焦玉潔，高智星，張曉誼

烏魯木齊市中醫(yī)醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，烏魯木齊 830000

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）是目前老年患者中較為常見(jiàn)的慢性疾病，通過(guò)針對(duì)性制定治療方案能有效控制病情，而中西醫(yī)結(jié)合治療COPD已經(jīng)被證實(shí)能更好地控制患者病情發(fā)展，降低COPD急性發(fā)作的可能［1-2］。中醫(yī)認(rèn)為，陽(yáng)虛痰瘀是COPD的病機(jī)，發(fā)病根本在于脾陽(yáng)、肺陽(yáng)兩虛，二者互為影響，而補(bǔ)肺湯是治療肺脾兩虛證的經(jīng)典方劑。國(guó)內(nèi)已經(jīng)有研究顯示，補(bǔ)肺湯對(duì)于COPD具有較好的輔助治療效果［3-4］。但目前關(guān)于補(bǔ)肺湯治療COPD的有效成分及具體作用機(jī)制鮮見(jiàn)報(bào)道。2022年11月—2023年1月，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析補(bǔ)肺湯治療COPD的有效成分及作用靶點(diǎn)，為探討其具體的作用機(jī)制提供依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 補(bǔ)肺湯的有效成分及作用靶點(diǎn)篩選 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）以及中國(guó)天然產(chǎn)物化學(xué)成分庫(kù)中，以補(bǔ)肺湯的組成中藥“人參、黃芪、熟地黃、五味子、紫菀、桑白皮”為關(guān)鍵詞，通過(guò)關(guān)鍵詞檢索法對(duì)有效成分進(jìn)行初步篩選。同時(shí)基于TCMSP，在全網(wǎng)數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)補(bǔ)肺湯作用靶點(diǎn)的相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行分析?；赨niprot數(shù)據(jù)庫(kù)，將藥物有效成分經(jīng)過(guò)口服利用度和類(lèi)藥性轉(zhuǎn)化后的對(duì)應(yīng)作用靶點(diǎn)與TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)搜索的補(bǔ)肺湯作用靶點(diǎn)合并以后刪除重復(fù)值，得到有效成分作用靶點(diǎn)。

1.2 補(bǔ)肺湯治療COPD的潛在基因篩選 在Gene Expression Omnibus（GEO）、Drugbank及Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選COPD相關(guān)表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)集，時(shí)間截點(diǎn)為2022年5月，篩選條件為“Chronic obstructive pulmonary disease”，物種選擇“human”。利用R語(yǔ)言將GEO數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)COPD患者與健康人的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)的表達(dá)強(qiáng)度歸一化。利用R語(yǔ)言limma包篩選出COPD相關(guān)靶點(diǎn)，篩選條件：Log Fold Change＞2且P＜0.05。將COPD相關(guān)靶點(diǎn)與“1.1”得到的有效成分作用靶點(diǎn)取交集，得到補(bǔ)肺湯治療COPD的潛在基因。

1.3 補(bǔ)肺湯治療COPD的主要活性成分篩選 采用拓?fù)浞治龇?，篩選補(bǔ)肺湯治療COPD的主要活性成分，基于Cytoscape 3.6. 0（http： //www. cytoscape.org/）軟件，建立補(bǔ)肺湯治療COPD的藥物、有效成分及靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)相關(guān)圖，即疾病—藥物—主要活性成分—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 補(bǔ)肺湯治療COPD潛在基因的功能及相關(guān)信號(hào)通路分析 ①GO功能分析：對(duì)“1.2”中得到的補(bǔ)肺湯治療COPD的潛在基因進(jìn)行GO功能富集分析，從生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分以及分子功能三個(gè)層面分析其功能，取P＜0.05且P值最小排序的前10個(gè)結(jié)果。②KEGG信號(hào)通路分析：將“1.2”中得到的補(bǔ)肺湯治療COPD的潛在基因輸入DAVID 6.8在線(xiàn)分析網(wǎng)站，而后對(duì)其進(jìn)行KEGG信號(hào)通路分析，分析結(jié)果輸入R語(yǔ)言中，采用ggplot2包篩選出P＜0.05且相關(guān)性較高的信號(hào)通路。

