俞軍，胡陽生

1 安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，合肥 230012；2 安徽省公共衛(wèi)生臨床中心

新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）是指新型冠狀病毒感染導(dǎo)致的肺炎，主要通過呼吸道黏膜形式傳播，可以導(dǎo)致發(fā)熱、呼吸困難、疼痛等癥狀［1］。目前，新型冠狀病毒已經(jīng)在全球范圍內(nèi)傳播且發(fā)展迅速，為做好COVID-19診療工作，中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會制定了《新型冠狀病毒感染診療方案》并更新至試行第十版，并提出針對不同病情嚴(yán)重程度的COVID-19患者給予中醫(yī)藥治療［2］。丹皮為毛茛科植物牡丹的干燥根皮，是安徽銅陵等地區(qū)產(chǎn)出的著名道地藥材，也是《新型冠狀病毒感染診療方案（試行第十版）》中藥方劑中的重要組成藥材，其作用為解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎，劑型包括片劑、注射劑、軟膏劑等，長期應(yīng)用無明顯不良反應(yīng)［3-5］。2023年1月—4月，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探索丹皮的有效成分、核心靶點及作用機(jī)制，聯(lián)合分子對接技術(shù)對COVID-19的藥物靶點3CL蛋白酶和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（ACE2）進(jìn)行探究，為COVID-19的臨床用藥和以丹皮有效成分為先導(dǎo)化合物的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 丹皮有效成分及作用靶點篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（TCMSP，https：//tcmsp-e.com/index.php）檢索關(guān)鍵詞“丹皮”，以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18為篩選條件［6］，獲取丹皮的有效成分及其相關(guān)作用靶點信息，應(yīng)用Uniprot數(shù)據(jù)庫對靶點名稱進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化及縮寫。

1.2 COVID-19相關(guān)靶點篩選 通過GeneCards?（https：//www.genecards.org/）和OMIM?（https：//omim.org/）數(shù)據(jù)庫，檢索關(guān)鍵詞“COVID-19”，獲得疾病相關(guān)靶點。

1.3 丹皮治療COVID-19的潛在靶點篩選 將“1.1”獲取的丹皮有效成分作用靶點和“1.2”獲取的COVID-19相關(guān)靶點繪制Venn圖，獲得丹皮治療COVID-19的潛在靶點。

1.4 丹皮治療COVID-19的核心靶點篩選 將“1.3”得到的丹皮治療COVID-19的潛在靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫（https：//cn.string-db.org/），選擇“Multiple protein”和“Homo sapiens”，獲取靶點蛋白在生物系統(tǒng)中的相互作用關(guān)系，繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）圖。運用R語言對PPI結(jié)果進(jìn)行計數(shù)，獲得核心蛋白的相關(guān)信息。

1.5 丹皮治療COVID-19的主要活性成分篩選采用Cytoscape（v.3.7.1）軟件繪制COVID-19-丹皮—有效成分—靶點網(wǎng)絡(luò)圖。該網(wǎng)絡(luò)圖表示COVID-19與丹皮及其有效成分和作用靶點之間的相互作用，圖中同種顏色圖形大小代表degree值的大小，其值越大表明丹皮對于COVID-19的治療越重要，篩選丹皮治療COVID-19的主要活性成分。

1.6 丹皮治療COVID-19潛在靶點的相關(guān)功能及通路富集分析 通過R語言及“RSQLite”“BiocManager”“Colorspace”“Stringi”“DOSE”“ClusterProfiler”“Pathview”等軟件包，將丹皮治療COVID-19的潛在靶點名稱轉(zhuǎn)換為基因ID，分別進(jìn)行GO功能富集分析（主要進(jìn)行分子功能富集分析）和KEGG通路富集分析，繪制富集分析圖，并展示排名前15位的富集分析結(jié)果。

1.7 丹皮治療COVID-19的主要活性成分與COVID-19藥物治療靶點的結(jié)合能力觀察 采用分子—蛋白對接技術(shù)。通過PubChem數(shù)據(jù)庫收集COVID-19-丹皮—有效成分—靶點網(wǎng)絡(luò)圖中丹皮的主要活性成分及臨床常用于治療COVID-19的藥物奈瑪特韋（Nirmatrelvir）、瑞德西韋（Remdesivir）的3D結(jié)構(gòu)圖，PDB數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）下載COVID-19的藥物治療靶點3CL蛋白酶（PDBID：7E18）和ACE2（PDBID：7EFP）的蛋白結(jié)構(gòu)。采用Discovery Studio2019軟件進(jìn)行分子配體處理，以及蛋白去除水分子、加氫、刪除配體等處理，通過LibDock進(jìn)行分子—蛋白對接，計算結(jié)合能，結(jié)合能數(shù)值越低表示結(jié)合能力越穩(wěn)定。

