高春燕，楊文藝，洪 玥，張?zhí)礻?，?望，李媛麗，盧躍紅*

（1 北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院 銀川 750021 2 大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 云南大理 671000）

肝臟疾病是最常見的慢性疾病，包括肝炎、肝硬化、纖維化和肝細胞癌，已成為死亡和疾病的首要原因之一[1]。許多因素，如營養(yǎng)不足、病毒感染、酒精和藥物依賴、異生物暴露和代謝性疾病，都參與了肝臟疾病的產(chǎn)生和進一步發(fā)展[2]。根據(jù)全球疾病負擔（GBD）相關(guān)數(shù)據(jù)，近年來因肝臟疾病而死亡的人數(shù)有二百多萬，約占全球總死亡人數(shù)的百分之四[3]。肝臟疾病正成為一個相當大的公共衛(wèi)生負擔。CCl4是一種常用于肝損傷模型的化學(xué)制劑，經(jīng)代謝產(chǎn)生活性氧自由基，進一步與細胞分子結(jié)合，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，從而導(dǎo)致細胞損傷、炎癥和凋亡[4]。據(jù)報道，植物酚類化合物可以改善氧化應(yīng)激和炎癥引起的肝損傷，并預(yù)防肝臟疾病的發(fā)生[5-8]。

地參（Lycopus lucidusTurcz.），系唇形科（Labiatae）地筍屬多年生草本植物，屬云南高原特色食品資源，以大理劍川沙溪鎮(zhèn)分布最為廣泛，且品質(zhì)最優(yōu)。民間傳統(tǒng)以炒食、做湯、油炸、腌漬食用為主。地參富含礦物質(zhì)、有機酸、維生素、粗脂肪、氨基酸和酚類化合物等營養(yǎng)成分[9-12]，具有降血糖[13-14]，降血脂[13]，抑制體外腫瘤細胞生長[15]，抗D-半乳糖所致小鼠衰老[16]，提高免疫功能[17]，抑制消化酶[18-19]，抗氧化[11-12，20-21]，保肝[7，22]等多方面生理功能。

植物多酚以游離和結(jié)合兩種形式存在于植物體內(nèi)，與游離酚相比，結(jié)合酚是與其它物質(zhì)結(jié)合而存在的酚類化合物。前期研究顯示[11-12，20-21]，地參結(jié)合酚含量豐富，主要含有的單體酚類化合物為咖啡酸，且具有顯著的抗氧化活性，而肝損傷通常伴隨著氧化損傷。本研究采用體外CCl4損傷肝細胞模型，通過細胞存活率和肝功能指標（ALT、AST 和LDH）評價地參結(jié)合酚的體外保肝作用。同時，檢測脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物、抗氧化指標（SOD 和GSH）、炎癥反應(yīng)因子（TNF-α、IL-6 和IL-8）、Caspase-3 活化程度、細胞凋亡及線粒體膜電位的變化，從抗氧化，抑制炎癥反應(yīng)和細胞凋亡，保護線粒體的角度揭示地參結(jié)合酚對CCl4損傷肝細胞的保護作用機制，以期為地參功能食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

地參，采于云南省劍川縣沙溪鎮(zhèn)；BRL 大鼠肝細胞，中國科學(xué)院細胞庫；Annexin V-FITC 細胞凋亡試劑盒、Caspase-3 活性測試盒、細胞MDA 測定試劑盒、總超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒、還原型谷胱甘肽（GSH）測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；TNF-α、IL-8、IL-6 檢測試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司；線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1），上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

ELx800 全自動酶標儀，美國Bio-Tek 基因有限公司；FACSCalibur 流式細胞儀，美國Becton Dickinson 公司；日立-7180 生化分析儀，日本日立公司；TCS SP8 激光共聚焦顯微鏡，德國Leica 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 地參結(jié)合酚的提取及純化 按照文獻[18]的方法提取地參結(jié)合酚并純化。具體流程：地參粉末5.0 g→80%的甲醇超聲波輔助提取3 次→抽濾→殘渣以4 mol/L NaOH 水解4 h→調(diào)pH 值至1～2→抽濾→濾液用乙酸乙酯萃取→合并乙酸乙酯相→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)→濃縮液蒸餾水并定容15 mL→加入X-5 大孔樹脂吸附24 h→抽濾→大孔樹脂以70%的乙醇解析24 h→抽濾→濾液旋蒸→濃縮液真空冷凍干燥→地參結(jié)合酚純化物。