1.5 作用靶點(diǎn)篩選 將補(bǔ)肺湯作用靶點(diǎn)以及COPD相關(guān)靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）圖，剔除無(wú)相互作用的孤立蛋白，篩選標(biāo)準(zhǔn)：蛋白間相互作用得分＞0.4，篩選作用靶點(diǎn)。構(gòu)建最終的PPI圖，并進(jìn)行可視化處理，建立最終能反映補(bǔ)肺湯治療COPD的PPI圖。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)肺湯的有效成分及作用靶點(diǎn)篩選結(jié)果 補(bǔ)肺湯的有效成分初步篩選出738種，其中人參210種、黃芪185種、熟地75種、五味子97種、紫菀63種、桑白皮108種；經(jīng)過(guò)口服利用度和類(lèi)藥性篩選后獲得人參的有效成分40種、黃芪27種、熟地9種、五味子19種、紫菀22種、桑白皮36種；其中，槲皮素、黃芪異黃烷苷、山奈酚、異鼠李素、刺芒柄花素、β-谷甾醇、谷甾醇、原阿片堿、3，9 -二甲氧基紫檀烷、7-甲基醚—青榆烯C為重要性排名前10位的有效成分，見(jiàn)表1。篩選得到有效成分的作用靶點(diǎn)141個(gè)。

表1 補(bǔ)肺湯重要性排名前10位的有效成分

2.2 補(bǔ)肺湯治療COPD的潛在基因篩選結(jié)果 在GEO、Drugbank及Genecards檢索后共收集到1 730個(gè)COPD相關(guān)靶點(diǎn)，與2.1篩選得到的141個(gè)有效成分作用靶點(diǎn)取交集，共得到補(bǔ)肺湯治療COPD的潛在基因80個(gè)。韋恩圖見(jiàn)OSID碼圖1。

2.3 補(bǔ)肺湯治療COPD的主要活性成分篩選結(jié)果 槲皮素、黃芪異黃烷苷及山奈酚等成分可能是補(bǔ)肺湯治療COPD的主要活性成分。疾病—藥物—主要活性成分—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖見(jiàn)OSID碼圖2。

2.4 補(bǔ)肺湯治療COPD潛在基因的GO功能分析結(jié)果 從生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分以及分子功能三個(gè)層面，共計(jì)篩選出30個(gè)排名靠前的差異顯著富集條目，主要涉及炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、氧化還原等。見(jiàn)OSID碼圖3。

2.5 補(bǔ)肺湯治療COPD潛在基因的KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果 共富集得到20條差異顯著的信號(hào)通路（P均＜0.05），其中排名前10位的分別是細(xì)胞衰老途徑、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路、細(xì)胞周期循環(huán)途徑、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡途徑、Th17細(xì)胞分化途徑、FoxO信號(hào)通路、PI3K/AKT信號(hào)通路、Rap1信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路。見(jiàn)OSID碼圖4。

2.6 補(bǔ)肺湯治療COPD的作用靶點(diǎn)篩選結(jié)果 篩選后作用靶點(diǎn)包括絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、熱休克蛋白90α家族A類(lèi)成員1（HSP90AA1）、禽肉瘤病毒17的轉(zhuǎn)化基因（JUN）、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、腫瘤壞死因子（TNF）、cAMP依賴(lài)性蛋白激酶α催化亞基（PRKACA）、腫瘤蛋白53（TP53）、雌激素受體1（ESR1）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK14）、絲裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）。PPI圖見(jiàn)OSID碼圖5。

