陳靜，田偉平，韋小白

上海市靜安區(qū)中心醫(yī)院腫瘤科，上海 200040

肺癌是全球腫瘤相關(guān)死亡的主要原因，由于其臨床癥狀不明顯，75%的患者確診時已處于中晚期，喪失了手術(shù)治療最佳時機(jī)［1］。在過去的30年里，由于肺癌的高復(fù)發(fā)率及高侵襲性，導(dǎo)致患者的5年生存率仍只有18%［2］。隨著近年來中醫(yī)藥研發(fā)工程的興起，臨床研究者逐漸將重點(diǎn)放在中藥方面。研究表明，中藥可減輕化學(xué)藥物的毒性，增強(qiáng)放化療敏感性，減少腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移［3］。黃芪總皂苷具有抗癌、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用，而含有黃芪藥物的一些中藥復(fù)方在改善腫瘤患者的生活質(zhì)量、減輕化療藥物的血液學(xué)毒性及肝功能損害等方面均具有重要作用［4］。炎癥是腫瘤發(fā)生的原因之一，巨噬細(xì)胞極化是進(jìn)入炎癥微環(huán)境的切入點(diǎn)，黃芪總皂苷可通過阻斷肺癌相關(guān)巨噬細(xì)胞的M2極化，從而抑制肺癌細(xì)胞生長、侵襲、遷移和血管生成能力［5］。除了誘導(dǎo)免疫細(xì)胞極化，黃芪總皂苷是否還可以通過其他途徑發(fā)揮作用，目前仍不是十分清楚。2021年10月—2022年10月，本研究觀察了黃芪總皂苷對肺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力的影響，并探究其相關(guān)分子機(jī)制是否與缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）/血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）信號通路有關(guān)，為黃芪總皂苷在肺癌治療中的應(yīng)用提供依據(jù)。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞：人肺腺癌細(xì)胞株A549購自上海酶研生物科技有限公司。藥物：黃芪總皂苷購自上海一飛生物科技有限公司，純度99.1%。主要試劑：RPMI1640培養(yǎng)基和胰蛋白酶均購自美國Gibco公司，DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，CCK-8試劑購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，表皮生長因子受體（EGFR）、VEGF抗體均購自英國Abcam公司，HIF-1α抗體購自美國CST公司，辣根過氧酶標(biāo)記的二抗購自北京中杉金橋科技有限公司。

1.2 細(xì)胞分組處理 將肺腺癌A549細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶80%時用胰蛋白酶消化、計(jì)數(shù)、傳代。將肺腺癌A549細(xì)胞分為黃芪總皂苷高、中、低劑量組和對照組，分別加入濃度為200、100、50 μmol/L的黃芪總皂苷和等體積的二甲基亞砜（DMSO）。

1.3 細(xì)胞增殖能力觀察 采用CCK-8法。取對數(shù)生長期的肺腺癌A549細(xì)胞，以1×105/mL接種于96孔板，設(shè)3個復(fù)孔，參照“1.2”進(jìn)行分組處理。各組培養(yǎng)24 h，每孔加入CCK-8溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。使用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率（%）=（A對照孔-A實(shí)驗(yàn)）/A對照孔×100%。

1.4 細(xì)胞遷移能力觀察 采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。使用馬克筆在6孔板的背面均勻作一平行直線，每孔5條。每孔加入各組分組處理后培養(yǎng)24 h的細(xì)胞懸液2 mL（包含約5×105個細(xì)胞），待細(xì)胞鋪滿孔底后，用槍頭作一垂直于馬克筆橫線的劃痕，PBS漂洗后加入細(xì)胞培養(yǎng)基，顯微鏡下拍照，記為0 h劃痕寬度。將培養(yǎng)板置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，顯微鏡下拍照，記為24 h劃痕寬度。計(jì)算各組細(xì)胞遷移距離，細(xì)胞遷移距離=0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度。