1.2.2 細胞毒性的測定 BRL 大鼠肝細胞懸液（2.5×104/mL）→100 μL/孔接種于96 孔板（空白對照組加培養(yǎng)液）→培養(yǎng)12 h→干預(yù)組加入100 μL 0.2～1.6 mg/mL 的地參結(jié)合酚溶液（先用PBS 配制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL，再用培養(yǎng)液稀釋至各濃度），正常組和空白對照組加入100 μL 培養(yǎng)液→培養(yǎng)4 h→加入20 μL MTT 溶液（5 mg/mL）→培養(yǎng)4 h→吸走上清液→加入150 μL DMSO→避光低速振蕩15 min→測定吸光度值（490 nm）→計算細胞存活率。

1.2.3 細胞存活率的測定 按照1.2.2 節(jié)方法種板→培養(yǎng)12 h→干預(yù)組加入100 μL 0.4～1.6 mg/mL 的地參結(jié)合酚溶液，正常組、損傷組和空白對照組加入100 μL 培養(yǎng)液→培養(yǎng)4 h→干預(yù)組和損傷組加入40 μL CCl4（100 mmol/L），正常組和空白對照組加入40 μL 培養(yǎng)液→培養(yǎng)3 h→測定細胞存活率。

1.2.4 ALT、AST 和LDH 的測定 BRL 大鼠肝細胞懸液（5×104/mL）→500 μL/孔接種于24 孔板→培養(yǎng)24 h→干預(yù)組加入500 μL 0.4～1.6 mg/mL 的地參結(jié)合酚溶液，正常組、損傷組和空白對照組加入500 μL 培養(yǎng)液→培養(yǎng)4 h→干預(yù)組和損傷組加入200 μL CCl4（100 mmol/L），正常組和空白對照組加入200 μL 培養(yǎng)液→培養(yǎng)3 h→離心→收集上清→測定。

1.2.5 MDA、SOD 和GSH 的測定 根據(jù)試劑盒說明書操作，具體流程：按照1.2.4 節(jié)方法培養(yǎng)各組細胞→離心→收集上清→測定。MDA、SOD 和GSH 的測定結(jié)果分別以nmol/mL、U/mL 和μmol/L表示。

1.2.6 TNF-α、IL-6 和IL-8 的測定 根據(jù)試劑盒說明書操作，具體流程：按照1.2.4 節(jié)方法培養(yǎng)各組細胞→裂解細胞→離心→收集上清→測定。結(jié)果均表示為pg/mL。以濃度（C）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，繪制標準曲線，得TNF-α、IL-6 和IL-8 的標準曲線方程分別為A=0.0042C ＋0.0439（R=0.9912，線性范圍為0～320 pg/mL），A=0.0101C-0.0101（R=0.9995，線性范圍為0～160 pg/mL）和A=0.0069C ＋0.0014（R=0.9992，線性范圍為0～240 pg/mL）。

1.2.7 細胞凋亡的檢測 根據(jù)Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，具體流程：按照1.2.4 節(jié)方法培養(yǎng)各組細胞→收集各孔細胞培養(yǎng)液→D-PBS 洗滌細胞→胰酶消化細胞1～2 min→加入對應(yīng)各孔收集的細胞培養(yǎng)液→混勻→離心→棄上清→收集細胞→D-PBS 重懸細胞→取5×105/mL 的細胞懸液→離心→棄上清→加500 μL 結(jié)合液輕輕重懸細胞→加入5 μL Annexin V-FITC→5 μL 碘化丙啶→混勻→25 ℃暗室放置10 min→流式細胞儀檢測。