3 討論

COPD屬于中醫(yī)“喘癥”“肺脹”范疇，對(duì)于其穩(wěn)定期患者常見(jiàn)證型是肺腎兩虛證，其臨床表現(xiàn)為氣喘憋氣、動(dòng)則加重、氣不得續(xù)、腰膝酸軟、咳嗽咳痰。臨床上多選用補(bǔ)肺湯主治肺腎兩虛證COPD，該方出自《永類(lèi)靈方》，主要功效是補(bǔ)肺益氣、納腎平喘、止咳化痰。方中人參為君藥，可益氣、補(bǔ)五臟之氣；黃芪歸脾經(jīng)，補(bǔ)氣健脾生氣；熟地歸腎經(jīng)，可補(bǔ)腎氣；五味子歸肝經(jīng)，可酸溫?cái)扛?、疏肝氣；紫菀歸肺經(jīng)，為肺經(jīng)引經(jīng)藥物，可斂肺止咳；桑白皮歸肺經(jīng)，瀉肺平喘，利水消腫。六味藥物協(xié)同，可達(dá)到補(bǔ)肺納腎、益氣止咳平喘之功，有助于提升COPD患者的肺功能，改善臨床癥狀，提高生活質(zhì)量。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是從系統(tǒng)水平角度出發(fā)，基于網(wǎng)絡(luò)觀點(diǎn)分析藥物種類(lèi)、具體化學(xué)成分、作用靶點(diǎn)之間關(guān)系的研究策略，該方法與中醫(yī)的整體觀點(diǎn)類(lèi)似［5-6］。目前國(guó)內(nèi)外有大量研究使用該方法對(duì)單味藥物及藥方進(jìn)行研究，有助于深入地了解中藥治療疾病的具體作用機(jī)制［7-8］。研究顯示，補(bǔ)肺湯能降低氣道炎癥反應(yīng)，減少局部氣道痰液分泌，提升免疫功能，增強(qiáng)抵抗力，對(duì)于COPD具有一定的輔助治療作用［9］。但目前關(guān)于補(bǔ)肺湯治療COPD的有效成分及作用靶點(diǎn)尚未可知。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，從補(bǔ)肺湯的6味中藥中獲取了141個(gè)有效成分，在建立拓?fù)浞治鼍W(wǎng)絡(luò)后發(fā)現(xiàn)，槲皮素、黃芪異黃烷苷及山奈酚等成分可能是本方發(fā)揮作用的主要活性成分，其中槲皮素、黃芪異黃烷苷、山奈酚、異鼠李素、刺芒柄花素均是類(lèi)黃酮化合物。研究顯示，黃酮類(lèi)化合物可以通過(guò)降低NF-κB通路中κB蛋白、IκB激酶及MAPK通路中ERK、p38蛋白表達(dá)，從而抑制上述通路參與的腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-1及IL-6等炎癥因子激活，最終減輕COPD氣道重塑，避免病情進(jìn)展［10-11］。本研究發(fā)現(xiàn)，人參的重要成分原阿片堿也是對(duì)COPD作用較顯著的成分之一，但目前臨床上對(duì)于阿片類(lèi)藥物應(yīng)用于COPD的治療尚存在一定爭(zhēng)議，故需要進(jìn)一步研究予以證實(shí)［12］。β-谷甾醇及豆甾醇均屬于醇類(lèi)化合物，可通過(guò)抑制黃酸誘導(dǎo)基因Ⅰ（RIG-Ⅰ）激活，減少STAT信號(hào)表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致干擾素刺激基因因子3（ISGF3）復(fù)合物的轉(zhuǎn)錄活性降低，最終使得干擾素致敏細(xì)胞促炎癥放大作用減弱，發(fā)揮降低COPD氣道局部炎癥的作用［13-14］。

