白 健，龔加順，艾桄屹，王秋萍

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 昆明 650201）

大葉曬青茶是選用云南大葉種茶葉（Camellia sinesis Var.assamica），經(jīng)過攤放、殺青、揉捻后，在日光下干燥的茶葉，是普洱生茶和熟茶的原料[1]，其中含有豐富的多酚類物質(zhì)如黃酮、兒茶素和生物堿，如咖啡因等營養(yǎng)成分。多酚類化合物是其分子結(jié)構(gòu)中有若干個酚性羥基的植物成分的總稱[2]。研究較多的是兒茶素類中的表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）單體，具有多種生物學(xué)功能，早在1987 年就有EGCG 抑制人體癌細胞作用的報道[3]。多酚類物質(zhì)具有抗氧化，抗突變，降壓，降血脂，降血糖[4-6]，抑制黑色素的合成[7]，保護腎臟、肝臟[8]等功能。

茶褐素是一類易溶于水，不溶于乙醇、甲醇、乙酸乙酯、正丁醇、三氯甲烷等有機溶劑的高聚合化合物[9]。茶褐素是以茶葉中的多酚類物質(zhì)為主要原料，在兒茶酚氧化酶、漆酶、過氧化物酶等酶類的作用下，經(jīng)過氧化形成鄰醌類物質(zhì)，鄰醌進一步氧化聚合形成茶黃素、茶紅素，再進一步與其它物質(zhì)偶聯(lián)氧化聚合形成茶褐素[10-14]。

茶園通常在每年的十月到來年二月，剪去茶樹頂端不整齊的枝葉，使蓬面平整形成水平或弧形，降低冬季茶樹葉的營養(yǎng)消耗，有利于提高來年春茶的品質(zhì)。冬季修剪茶葉是提高茶葉品質(zhì)的重要手段，同時修剪下的茶樹老葉中也含有大量的多糖、多酚等營養(yǎng)物質(zhì)。

目前茶褐素的制備方法有從固態(tài)發(fā)酵的普洱熟茶或黑茶中提取，采用化學(xué)或酶促法合成茶褐素等[15]。從普洱熟茶或黑茶中提取存在諸如發(fā)酵周期較長，分離純化比較困難，發(fā)酵過程難控制等問題[16-17]，而化學(xué)法[18-19]或酶促轉(zhuǎn)化[20-21]等方法存在化學(xué)試劑易污染環(huán)境，酶促反應(yīng)的酶制劑成本較高等問題。鑒于此，本文采用冬季茶園茶樹修剪老葉的水提物為原料，以固態(tài)發(fā)酵中分離純化的塔賓曲霉（Aspergillus tubingensis）CGMCC.10022 為發(fā)酵菌種，進行液態(tài)發(fā)酵制備茶褐素，以期實現(xiàn)對茶園冬季修剪茶樹老葉的廢物利用，降低茶褐素的生產(chǎn)成本。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

正常大葉曬青茶、粗老大葉曬青茶和冬季茶樹修剪老葉均由普洱瀾滄古茶股份有限公司提供，其中正常大葉曬青茶、粗老大葉曬青茶所用鮮葉分別為3 級（一芽二、三葉占50%以上，同等嫩度其它芽葉占50%以下）和4 級（一芽三、四葉占70%以上，同等嫩度其它芽葉占30%以下）[1]；所用化學(xué)試劑均為分析純級。

塔賓曲霉（Aspergillus tubingensis）CGMCC.10022 從普洱茶固態(tài)發(fā)酵中分離純化的優(yōu)勢菌種，保藏于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.2 儀器與設(shè)備

BS210S 電子天平，北京賽多利斯天平有限公司；RE-52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮儀器廠；FD5-3真空冷凍干燥機，金西蒙；ELX808 酶標(biāo)儀，美國博騰公司；HS153 鹵素水分活性測定儀，瑞士BD Biosciences；CM-5 分光色差儀，日本Konica Minolta 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 理化性質(zhì)測定 水分采用鹵素水分儀測定；pH 值用pH 計測定；色差用分光色差儀測定；茶黃素、茶紅素和茶褐素的含量用萃取比色法測定[22]；水溶性氨基酸用茚三酮比色法測定[23]；水溶性蛋白質(zhì)用考馬斯亮藍法測定[24]；兒茶素的含量用香蘭素比色法測定[25]；總多酚和總黃酮的含量用福林酚比色法測定[26-27]；水溶性總糖和多糖的含量用蒽酮比色法測定[22]。

1.3.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

1.3.2.1 茶樹修剪老葉水提物制備 茶葉按照1∶15（g/mL）的質(zhì)量濃度在沸水中浸提15 min，冷卻后紗布過濾，再經(jīng)濾紙過濾，濾渣復(fù)提1 次，合并2 次濾液，在65 ℃下減壓濃縮，濃縮液經(jīng)真空冷凍干燥后得到茶樹修剪老葉水提物。

1.3.2.2 發(fā)酵條件單因素實驗 以水提物質(zhì)量濃度（5，10，20，40 g/L）、孢子接種 量（103，105，107CFU/mL）、搖床轉(zhuǎn)速（0，100，200，300 r/min）和發(fā)酵溫度（30，37，42，45 ℃）4 個因素進行單因素實驗，所有發(fā)酵重復(fù)2 次。發(fā)酵過程每天取樣4 mL，測定總多酚和茶褐素含量，所有測定重復(fù)3 次，以茶褐素的生成速率（QTB）和底物轉(zhuǎn)化率（YTB/TP）為評價指標(biāo)選出最佳條件。