1.2.8 Caspase-3 活化程度的測定 按Caspase-3活性測試盒說明書操作，具體流程：按照1.2.4 節(jié)方法培養(yǎng)各組細胞→裂解細胞→收集培養(yǎng)液→離心→取上清液→測定。Caspase-3 活化程度以O(shè)D樣品/OD空白對照值來表示。

1.2.9 細胞膜電位的測定 根據(jù)試劑盒說明書操作，具體流程：按照1.2.4 節(jié)方法培養(yǎng)各組細胞→吸除培養(yǎng)液→PBS 洗滌細胞→加入1 mL 細胞培養(yǎng)液→加入1 mL JC-1 染色工作液→混勻→37 ℃孵育20 min→吸棄上清→JC-1 染色緩沖液洗滌2次→加入2 mL 細胞培養(yǎng)液→激光共聚焦顯微鏡拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

各試驗組分別設(shè)置5 個復(fù)孔，數(shù)據(jù)以“xˉ ±s“表示，采用SPSS 17.0 軟件ANOVA 進行差異統(tǒng)計學(xué)檢驗，采用Pearson 對各檢測指標的相關(guān)性進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 細胞毒性

地參結(jié)合酚細胞毒性測定結(jié)果見表1。在0.2～1.6 mg/mL 干預(yù)范圍，細胞存活率在90.51%～92.27%，與正常組之間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），表明在該濃度范圍，地參結(jié)合酚無細胞毒性，可以開展地參結(jié)合酚對肝細胞損傷保護作用的后續(xù)試驗。

表1 細胞毒性測定結(jié)果Table 1 Results of cytotoxicity assays

2.2 地參結(jié)合酚對CCl4 損傷肝細胞細胞存活率、ALT、AST 和LDH 的影響

地參結(jié)合酚對CCl4損傷肝細胞細胞存活率、ALT、AST 和LDH 的影響見表2。就細胞存活率而言，CCl4損傷組比正常組下降了74.48%；0.4，0.8，1.6 mg/mL 地參結(jié)合酚干預(yù)組比CCl4損傷組分別增加了1.25，1.71 倍和2.08 倍。就ALT、AST 和LDH 而言，CCl4損傷組比正常組分別增加了0.96，2.57 倍和1.13 倍；地參結(jié)合酚干預(yù)組與CCl4損傷組相比，均有不同程度的下降，且呈劑量效應(yīng)關(guān)系。當干預(yù)劑量為1.6 mg/mL 時，ALT、AST 和LDH的水平分別下降41.13%，21.57%和15.94%。

表2 地參結(jié)合酚對CCl4 損傷肝細胞細胞存活率、ALT、AST 和LDH 的影響Table 2 Effects of bound phenolics from Lycopus lucidus Turcz.on cell viability，ALT，AST and LDH in CCl4-injured hepatocytes

LDH 從細胞中的釋放是對凋亡信號的回應(yīng)，LDH 的水平是細胞凋亡的有效指標[23]。同樣，ALT和AST 是肝細胞功能受損的重要指標。ALT、AST和LDH 大量釋放，進入細胞培養(yǎng)液，表明CCl4對肝細胞的損傷造成細胞膜功能的嚴重受損，使其通透性增加。地參結(jié)合酚預(yù)處理顯著降低了ALT、AST 和LDH 的水平，表明其對體外CCl4損傷肝細胞具有顯著的保護作用。

2.3 地參結(jié)合酚對CCl4 損傷肝細胞MDA、GSH和SOD 水平的影響

地參結(jié)合酚對CCl4損傷肝細胞MDA、GSH和SOD 水平的影響見圖1。就MDA 含量而言，CCl4損傷組比正常組增加了1.61 倍；0.4，0.8，1.6 mg/mL 地參結(jié)合酚干預(yù)組比CCl4損傷組分別減少了47.76%，50.31%和52.83%。就GSH 和SOD 含量而言，CCl4損傷組比正常組分別下降了45.12%和67.18%；地參結(jié)合酚干預(yù)組與CCl4損傷組相比，均有不同程度的上升，且呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系。當干預(yù)劑量為1.6 mg/mL 時，GSH 和SOD 的水平分別增加了55.56%和172.01%。

