李永順，謝嘉嘉，周繼紅，張立，陳樹(shù)超，歐陽(yáng)子琛

1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第七臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 深圳 518133

2. 深圳市寶安區(qū)中醫(yī)院肺病科，廣東 深圳 518133

肺癌是臨床最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在2021 年全球癌癥統(tǒng)計(jì)中，肺癌仍是死亡人數(shù)最多的癌癥，在所有惡性腫瘤死亡病例中，約1/4 是肺癌導(dǎo)致的[1]，而非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）約占所有肺癌的75%[2]。雖然目前肺癌的治療手段日益增多，包括手術(shù)切除、靶向治療、免疫治療、化療等，但治療效果仍不盡人意，5 年生存率極低[3]。

肺癌歸屬于中醫(yī)肺積范疇，現(xiàn)代醫(yī)家多認(rèn)為其病因病機(jī)與濕、毒、痰、瘀等相關(guān)[4]。桔梗為常見(jiàn)藥食兩用的藥材，味辛、苦，性平，歸肺經(jīng)，具有宣肺祛痰、利咽排膿的功效[5]，臨床多用于治療肺系疾病?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)桔梗相關(guān)成分可以有效抑制肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖并誘導(dǎo)其凋亡[6]。魚(yú)腥草味辛，微寒，歸肺經(jīng)，具有清熱解毒、消癰排膿的功效[5]，為治療肺系疾病的常用藥物之一?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，魚(yú)腥草及其活性成分對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖有抑制作用[7]，可以明顯降低苯并芘誘導(dǎo)的DNA損傷及炎癥反應(yīng)，從而預(yù)防肺癌的發(fā)生發(fā)展，并且推斷魚(yú)腥草可能是預(yù)防及治療肺癌的有效候選藥劑[8]。臨床上使用桔梗-魚(yú)腥草配伍治療NSCLC 療效頗佳[9-10]。但目前尚無(wú)關(guān)于桔梗-魚(yú)腥草治療NSCLC的機(jī)制研究。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)合GEO 數(shù)據(jù)挖掘以及分子對(duì)接技術(shù)探究桔梗-魚(yú)腥草藥對(duì)治療NSCLC 的抗腫瘤成分及作用機(jī)制，為后續(xù)的臨床應(yīng)用和藥物研究提供思路。

1 方法

1.1 搜集桔梗-魚(yú)腥草活性成分與作用靶點(diǎn)在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）http：//tcmspw.com./tcmsp.php[11]以桔梗、魚(yú)腥草為關(guān)鍵詞檢索相關(guān)化學(xué)成分，以口服利用度（OB）≥30%和類(lèi)藥性（DL）≥0.18 作為活性成分的篩選標(biāo)準(zhǔn)[12-13]，提取篩選出的活性成分及活性成分對(duì)應(yīng)的藥物作用靶點(diǎn)。最后使用Uniport 蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)http：//www.uniprot.org/[14]將藥物作用靶點(diǎn)名稱(chēng)統(tǒng)一轉(zhuǎn)換為基因名。

1.2 NSCLC 數(shù)據(jù)集的獲取及差異分析在GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nim.nih.gov/geo/）檢索NSCLC 相關(guān)數(shù)據(jù)集，以樣本量大于20，同時(shí)包含正常樣本和疾病樣本作為篩選條件，并對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行質(zhì)量控制和主成分分析，保證得到的數(shù)據(jù)集可用于差異分析。隨后使用R 軟件對(duì)篩選得到的數(shù)據(jù)集進(jìn)行歸一化處理及差異分析，以|log2FC|≥1，adj.P＜0.05 為篩選標(biāo)準(zhǔn)得到差異表達(dá)基因（DEGs）。

1.3 NSCLC 相關(guān)靶點(diǎn)和藥物-疾病共同靶點(diǎn)的獲取在GenCards 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.genecards.org/）[15]和OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.omim.org/）以“Non-Small Cell Lung Cancer”為檢索詞搜集NSCLC 已證實(shí)的靶點(diǎn)[16]，并與差異表達(dá)基因合并，得到盡可能多的疾病相關(guān)靶點(diǎn)。再利用韋恩圖工具對(duì)藥物作用靶點(diǎn)和疾病相關(guān)靶點(diǎn)取交集得到藥物-疾病共同靶點(diǎn)。