1.5 細(xì)胞凋亡能力觀察 采用流式細(xì)胞術(shù)。取各組分組處理后培養(yǎng)24 h的細(xì)胞，用不含EDTA的0.25%胰酶消化，1 200 r/min離心5 min，去上清，加PBS重懸。用PBS將細(xì)胞沖洗2次，1 200 r/min離心5 min，去上清。上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，嚴(yán)格參照AnnexinV-APC/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.6 細(xì)胞HIF-1α、VEGF及EGFR蛋白檢測 采用Western blotting法。取各組分組處理后培養(yǎng)96 h的細(xì)胞，PBS沖洗后加入細(xì)胞裂解液，冰浴20 min，12 000 r /min離心15 min，取上清液，采用Bradford法測定蛋白含量。100 ℃變性10 min，每孔加等量蛋白樣品進(jìn)行12% SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%牛奶室溫封閉1 h。分別加入HIF-1α、VEGF、EGFR及內(nèi)參GAPDH一抗（稀釋比例分別為1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000及1∶10 000），4 ℃孵育過夜。TBST漂洗5 min×3次，加入二抗（稀釋比例為1∶1 000），室溫孵育1 h，TBST洗滌10 min×3次。ECL室溫反應(yīng)5 min后曝光，Syngene凝膠成像儀掃描。采用GeneSnap光密度軟件分析條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用K-S正態(tài)性檢驗(yàn)，呈正態(tài)分布時以表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，重復(fù)測量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量的方差分析；非正態(tài)分布時以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞遷移距離及細(xì)胞凋亡率比較 黃芪總皂苷高、中、低劑量組和對照組細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞凋亡率依次降低，細(xì)胞遷移距離依次升高，組間兩兩比較P均＜0.05。見表1及OSID碼圖1。

圖1 各組細(xì)胞VEGF、HIF-1α、EGFR蛋白表達(dá)條帶圖（Westen blotting法）

表1 各組細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞遷移距離及細(xì)胞凋亡率比較（）

表1 各組細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞遷移距離及細(xì)胞凋亡率比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與黃芪總皂苷低劑量組比較，#P＜0.05；與黃芪總皂苷中劑量組比較，△P＜0.05。

組別黃芪總皂苷高劑量組黃芪總皂苷中劑量組黃芪總皂苷低劑量組對照組細(xì)胞凋亡率（%）39.62 ± 2.23*#△28.12 ± 0.74*#11.05 ± 0.12*4.02 ± 0.13細(xì)胞增殖抑制率（%）68.74 ± 3.18*#△49.16 ± 4.43*#26.32 ± 5.94*9.34 ± 5.38細(xì)胞遷移距離（μm）0.298 ± 0.015*#△0.461 ± 0.027*#0.618 ± 0.034*0.773 ± 0.042

2.2 各組細(xì)胞HIF-1α、VEGF及EGFR蛋白相對表達(dá)量比較 黃芪總皂苷高、中、低劑量組和對照組細(xì)胞HIF-1α、VEGF及EGFR蛋白相對表達(dá)量均依次升高，組間兩兩比較P均＜0.05。見表2及圖1。

表2 各組細(xì)胞HIF-1α、VEGF及EGFR蛋白相對表達(dá)量比較（）

表2 各組細(xì)胞HIF-1α、VEGF及EGFR蛋白相對表達(dá)量比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與黃芪總皂苷低劑量組比較，#P＜0.05；與黃芪總皂苷中劑量組比較，△P＜0.05。

EGFR 0.48 ± 0.42*#△0.64 ± 0.59*#0.72 ± 0.31*0.83 ± 0.23組別黃芪總皂苷高劑量組黃芪總皂苷中劑量組黃芪總皂苷低劑量組對照組HIF-1α 0.19 ± 0.85*#△0.27 ± 0.08*#0.37 ± 0.18*0.46 ± 0.34 VEGF 0.23 ± 0.19*#△0.39 ± 0.34*#0.51 ± 0.24*0.61 ± 0.12