從本研究GO功能富集分析結(jié)果可以推測(cè)，補(bǔ)肺湯治療COPD并非單一途徑或單一作用點(diǎn)，而其中主要途徑還是控制炎癥反應(yīng)。本研究KEGG分析結(jié)果顯示，細(xì)胞衰老是導(dǎo)致慢性肺部疾病發(fā)生的主要病因。BARNES等［15］研究顯示，COPD等慢性肺部疾病可以激活p53和p16INK4a，從而激活p21CIP1，并導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯，是導(dǎo)致細(xì)胞衰老的主要原因。氧化應(yīng)激反應(yīng)也是引發(fā)細(xì)胞衰老的關(guān)鍵因素，會(huì)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)進(jìn)一步加劇，而補(bǔ)肺湯中的人參及半夏均被證實(shí)對(duì)于抑制細(xì)胞衰老、改善細(xì)胞周期具有一定作用［16-17］。研究顯示，NF-κB和FoxO在COPD患者血清中高表達(dá)，而NF-κB可以促進(jìn)FoxO激活，從而導(dǎo)致肺支氣管壁中的微結(jié)構(gòu)發(fā)生自噬，引起氣管壁細(xì)胞凋亡［18］。補(bǔ)肺湯中的主要成分對(duì)于NF-κB通路具有抑制作用，因此對(duì)于FoxO表達(dá)也有一定的抑制作用。Rap1/Ras/PI3K/AKT通路是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的主要途徑，還能促進(jìn)IL、TNF、干擾素等炎癥因子生成，同時(shí)上述傳導(dǎo)通路相互影響，從而構(gòu)建起炎癥反應(yīng)關(guān)系網(wǎng)，進(jìn)一步促進(jìn)局部炎癥反應(yīng)增加，最終導(dǎo)致COPD的病程進(jìn)展［19-20］。Th17/Treg平衡是影響體內(nèi)炎癥反應(yīng)的重要因素，而Th17細(xì)胞分化是導(dǎo)致Th17/Treg平衡改變的主要因素之一。研究顯示，補(bǔ)肺湯中人參的主要成分人參皂甙對(duì)于Th17/Treg平衡具有重要影響［21］。本研究結(jié)果顯示，Th17細(xì)胞分化是補(bǔ)肺湯影響COPD的途徑之一，但具體作用機(jī)制尚未可知，可以作為今后的研究重點(diǎn)。

在本研究最終建立的PPI圖中，補(bǔ)肺湯的作用靶點(diǎn)包括MAPK1、HSP90AA1、JUN、EGFR、TNF、PRKACA、TP53、ESR1、MAPK14、MAPK8。正如之前所述，補(bǔ)肺湯中的類(lèi)黃酮物質(zhì)及β-谷甾醇等對(duì)MAPK表達(dá)具有抑制作用，PPI圖顯示MAPK1、MAPK8、MAPK14正是補(bǔ)肺湯的作用靶點(diǎn)。TNF是介導(dǎo)體內(nèi)炎癥反應(yīng)的重要基因，其中TNF-α是導(dǎo)致IL釋放并促使局部炎癥反應(yīng)加重的重要原因。研究顯示，補(bǔ)肺湯能降低COPD患者血清TNF-α水平，說(shuō)明TNF可能是補(bǔ)肺湯的主要作用靶點(diǎn)［22］。HSP90AA1是熱休克蛋白家族成員之一，其在COPD患者體內(nèi)表達(dá)發(fā)生改變，還能影響單核細(xì)胞內(nèi)TNF的釋放，從而影響局部炎癥反應(yīng)［23］。PRKACA、JUN、EGFR、TP53、ESR1是參與影響細(xì)胞增殖過(guò)程的重要基因。研究顯示，在COPD的病理改變過(guò)程中，成纖維細(xì)胞增殖是氣道重塑的重要原因［24］。本研究結(jié)果顯示，補(bǔ)肺湯可能通過(guò)抑制PRKACA、JUN、EGFR、TP53、ESR1表達(dá)，來(lái)阻止成纖維細(xì)胞增殖，從而達(dá)到抑制氣道重塑的作用，但其具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步明確。

綜上所述，補(bǔ)肺湯治療COPD的有效成分是槲皮素、山奈酚等，可能通過(guò)MAPK1、HSP90AA1、JUN等作用靶點(diǎn)調(diào)控細(xì)胞衰老途徑、MAPK信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡途徑等而發(fā)揮作用。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)補(bǔ)肺湯作用于COPD的具體機(jī)制進(jìn)行了較為詳盡的分析，利用有效成分、基因及作用途徑等客觀數(shù)據(jù)對(duì)補(bǔ)肺湯的作用機(jī)制進(jìn)行了闡述，為開(kāi)展實(shí)驗(yàn)室研究提供了有效的參考，便于今后臨床進(jìn)一步對(duì)補(bǔ)肺湯開(kāi)展動(dòng)物或人體實(shí)驗(yàn)。