1.4 藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將桔梗-魚(yú)腥草、活性成分以及藥物-疾病共同靶點(diǎn)三者對(duì)應(yīng)信息導(dǎo)入Cytoscape3.9.0 軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，并對(duì)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵傩赃M(jìn)行分析，利用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩院Y選出“核心成分”，一般來(lái)說(shuō)度值越大的節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中重要程度越大[17]。

1.5 靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選將藥物-疾病共同靶點(diǎn)導(dǎo)入String 平臺(tái)（https：//cn.string-db.org/）進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）分析[18]，并將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape3.9.0 軟件進(jìn)行可視化和網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，通過(guò)度值大小篩選出“核心靶點(diǎn)”。

1.6 GO及KEGG富集分析將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//metascape.org/），進(jìn)行基因本體（GO）中的生物過(guò)程（BP）、細(xì)胞成分（CC）及分子功能（MF）3 類(lèi)富集分析和KEGG 通路富集分析。然后使用微生信在線工具（http：//www.bioinformatics.com.cn）對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化分析。

1.7 分子對(duì)接驗(yàn)證將PPI 網(wǎng)絡(luò)和藥物-活性成分-疾病網(wǎng)絡(luò)選取出的核心靶點(diǎn)與核心成分進(jìn)行分子對(duì)接。在PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.rcsb.org/）[19]下載核心靶點(diǎn)的3D 結(jié)構(gòu)，并通過(guò)PyMol 軟件對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理。從PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)下載核心成分的SDF 格式文件并轉(zhuǎn)化為PDB 格式。最后使用AutoDock 軟件將核心成分和核心靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行分子對(duì)接，根據(jù)結(jié)合能大小判斷結(jié)合強(qiáng)度，小于-5.0 kcal/mol 表示配體和受體有較好的結(jié)合力，小于-8.0 kcal/mol 表示有強(qiáng)烈的結(jié)合力[20]。最后使用PyMol 軟件對(duì)結(jié)合能＜-8.0 kcal/mol的結(jié)果進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 桔梗-魚(yú)腥草化學(xué)成分及作用靶點(diǎn)見(jiàn)表1。通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出藥物活性成分7 個(gè)，作用靶點(diǎn)176 個(gè)，其中桔梗活性成分4 個(gè)，魚(yú)腥草活性成分3 個(gè)，活性成分包括槲皮素、木犀草素、金合歡素、菠菜甾醇、異索馬酮、山奈酚和順式-二氫槲皮素。

表1 桔梗-魚(yú)腥草藥對(duì)活性成分

2.2 數(shù)據(jù)集差異分析見(jiàn)圖1。篩選得到GSE27262數(shù)據(jù)集，其包含25 例正常肺組織樣本和25 例NSCLC 肺組織樣本。運(yùn)用R 語(yǔ)言對(duì)GSE27262 數(shù)據(jù)集進(jìn)行質(zhì)量控制，選擇其中的RLE 箱線圖進(jìn)行展示（圖1a），結(jié)果表明：GSE27262 數(shù)據(jù)集芯片間具有較好的一致性，可以用于進(jìn)行差異基因分析。主成分分析顯示NSCLC 組和正常對(duì)照組，組內(nèi)距離較近，組間距離較遠(yuǎn)，2 組樣本間無(wú)明顯交集，有較好的可比性（圖1b）。同時(shí)為去除各樣本間批次效應(yīng)，進(jìn)行差異分析前對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行歸一化處理（圖1c 為歸一化前，圖1d 為歸一化后）。最終差異分析一共獲得1 860 個(gè)DEGs，其中744 個(gè)上調(diào)基因，1 116 個(gè)下調(diào)基因，并繪制火山圖（圖1e）和熱圖（圖1f）。