3 討論

黃芪總皂苷是從中草藥黃芪中純化而來，其性質(zhì)甘甜溫和，參與肺和脾的經(jīng)絡(luò)調(diào)節(jié)，具有調(diào)理脾胃、補(bǔ)血益氣、防治風(fēng)寒等功效，對增強(qiáng)人體免疫功能具有顯著療效。同時，黃芪總皂苷也可通過調(diào)節(jié)各種免疫信號傳導(dǎo)通路蛋白和因子，參與抗炎和保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞活性等過程［6-7］。研究顯示，黃芪總皂苷可通過調(diào)節(jié)mTOR信號通路的傳導(dǎo)，抑制相關(guān)編碼基因表達(dá)，進(jìn)而降低腫瘤細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)，抑制腫瘤組織新生血管生成和腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［8］。本研究結(jié)果顯示，黃芪總皂苷對肺腺癌A549細(xì)胞增殖具有明顯抑制作用，隨著黃芪總皂苷藥物濃度的升高，其增殖抑制作用和促凋亡能力增強(qiáng)；經(jīng)過不同濃度黃芪總皂苷處理過的肺癌細(xì)胞遷移能力降低，隨著黃芪總皂苷藥物濃度的升高，其遷移能力逐漸降低；這提示黃芪總皂苷可降低肺腺癌細(xì)胞的增殖、遷移能力，并誘導(dǎo)其凋亡，且濃度越高效果越明顯。這與既往研究證實(shí)黃芪總皂苷能夠抑制人乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲能力［9］的結(jié)論一致。

轉(zhuǎn)移是腫瘤相關(guān)死亡的主要原因，而新生血管生成是腫瘤轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制之一。血管是介導(dǎo)遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的重要結(jié)構(gòu)，參與加速腫瘤生長、維持腫瘤微環(huán)境、提供生長和侵襲信號、促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移等多種過程，并可引起腫瘤相關(guān)的全身性疾?。?0］。HIF-1α是細(xì)胞缺氧時形成的缺氧誘導(dǎo)因子，在腫瘤血管新生過程中處于重要地位，當(dāng)細(xì)胞外環(huán)境出現(xiàn)缺氧或細(xì)胞代謝率過高導(dǎo)致相對缺氧時，可以激活組織及細(xì)胞大量表達(dá)HIF-1α［11］。HIF-1α的活性水平與腫瘤發(fā)生、血管生成和轉(zhuǎn)移相關(guān)。同時，HIF-1α位于多種致癌和抑癌途徑的交匯點(diǎn)，包括PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路，而這些信號通路是分子信號網(wǎng)絡(luò)的核心，控制著許多細(xì)胞的生長、增殖、分化和生存，而腫瘤組織常高表達(dá)HIF-1α［12-13］。VEGF是一類結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的蛋白分子，其靶基因VEGF-A在轉(zhuǎn)錄水平上主要受HIF-1α的調(diào)控，可通過促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖而促進(jìn)腫瘤血管生成［14］。EGFR信號蛋白作為HIF-1α/VEGF信號通路的上游調(diào)控因子，參與了腫瘤血管生成。研究表明，在EGFR突變的非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）細(xì)胞中，可以以缺氧獨(dú)立的方式上調(diào)HIF-1α，從而誘導(dǎo)VEGF表達(dá)，而當(dāng)EGFR信號通路被抑制時VEGF下調(diào)，這提示EGFR的激活可能驅(qū)動VEGF表達(dá)［15］。HIF-1α/VEGF是腫瘤血管生成的重要信號通路，EGFR信號蛋白參與了該信號通路的傳導(dǎo)及調(diào)節(jié)。本研究結(jié)果顯示，黃芪總皂苷干預(yù)后肺腺癌A549細(xì)胞HIF-1α、VEGF和EGFR蛋白表達(dá)均降低，提示黃芪總皂苷對肺腺癌A549細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用可能是通過使HIF-1α/VEGF信號通路失活來實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，黃芪總皂苷可降低肺腺癌細(xì)胞的增殖、遷移能力，并誘導(dǎo)其凋亡，其機(jī)制可能與抑制HIF-1α/VEGF信號通路有關(guān)。至于黃芪總皂苷調(diào)控腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的過程中是否有其他作用機(jī)制尚未可知，需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。