圖1 地參結(jié)合酚對CCl4 損傷肝細胞MDA、SOD 和GSH 水平的影響Fig.1 Effects of bound phenolics from Lycopus lucidus Turcz.on the levels of MDA，SOD and GSH in CCl4-injured hepatocytes

CCl4通過自由基和過氧化作用引起肝細胞的損傷，其產(chǎn)生的反應(yīng)代謝性自由基攻擊并破壞多不飽和脂肪酸，尤其是那些與磷脂相關(guān)的脂肪酸，進而導(dǎo)致肝細胞中的脂質(zhì)過氧化[24]，可對其終產(chǎn)物MDA 的含量進行表征。SOD 通過催化ROO·與質(zhì)子結(jié)合，進一步形成過氧化氫和氧，從而促進ROO·的分解[25]。GSH 對CCl4毒性衍生物的解毒有很大貢獻，當GSH 存儲明顯耗盡時，肝細胞壞死開始[26]。CCl4損傷組MDA 含量顯著增加，GSH 和SOD 含量顯著下降，表明肝細胞脂質(zhì)過氧化程度嚴重，細胞處于氧化損傷狀態(tài)。地參結(jié)合酚抑制了CCl4損傷引起的肝細胞MDA 的增加和GSH 和SOD 的下降，表明其抑制了肝細胞的脂質(zhì)過氧化，提高了抗氧化酶的活性，從而發(fā)揮對肝細胞損傷的保護作用。

2.4 地參結(jié)合酚對CCl4 損傷肝細胞TNF-α、IL-6 和IL-8 水平的影響

地參結(jié)合酚對CCl4損傷肝細胞TNF-α、IL-6和IL-8 水平的影響見圖2。CCl4損傷組與正常組相比，TNF-α、IL-6 和IL-8 的水平分別增加了95.61%，75.87%和41.89%。地參結(jié)合酚干預(yù)組與CCl4損傷組相比，TNF-α、IL-6 和IL-8 水平均顯著下降，且呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系。當?shù)貐⒔Y(jié)合酚干預(yù)劑量為1.6 mg/mL 時，TNF-α、IL-6 和IL-8 水平分別下降了41.72%，21.49%和21.59%。

圖2 地參結(jié)合酚對CCl4 損傷肝細胞TNF-α、IL-6 和IL-8 水平的影響Fig.2 Effects of bound phenolics from Lycopus lucidus Turcz.on TNF-α，IL-6 and IL-8 levels in CCL4-injured hepatocytes

CCl4產(chǎn)生的活性氧（ROS）激活了肝細胞內(nèi)在免疫系統(tǒng)和Kupff 細胞，通過產(chǎn)生更多的ROS 和前炎癥細胞因子加劇了肝細胞的炎癥損傷[27]。腫瘤壞死因子（TNF-α）作為CCl4介導(dǎo)的肝損傷炎癥介質(zhì)，刺激細胞因子從巨噬細胞中釋放出來，并誘發(fā)吞噬細胞的氧化代謝和NO 的產(chǎn)生[28]。NO 是反應(yīng)活性更高的氧化物，它由iNOS 產(chǎn)生，通過與ROS 反應(yīng)和形成過氧亞硝基增強了氧化應(yīng)激[29]。TNF-α 還可引起許多與肝細胞損傷有關(guān)的第二介質(zhì)，如IL-1β、IL-6、IL-8 及蛋白酶等的出現(xiàn)。CCl4損傷組TNF-α、IL-6 和IL-8 水平的顯著提升，表明肝細胞發(fā)生嚴重的炎癥反應(yīng)，地參結(jié)合酚干預(yù)組TNF-α、IL-6 和IL-8 水平的顯著下降，表明地參結(jié)合酚抑制炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮對肝細胞損傷的保護作用。