圖1 GSE27262 數(shù)據(jù)集差異分析

2.3 NSCLC 疾病相關(guān)靶點(diǎn)與藥物-疾病共同靶點(diǎn)見(jiàn)圖2。在GenCards 數(shù)據(jù)庫(kù)共收集到NSCLC 相關(guān)靶點(diǎn)5 803 個(gè)，通過(guò)“Reverance.score≥10”篩選有4 024 個(gè)。OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得656 個(gè)靶點(diǎn)。二者與差異表達(dá)基因合并，刪除重復(fù)值，共得到疾病靶點(diǎn)4 783 個(gè)，再與藥物作用靶點(diǎn)取交集得到139 個(gè)桔梗-魚(yú)腥草治療NSCLC 的潛在靶點(diǎn)。

圖2 桔梗-魚(yú)腥草與NSCLC 共同靶點(diǎn)韋恩圖

2.4 藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析見(jiàn)表2、圖3。運(yùn)用Cytoscape3.9.0 軟件構(gòu)建藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。網(wǎng)絡(luò)中度值越高則節(jié)點(diǎn)越大顏色越深。選取度值前3 的活性成分作為核心成分，分別為：槲皮素、木犀草素、山奈酚，其中槲皮素可作用于85 個(gè)靶點(diǎn)，網(wǎng)絡(luò)度最好。

表2 桔梗-魚(yú)腥草活性成分網(wǎng)絡(luò)度

2.5 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析見(jiàn)圖4。通過(guò)String 平臺(tái)構(gòu)建藥物-疾病共同靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)，利用Cytoscape 3.9.0 軟件進(jìn)行可視化和網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觥＞W(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)度值越大，其形狀越大顏色越藍(lán)，在網(wǎng)絡(luò)中的作用越重要，最為可能是桔梗-魚(yú)腥草治療NSCLC 的核心靶點(diǎn)。選取度值前5 的作為核心靶點(diǎn)，分別為：TP53、AKT1、JUN、TNF、EGFR，其中TP53 的度值最高。

圖4 桔梗-魚(yú)腥草與NSCLC 共同靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)

2.6 GO 功能富集分析見(jiàn)圖5。將桔梗-魚(yú)腥草與NSCLC 的139 個(gè)共同靶點(diǎn)使用Metascape 進(jìn)行GO 富集的BP、CC 和MF 3 種分析，共得到2 281 條相關(guān)條目，其中生物過(guò)程（BP）條目2 044 個(gè)，分子功能（MF）條目157 個(gè)，細(xì)胞組成（CC）條目80 個(gè)。根據(jù)P＜0.01，取排名前10 位的富集條目進(jìn)行展示。分析發(fā)現(xiàn)其生物過(guò)程主要包括：細(xì)胞凋亡、細(xì)胞死亡正向調(diào)控、細(xì)胞群增殖負(fù)向調(diào)控、對(duì)創(chuàng)傷的反應(yīng)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)等。分子功能主要包括：轉(zhuǎn)錄因子合成、蛋白激酶合成、蛋白同質(zhì)化活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、核受體活性、激酶調(diào)節(jié)器活性、蛋白激酶活性、絲氨酸水解酶活性等。細(xì)胞組成主要包括：膜筏、囊泡腔、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞器外膜、受體復(fù)合物、蛋白激酶復(fù)合物、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器復(fù)合體等。

圖5 GO 富集分析

2.7 KEGG 富集分析見(jiàn)表3、圖6。通過(guò)Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)藥物-疾病共同靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 分析，以P＜0.05 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)得到326 條信號(hào)通路。選取富集程度最高的10 條通路，進(jìn)行氣泡圖展示。

圖6 KEGG 信號(hào)通路富集分析

表3 藥物-疾病靶點(diǎn)KEGG 信號(hào)通路富集分析

2.8 分子對(duì)接結(jié)果見(jiàn)表4、圖7。將選取的核心成分與核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果顯示結(jié)合能均小于0。使用PyMol 軟件，選擇結(jié)合能＜-8.0 kcal/mol的結(jié)果進(jìn)行可視化。