2 結(jié)果

2.1 丹皮治療COVID-19的有效成分及潛在靶點篩選結(jié)果 初步獲得丹皮有效成分6個，即槲皮素、丁子香萜、谷甾醇、山奈酚、（+）-兒茶素和單體5-｛［5-（4-甲氧基苯基）-2-呋喃］亞甲基｝巴比妥酸（簡稱巴比妥酸）；初步獲得丹皮作用靶點237個，去除重復(fù)靶點后共篩選出相關(guān)靶點150個，見表1。通過GeneCards?和OMIM?數(shù)據(jù)庫獲得COVID-19相關(guān)靶點731個，除去重復(fù)靶點后共得到716個。通過Venny圖獲得丹皮治療COVID-19的潛在靶點36個，見OSID碼圖1。

表1 丹皮有效成分及靶點篩選結(jié)果

2.2 丹皮治療COVID-19的核心靶點篩選結(jié)果排名前30位的核心靶點主要包括血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體（VEGFR）、表皮生長因子受體（EGFR）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（NOS3），炎癥相關(guān)蛋白主要包括白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-1B、IL-10、IL-2，趨化因子配體2（CCL2）、CXC趨化因子配體10（CXCL10），絲裂原激活蛋白激酶8（MAPK8）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子1（STAT1）、C反應(yīng)蛋白（CRP）、CD40配體（CD40LG）、聚-ADP-核糖聚合酶1（PARP1）、前列腺素G/H合酶2（PTGS2）、纖溶酶原激活物抑制劑1（SERPINE1）、中性粒細(xì)胞胞質(zhì)溶膠因子1（NCF1）；凋亡相關(guān)蛋白如基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）、胱天蛋白酶8（CASP8）、熱休克蛋白β1（HSPB1）、芳香烴受體（AHR）、血紅素加氧酶（HMOX1），脂類代謝相關(guān)蛋白如過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）、糖原合酶激酶3β（GSK3B）、超氧化物歧化酶1（SOD1），其他還有雄激素受體（AR）、雌激素受體1（ESR1）、選擇素E（SELE）。丹皮治療COVID-19潛在靶點的PPI圖見OSID碼圖2。

2.3 丹皮治療COVID-19的主要活性成分篩選結(jié)果 丹皮治療COVID-19的主要活性成分排名先后順序為槲皮素、山奈酚、巴比妥酸和（+）-兒茶素，排名前10位的靶點分別為PPARG、PTGS2、ESR1、受體蛋白酪氨酸激酶（INSR）、AHR、SELE、細(xì)胞色素p450 3A4酶（CYP3A4）、HMOX1、STAT1和B淋巴細(xì)胞瘤2（BCL2）。COVID-19-丹皮—有效成分—靶點網(wǎng)絡(luò)圖見OSID碼圖3。

2.4 丹皮治療COVID-19潛在靶點的GO和KEGG富集分析結(jié)果 共獲得61條GO功能富集分析結(jié)果和109條KEGG通路富集分析結(jié)果，見OSID碼圖4。GO功能富集結(jié)果顯示，分子功能主要與細(xì)胞因子受體結(jié)合活性、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合活性、信號受體激活因子活性、轉(zhuǎn)錄輔助激活因子、核受體活性、生長因子受體結(jié)合、激酶調(diào)控活性、蛋白磷酸化結(jié)合等相關(guān)。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，丹皮治療COVID-19主要與脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、IL-17信號通路、缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）家族信號通路、C-型凝集素受體信號通路等相關(guān)。

2.5 丹皮治療COVID-19的主要活性成分與COVID-19藥物治療靶點的結(jié)合能力 山奈酚與COVID-19藥物治療靶點3CL蛋白酶、ACE2分子對接時均未發(fā)現(xiàn)對接位點，因此沒有結(jié)合能。與3CL蛋白酶結(jié)合穩(wěn)定的先后順序為巴比妥酸、奈瑪特韋、槲皮素和（+）-兒茶素，其結(jié)合能分別為-185.854 1、-163.508 3、-109.417 0、-69.357 3 kJ/mol，其中巴比妥酸較奈瑪特韋具有更低的結(jié)合能。與ACE2結(jié)合穩(wěn)定的先后順序為槲皮素、瑞德西韋、（+）-兒茶素和巴比妥酸，其結(jié)合能分別為-201.222 1、-168.723 3、-110.665 9、-107.239 8 kJ/mol，其中槲皮素較瑞德西韋具有更低的結(jié)合能。分子—蛋白對接圖見OSID碼圖5。