2.5 地參結(jié)合酚對CCl4 損傷肝細胞凋亡的影響

地參結(jié)合酚對CCl4損傷肝細胞凋亡的影響見圖3。圖中左下象限為正常細胞，左上象限為壞死細胞，右下象限為早期凋亡細胞，右上象限為晚期凋亡細胞。CCl4損傷組（圖3b）與正常組（圖3a）相比，正常細胞顯著減少，凋亡細胞顯著增加；地參結(jié)合酚干預(yù)組（圖3c、3d 和3e）與CCl4損傷組相比，隨著干預(yù)劑量的增加，正常細胞逐漸增多，凋亡細胞逐漸減少。定量分析結(jié)果（圖4）表明，CCl4損傷組與正常組相比，正常細胞減少了38.48%，壞死細胞、早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞分別增加了22.99%，234.54%和140.39%，表明CCl4導(dǎo)致肝細胞的壞死和凋亡。地參結(jié)合酚干預(yù)組與CCl4損傷組相比，干預(yù)劑量為0.4，0.8 mg/mL和1.6 mg/mL 時，正常細胞分別增加了29.07%，41.37%和49.83%，壞死細胞分別減少了34.34%，9.66%和3.62%，早期凋亡細胞分別減少了29.87%，52.22%和56.87%，晚期凋亡細胞分別減少了25.81%，45.55%和53.06%，這表明地參結(jié)合酚在一定程度上可以降低細胞凋亡率，抑制肝細胞壞死，從而發(fā)揮對肝細胞損傷的保護作用。

圖3 地參結(jié)合酚對CCl4 損傷肝細胞凋亡的影響Fig.3 Effects of bound phenolics from Lycopus lucidus Turcz.on CC14-injured hepatocyte apoptosis

圖4 肝細胞凋亡的定量分析Fig.4 Quantitative analysis of the hepatocyte apoptosis

2.6 地參結(jié)合酚對CCl4 損傷肝細胞Caspase-3活化程度的影響

地參結(jié)合酚對CCl4損傷肝細胞Caspase-3 活化程度的影響見圖5。CCl4損傷組與正常組相比，Caspase-3 活化程度增加了44.87%。地參結(jié)合酚干預(yù)組與CCl4損傷組相比，干預(yù)劑量為0.4，0.8 mg/mL 和1.6 mg/mL 時，Caspase-3 活化程度分別減少了14.16%，15.49%和18.58%。

圖5 地參結(jié)合酚對CCl4 損傷肝細胞Caspase-3活化程度的影響Fig.5 Effects of bound phenolics from Lycopus lucidus Turcz.on the activation of Caspase-3 in CCl4-injured hepatocytes

Caspase-3，又稱為胱氨酸蛋白酶3，參與細胞凋亡的執(zhí)行，是細胞凋亡的效應(yīng)者。異源活化后的Caspase-3 酶解切割胞內(nèi)重要的蛋白質(zhì)，使DFF-45（DNA fragmentation factor-45）、DNA 依賴的蛋白激酶（DNA-PK）、多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP，poly（ADP-ribose）polymerase）降解[30]，從而阻止DNA 的修復(fù)，并導(dǎo)致DNA 的降解，致細胞凋亡。Caspase-3 的活化程度可以反映細胞凋亡的情況。試驗結(jié)果顯示，CCl4使細胞發(fā)生明顯的的凋亡，而地參結(jié)合酚可通過阻滯Caspase-3 的活化，抑制細胞凋亡。

2.7 相關(guān)性分析

為了進一步研究所檢測各指標間的關(guān)聯(lián)，進行相關(guān)性分析，結(jié)果見圖6。ALT、Caspase-3、TNFα、IL-6 和IL-8 之間具有顯著的正相關(guān)性，這與崔健嬌等[31]研究結(jié)果一致，表明CCl4損傷肝細胞使轉(zhuǎn)氨酶釋放并伴隨著炎癥反應(yīng)和細胞的凋亡。相反，GSH 和SOD 與ALT、Caspase-3、TNF-α、IL-6、IL-8 間具有顯著的負相關(guān)性，表明地參結(jié)合酚通過抗氧化作用抑制CCl4引起的肝細胞的炎癥反應(yīng)和凋亡，從而發(fā)揮保護肝細胞損傷的作用。