圖7 分子對(duì)接結(jié)果圖

表4 核心成分與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接親和力kcal/mol

3 討論

本研究通過(guò)構(gòu)建藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，得到桔梗-魚(yú)腥草核心成分：槲皮素、木犀草素、山奈酚。有研究發(fā)現(xiàn)槲皮素能夠下調(diào)SRC 基因的表達(dá)，從而阻斷Fn4/NF-kappaB 信號(hào)通路，減少NSCLC 的增殖和轉(zhuǎn)移[21]。李華洋等[22]發(fā)現(xiàn)槲皮素可能通過(guò)抑制STAT3 信號(hào)通路，從而發(fā)揮抑制肺腺癌A549 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力。木犀草素能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，起到抑制NSCLC A549 細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的作用[23]；并通過(guò)調(diào)節(jié)肌鈣蛋白表達(dá)，收縮細(xì)胞骨架逆轉(zhuǎn)EMT[24]。山奈酚又稱(chēng)山奈素，具有抗癌、抗病毒、抗炎和抗氧化等多種藥理作用[25-26]。研究表明，山奈酚同樣有降低NSCLC 細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的能力，可能與調(diào)控ERRα、miR21 等機(jī)制有關(guān)[27-28]。

通過(guò)桔梗-魚(yú)腥草與NSCLC 靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)分析得知，桔梗-魚(yú)腥草治療NSCLC 的潛在核心靶點(diǎn)包括腫瘤壞死蛋白53（TP53）、蛋白激酶1（AKT1）、轉(zhuǎn)錄因子AP-1（JUN）、腫瘤壞死因子（TNF）、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）。TP53 是目前研究最為透徹的癌癥相關(guān)基因之一，以抑癌作用而聞名，具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管生成和腫瘤細(xì)胞增殖的作用[29]。發(fā)現(xiàn)約50%的癌癥患者有TP53 突變，導(dǎo)致其功能從抑癌向促癌轉(zhuǎn)變，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和遷移[30-31]。另外突變的TP53 相關(guān)基因的表達(dá)與患者預(yù)后有關(guān)，基因表達(dá)水平越高，患者預(yù)后越差[32]。AKT 又稱(chēng)蛋白激酶B，是PI3K-AKT 通路的下游靶蛋白，參與調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝和凋亡，對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖以及遷移至關(guān)重要[33]。約一半以上的NSCLC 患者存在激活狀態(tài)AKT 高表達(dá)，其表達(dá)程度越高，疾病預(yù)后越差[34]。AKT1 屬于AKT 激酶家族，相關(guān)研究表明AKT1 不僅能夠降低NSCLC 對(duì)化療藥物的敏感性，還能促進(jìn)EGFR 和K-RAS 突變的NSCLC 細(xì)胞的侵襲及遷移[34]。

GO 富集分析顯示，桔梗-魚(yú)腥草治療NSCLC 的生物過(guò)程主要涉及細(xì)胞凋亡、細(xì)胞死亡正向調(diào)控、細(xì)胞群增殖負(fù)向調(diào)控等；分子功能包括轉(zhuǎn)錄因子合成、蛋白激酶合成、絲氨酸水解酶活性等；細(xì)胞組成主要包括：受體復(fù)合物、蛋白激酶復(fù)合物、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器復(fù)合體等。KEGG 分析顯示，桔梗-魚(yú)腥草可能通過(guò)癌癥、MAPK 和PI3K-AKT 等信號(hào)通路發(fā)揮抗NSCLC 的作用。其中PI3K-AKT 信號(hào)通路是NSCLC最重要的調(diào)控途徑之一，其涉及癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、侵襲和遷移，能減緩癌癥細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管生成以及增加化療耐藥等[35]。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)合GEO 數(shù)據(jù)挖掘得到桔梗-魚(yú)腥草治療NSCLC 的潛在核心成分和核心靶點(diǎn)，并分析得到可能的作用途徑。表明桔梗-魚(yú)腥草治療NSCLC 是多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)機(jī)制。同時(shí)分子對(duì)接結(jié)果表明核心成分和核心靶點(diǎn)對(duì)接良好，進(jìn)一步驗(yàn)證推論的合理性。為NSCLC 的臨床治療和后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究提供一定參考。