3 討論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法共獲得丹皮有效成分6個，包括槲皮素、丁子香萜、谷甾醇、山奈酚、（+）-兒茶素、巴比妥酸；通過分子對接的方法證實，相比于奈瑪特韋和瑞德西韋，槲皮素與3CL蛋白酶、ACE2具有較低的結(jié)合能，對接更穩(wěn)定，這與已有的研究結(jié)果相似［7］。槲皮素具有廣泛的抗病毒和抗炎特性，可干擾病原體發(fā)揮毒性的多個步驟，如病毒進(jìn)入、病毒復(fù)制、蛋白質(zhì)組裝等，當(dāng)與維生素C聯(lián)合用藥時，可用于COVID-19患者呼吸道感染的預(yù)防和早期治療［8］。此外，抑制IL-17及其信號通路是槲皮素作用于COVID-19的機(jī)制之一，并在臨床取得較好的治療效果［9］。相比于瑞德西韋或法比拉韋單獨用藥，當(dāng)槲皮素聯(lián)合用藥時可縮短COVID-19患者的住院時間，降低血清標(biāo)志物堿性磷酸酶、CRP、乳酸脫氫酶的水平，升高血紅蛋白水平和呼吸頻率［10］。但與其他多數(shù)中藥來源的有效成分一樣，槲皮素存在生物利用度相對較低等問題。一種磷脂遞送形式的槲皮素（槲皮素植物體?）應(yīng)用于12例健康志愿者的臨床試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，槲皮素的生物利用度被提高約20倍，且沒有明顯的不良反應(yīng)，為以槲皮素及其先導(dǎo)化合物的臨床治療藥物的開發(fā)提供了重要參考［11-12］。

MISHRA等［13］收集了75種美國FDA批準(zhǔn)的潛在抗COVID-19藥物，與3CL蛋白酶、ACE2等藥物治療靶點進(jìn)行分子對接和分子動力學(xué)模型篩選，最終顯示（+）-兒茶素對多種靶蛋白具有更好的結(jié)合力和良好的分子相互作用，可作為潛在的抗COVID-19的多靶點藥物［14］。此外，兒茶素衍生物也具有抗COVID-19的潛力。ARIF等［15］以（+）-兒茶素作為先導(dǎo)化合物，通過乙酸酯化等合成獲得3種兒茶素衍生物，與奈非那韋相比，這3種兒茶素衍生物與3CL蛋白酶均具有較穩(wěn)定的結(jié)合能。有研究進(jìn)一步對（+）-兒茶素的化學(xué)結(jié)構(gòu)引入不同基團(tuán)，如酯基、乙?；袜彵饺踊?，結(jié)果顯示均可以提高其抑制COVID-19的活性［16］。

研究發(fā)現(xiàn)，COVID-19患者肺部顯示出細(xì)胞膜破壞相關(guān)的嚴(yán)重內(nèi)皮損傷等血管特征。ACKERMANN等［17］對7例死亡的COVID-19患者肺部組織進(jìn)行基因表達(dá)檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VEGFR、HSPB1、IL-6、CXCL10、TNF超家族成員1A（TNFR1）/12A、SERPINE1、HMOX1等基因表達(dá)均升高，而上述基因均為丹皮治療COVID-19的重要靶點，可作為后續(xù)的研究基礎(chǔ)。此外，VEGFR也是COVID-19恢復(fù)期治療COVID-19合并肺纖維化的重要靶點之一［18］。一項納入6例重癥COVID-19患者的研究顯示，在患者血液和肺氣管吸入物中分離的中性粒細(xì)胞可形成炎癥小體，隨后小體激活釋放的自分泌IL-1B前饋循環(huán)可導(dǎo)致成人呼吸窘迫綜合征、細(xì)胞因子風(fēng)暴和微血管血栓的發(fā)展，并最終引起多器官衰竭［19］。COVID-19感染伴動脈粥樣硬化的特征是脂質(zhì)及其相關(guān)蛋白的滲透、沉積和氧化，內(nèi)皮損傷、激活并促進(jìn)炎癥的維持［20］。一項美國紐約多家醫(yī)院納入的5 700例COVID-19患者的隊列研究發(fā)現(xiàn)，有心血管基礎(chǔ)疾病的患者比沒有基礎(chǔ)疾病的患者病死率明顯升高［21］。槲皮素可以改善動脈粥樣硬化，減少炎癥淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的動脈浸潤［22］。（+）-兒茶素可通過降低巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞中活性氧的產(chǎn)生，降低血漿中三酰甘油的水平及促進(jìn)動脈粥樣硬化基因IL-1B、IL-6、MMPs等表達(dá)，最終發(fā)揮治療脂質(zhì)升高和動脈粥樣硬化的作用［23］。

綜上所述， 丹皮通過有效成分槲皮素、巴比妥酸、（+）-兒茶素、山奈酚作用于PPARG、PTGS2、ESR1等核心靶點對COVID-19發(fā)揮治療作用，其機(jī)制主要與脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、IL-17、TNF等通路有關(guān)。本研究探討了丹皮及其有效成分對COVID-19的作用靶點及信號通路，為以丹皮為組成成分的中藥方劑及未來以丹皮有效成分作為先導(dǎo)化合物治療COVID-19的藥物研發(fā)等提供了研究基礎(chǔ)。