組織SOD、MDA、ROS表達比較（）

注：與Con組比較，*P＜0.05；與DCM+AR組比較，#P＜0.05。

組別Con組DCM+AR組DCM組DCM+AR+EX527組ROS 1.07 ± 0.10 1.69 ± 0.23*3.48 ± 0.20*#3.53 ± 0.22*#n5 5 5 5 SOD（U/mg）257.52 ± 29.80 213.51 ± 17.19*144.35 ± 26.29*#150.86 ± 13.60*#MDA（nmol/mg）6.71 ± 0.17 8.38 ± 0.63*11.35 ± 0.92*#11.47 ± 0.98*#

2.5 各組小鼠心肌組織IL-6、TNF-α、Collagen1、Collagen3、NOX2、NOX4 mRNA表達比較 與Con組比較，DCM+AR組、DCM組、DCM+AR+EX527組小鼠心肌組織IL-6、TNF-α、Collagen1、Collagen3、NOX2、NOX4 mRNA表達均升高，以DCM組、DCM+AR+EX527組升高更明顯（P均＜0.05）。見表5。

表5 各組小鼠心肌組織IL-6、TNF-α、Collagen1、Collagen3、NOX2、NOX4 mRNA相對表達量比較（）

表5 各組小鼠心肌組織IL-6、TNF-α、Collagen1、Collagen3、NOX2、NOX4 mRNA相對表達量比較（）

注：與Con組比較，*P＜0.05；與DCM+AR組比較，#P＜0.05；

組別Con組DCM+AR組DCM組DCM+AR+EX527組NOX4 1.02 ± 0.13 1.73 ± 0.24*3.13 ± 0.37*#3.06 ± 0.42*#n5 5 5 5 IL-6 1.03 ± 0.14 2.71 ± 0.58*6.04 ± 0.85*#5.36 ± 0.69*#TNF-α 0.93 ± 0.14 3.10 ± 0.60*4.61 ± 0.70*#4.59 ± 0.78*#Collagen1 1.08 ± 0.15 1.87 ± 0.26*3.47 ± 0.43*#3.37 ± 0.38*#Collagen3 1.01 ± 0.11 2.14 ± 0.40*4.56 ± 0.47*#4.46 ± 0.45*#NOX2 1.05 ± 0.13 2.32 ± 0.32*4.25 ± 0.42*#4.18 ± 0.46*#

2.6 各組小鼠心肌組織NLRP3、ASC、SIRT1、IL-1β、IL-18、cleaved Caspase-1蛋白表達比較 與Con組和DCM+AR組比較，DCM組、DCM+AR+EX527組小鼠心肌組織NLRP3、ASC、IL-1β、IL-18、cleaved Caspase-1蛋白相對表達量均升高，SIRT1蛋白相對表達量均降低（P均＜0.05）。見表6及OSID碼圖2。

表6 各組小鼠心肌組織NLRP3、ASC、SIRT1及IL-1β、IL-18、cleaved Caspase-1蛋白相對表達量比較（）

表6 各組小鼠心肌組織NLRP3、ASC、SIRT1及IL-1β、IL-18、cleaved Caspase-1蛋白相對表達量比較（）

注：與Con組比較，*P＜0.05；與DCM+AR組比較，#P＜0.05。

組別Con組DCM+AR組DCM組DCM+AR+EX527組cleaved Caspase-1 1.02 ± 0.13 1.34 ± 0.15 2.04 ± 0.23*#1.89 ± 0.21*#n5 5 5 5 NLRP3 1.02 ± 0.17 1.33 ± 0.20 2.18 ± 0.22*#2.07 ± 0.24*#ASC 0.96 ± 0.15 1.31 ± 0.24 3.20 ± 0.38*#3.05 ± 0.44*#SIRT1 1.02 ± 0.11 0.89 ± 0.10 0.43 ± 0.08*#0.45 ± 0.12*#IL-1β 1.06 ± 0.13 1.38 ± 0.19 2.39 ± 0.23*#2.22 ± 0.22*#IL-18 1.03 ± 0.14 1.40 ± 0.19 2.61 ± 0.21*#2.51 ± 0.33*#

3 討論

糖尿病患者預(yù)后不良主要與機體長期糖脂代謝紊亂引起的各種并發(fā)癥有關(guān)，導(dǎo)致如心臟、腎臟、大腦等多器官的損害和功能障礙［11］。糖尿病心肌損傷是糖尿病患者最致命的并發(fā)癥之一，DCM的心功能障礙通常歸因于心肌的病理結(jié)構(gòu)改變，其特征是細胞外膠原沉積和基質(zhì)重塑。過多膠原形成和心肌纖維化進展會加重心肌硬化，進而影響心臟收縮功能［2，12］。AR是近年來發(fā)現(xiàn)的一種具有多重藥理活性的酚類化合物，在多種心血管疾病中展現(xiàn)了積極的治療作用［6-9］。研究報道，AR可通過調(diào)控心肌細胞凋亡，改善異丙腎上腺素所致心肌纖維化和心臟功能損傷［13］。本研究通過構(gòu)建DCM小鼠模型并對其給予持續(xù)AR灌胃處理，結(jié)果顯示與DCM組相比，DCM+AR組小鼠心肌組織纖維化程度降低，膠原沉積減少，Collagen1和Collagen3 mRNA表達下調(diào)，LVEF、LVFS升高；提示AR可以改善DCM小鼠的心臟收縮功能，減輕心肌損傷，減少膠原沉積和心肌纖維化，證實AR可作為一種潛在的治療DCM的心肌保護藥物。