圖6 相關(guān)性分析熱圖Fig.6 Heatmap of correlation analysis

2.8 地參結(jié)合酚對CCl4 損傷肝細胞線粒體膜電位（ΔΨm）的影響

地參結(jié)合酚對CCl4損傷肝細胞ΔΨm的影響見圖7。正常細胞ΔΨm較高，JC-1 以聚合物的形式存在于線粒體中，可以顯示紅色熒光（圖7A）；CCl4產(chǎn)生的自由基和脂質(zhì)過氧化導(dǎo)致線粒體DNA 的消耗和損傷以及超微結(jié)構(gòu)的改變[32]，進而導(dǎo)致ΔΨm的降低，此時JC-1 以單體（Monomer）的形式存在，可以顯示綠色熒光（圖7B）。線粒體膜電位的顯著降低意味著膜通透性和完整性受到嚴重損害[32]。線粒體通透和功能障礙，使線粒體上的膜透過性轉(zhuǎn)換孔開放，釋放出大量的促凋亡蛋白和細胞色素C[33]，進一步誘發(fā)細胞的凋亡[34]。試驗結(jié)果表明，地參結(jié)合酚隨著干預(yù)濃度的升高，紅色熒光逐漸加強（圖7C～7E），提示地參結(jié)合酚干預(yù)可顯著抑制CC14誘導(dǎo)的ΔΨm的降低，穩(wěn)定線粒體的功能，同時具有抑制肝細胞凋亡的作用，這與Caspase-3 活化程度的測定結(jié)果一致。

圖7 地參結(jié)合酚對CCl4 損傷肝細胞線粒體膜電位的影響Fig.7 Effects of bound phenolics from Lycopus lucidus Turcz.on mitochondrial membrane potential in CCl4-injured hepatocytes

細胞凋亡受到兩條基本途徑的調(diào)控：死亡受體介導(dǎo)的（外源性）途徑和線粒體（內(nèi)源性）途徑[35]。在外源性途徑中，配體與死亡受體（DR）之間的相互作用始于質(zhì)膜，然后激活Caspase-8，從而直接激活Caspase-3 的下游作用[36]。在內(nèi)源性途徑中，細胞凋亡使線粒體外膜的通透性增加，從而將溶解的蛋白從線粒體內(nèi)部釋放到細胞質(zhì)中，進一步激活Caspase 破壞細胞[37]。試驗結(jié)果顯示，地參結(jié)合酚通過抑制Caspase-3 的活化和保護線粒體抑制CC14引起的肝細胞的凋亡。

3 結(jié)論

地參結(jié)合酚在干預(yù)劑量范圍無細胞毒性，能抑制CCl4導(dǎo)致的細胞存活率、MDA、SOD 和GSH的降低，以及ALT、AST、LDH、TNF-α、IL-6、IL-8和Caspase-3 活化程度的升高；同時，能顯著降低CCl4引起的細胞凋亡和線粒體膜電位的降低。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，ALT、Caspase-3、TNF-α、IL-6和IL-8 之間具有顯著正相關(guān)，GSH 和SOD 與ALT、Caspase-3、TNF-α、IL-6、IL-8 之間具有顯著負相關(guān)。研究結(jié)果表明，CCl4損傷肝細胞產(chǎn)生了氧化損傷，并伴隨著炎癥反應(yīng)、細胞凋亡和線粒體膜電位的改變。地參結(jié)合酚通過抗氧化、抑制炎癥反應(yīng)和細胞凋亡及保護線粒體的功能，發(fā)揮對CCl4損傷肝細胞的保護作用。今后可從信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路揭示其抗氧化、抑制炎癥反應(yīng)和細胞凋亡的分子機制，為開發(fā)地參保肝功能性食品提供理論參考。