氧化應(yīng)激是由ROS過量產(chǎn)生引發(fā)的，是DCM發(fā)生的主要機制之一［14］。由于糖脂代謝失調(diào)，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物和晚期糖基化終產(chǎn)物的積累，破壞了ROS形成和清除之間的平衡，最終引起心肌細胞內(nèi)氧化應(yīng)激損傷［15］。因此，抑制ROS的產(chǎn)生對治療DCM至關(guān)重要。在糖尿病動物模型中，通過減輕炎癥反應(yīng)同樣能夠達到明顯的心肌保護作用［16］。NF-κB是誘導(dǎo)心肌炎癥的核心分子，不僅能誘導(dǎo)TNF-α和IL-6等促炎細胞因子表達，同時能進一步促進單核細胞、淋巴細胞和巨噬細胞在心肌的募集和浸潤，再次放大炎癥反應(yīng)［17-18］。本研究結(jié)果顯示，與DCM組相比，DCM+AR組小鼠心肌組織ROS和MDA表達下降，SOD表達上升，氧化應(yīng)激標(biāo)志物NOX2和NOX4 mRNA表達下調(diào)，NF-κB表達降低，炎癥因子IL-6、TNF-α mRNA表達下降；這表明AR可通過減輕小鼠心肌組織氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)而發(fā)揮抗DCM心肌損傷的作用。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，細胞焦亡參與多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展［19］。細胞焦亡是細胞壞死和凋亡之外的一種炎癥性程序性細胞死亡方式，主要由炎癥小體激活Caspase-1介導(dǎo)的相關(guān)信號通路引發(fā)［20］。研究表明，糖尿病心肌損傷時存在細胞焦亡，并可能是該病理條件下心肌細胞缺失的主要原因［21-22］。此外，心肌氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)也是引起心肌細胞發(fā)生焦亡的關(guān)鍵始動因素。ROS是重要的炎癥激活信號，可誘導(dǎo)角質(zhì)形成細胞、心肌細胞、腸上皮細胞和星形膠質(zhì)細胞中NLRP3炎癥小體依賴性焦亡［23］；而NF-κB表達升高同樣能增加NLRP3炎癥小體的組裝和Caspase-1的自切或激活，進而介導(dǎo)IL-1β的活化，導(dǎo)致細胞發(fā)生焦亡［24］。本研究結(jié)果顯示，與DCM組相比，DCM+AR組小鼠心肌組織炎癥小體形成關(guān)鍵蛋白NLRP3、ASC表達及焦亡信號關(guān)鍵蛋白IL-1β、IL-18、cleaved Caspase-1表達均下降；這表明AR可進一步抑制心肌細胞發(fā)生焦亡反應(yīng)，從而減少心肌細胞缺失，最終減輕DCM心肌損傷。

為了探究AR發(fā)揮上述保護作用的潛在分子機制，我們檢索到SIRT1對炎癥小體具有抑制作用，而作為細胞焦亡最重要的啟動因子，炎癥小體的減少必定會影響細胞焦亡的發(fā)生［25-26］。SIRT1是依賴NAD+的組蛋白去乙酰化酶，不僅可以去乙?；M蛋白，還可以去乙?；芏嘀匾霓D(zhuǎn)錄因子和調(diào)節(jié)蛋白，這種效應(yīng)導(dǎo)致細胞內(nèi)蛋白質(zhì)活性的改變，從而調(diào)控多種生物學(xué)過程。在心肌缺血再灌注損傷中，SIRT1上調(diào)能夠顯著抑制NLRP3、Caspase-1、IL-18等炎癥小體相關(guān)蛋白和促焦亡蛋白的表達［27］。此外，miR-138-5p可通過調(diào)控SIRT1而抑制細胞焦亡，從而減緩心肌梗死的進展［28］。然而SIRT1是否同樣可以介導(dǎo)AR在DCM模型中抑制細胞焦亡的作用仍待進一步驗證。本研究結(jié)果顯示，與Con組相比，DCM組小鼠心肌組織SIRT1蛋白表達及活性均下降，心肌細胞焦亡加重；而給予AR處理后，DCM+AR組小鼠心肌組織SIRT1蛋白表達及活性均增加，心肌細胞焦亡減輕；進一步給予SIRT1特異性抑制劑EX527發(fā)現(xiàn)，阻斷SIRT1信號不僅明顯逆轉(zhuǎn)了AR對心肌細胞焦亡的抑制作用，同時也逆轉(zhuǎn)了AR的上述抗糖尿病心肌損傷效果。以上結(jié)果表明，SIRT1信號是AR減輕DCM心肌損傷作用中的關(guān)鍵分子靶點。

綜上所述，AR可通過減輕心肌組織氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)，進而抑制炎癥小體形成和心肌細胞焦亡，最終減輕DCM小鼠的心肌損傷，其機制可能與激活SIRT1信號通路有關(guān)，為臨床防治DCM心肌損傷提供了一個新的思路。