1）修剪老葉水提物濃度 將1 mL，107CFU/mL 孢子懸浮液，分別接種至5，10，20，40 g/L 已巴士殺菌的水提物中，在37 ℃，200 r/min 下培養(yǎng)至茶褐素含量穩(wěn)定。

2）孢子接種量 將制備好的孢子懸浮液稀釋到合適的倍數(shù)，用血球計數(shù)板計數(shù)，分別將原孢子懸浮液稀釋至103，105，107CFU/mL，分別吸取1 mL 孢子懸浮液，接種至10 g/L 已巴士殺菌的水提物中，在37 ℃，200 r/min 下培養(yǎng)至茶褐素含量穩(wěn)定。

3）發(fā)酵溫度 在10 g/L 已巴氏殺菌的水提物中接種1 mL，107CFU/mL 孢子懸浮液，分別在30，37，42，45 ℃發(fā)酵，轉(zhuǎn)速為200 r/min 下培養(yǎng)至茶褐素含量穩(wěn)定。

4）轉(zhuǎn)速 在10 g/L 已巴氏殺菌的水提物中接種1 mL，107CFU/mL 孢子懸浮液，分別在0，100，200，300 r/min 發(fā)酵，發(fā)酵溫度為37 ℃，直至茶褐素含量穩(wěn)定。

1.3.2.3 發(fā)酵條件正交試驗 根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選取水提物濃度（A）、培養(yǎng)溫度（B）、搖床轉(zhuǎn)速（C）三因素三水平即L9（33）進行正交試驗，以茶褐素含量穩(wěn)定為發(fā)酵終點，以底物轉(zhuǎn)化率作為評價指標(biāo)，篩選出最優(yōu)發(fā)酵條件。

1.4 發(fā)酵參數(shù)計算及數(shù)據(jù)處理方法

發(fā)酵動力學(xué)參數(shù)根據(jù)Sirisansaneeyakul 等[28]的方法計算。數(shù)據(jù)以“”表示，所有數(shù)據(jù)先進行Grubbs 檢驗，以排除過失誤差；經(jīng)G 檢驗合格的數(shù)據(jù)，采用SPSS 19.0，用鄧肯氏法進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同嫩度茶葉理化性質(zhì)比較

由表1 可知，不同嫩度茶葉的茶湯pH 均呈酸性，無顯著性差異（P＞0.05）。茶樹修剪老葉的L*和b*值顯著高于嫩度更高的大葉曬青茶，而a*值則顯著降低（P＜0.05），表明茶樹修剪老葉的茶湯亮度高，偏黃綠色。

表1 不同嫩度茶葉理化性質(zhì)比較Table 1 Physicochemical comparison of tea leaves varied with tenderness

正常和粗老茶葉之間成分差異小，除氨基酸、茶紅素和水分外，其余成分均無顯著性差異（P＞0.05）。茶樹修剪老葉的3 種茶色素含量均顯著小于正常和粗老茶葉（P＜0.05）。正常茶葉和粗老茶葉中茶色素含量最高的均為茶紅素，而茶樹修剪老葉則為茶褐素。茶樹修剪老葉的多糖、氨基酸、蛋白質(zhì)、總多酚、總黃酮、兒茶素、茶黃素、茶紅素和茶褐素含量均顯著低于正常茶葉和粗老茶葉（P＜0.05）；而修剪老葉的水溶性總糖顯著高于正常茶葉和粗老茶葉（P＜0.05）。可能是由于冬季修剪老葉較其它茶葉生長時間更長，積累了更多的糖分，且主要為還原糖等糖類?？傊?，茶樹修剪老葉含有豐富的水溶性物質(zhì)，如碳水化合物、氨基酸、蛋白質(zhì)等，可作為塔賓曲霉生長所需的碳源和氮源，同時含有一定量的總多酚（13.59%），可作為塔賓曲霉發(fā)酵合成茶褐素所需的底物。

2.2 塔賓曲霉發(fā)酵茶樹修剪老葉水提物合成茶褐素的條件優(yōu)化

不同單因素發(fā)酵條件下總多酚和茶褐素含量變化如圖1 所示，發(fā)酵過程中多酚作為合成茶褐素的底物呈下降趨勢，而產(chǎn)物茶褐素則呈上升趨勢。在發(fā)酵的1～2 d，部分組別的總多酚含量有所提高（圖a，c，e），這可能是與多酚的測定方法有關(guān)，本文采用的是福林酚法，該法以沒食子酸作為校正標(biāo)準(zhǔn)定量茶多酚。而已有研究表明普洱茶固態(tài)發(fā)酵過程中，酯型兒茶素如EGCG 和ECG，會在微生物產(chǎn)生的酯酶等作用下水解產(chǎn)生沒食子酸，因此發(fā)酵初期沒食子酸呈上升趨勢[29]，從而導(dǎo)致所測總多酚亦呈上升趨勢。

圖1 不同單因素發(fā)酵條件下茶多酚和茶褐素含量的變化Fig.1 Changes of tea polyphenols and theabrownin under different single factor fermentation conditions

2.2.1 不同濃度修剪老葉水提物對塔賓曲霉合成茶褐素的影響 從圖1b 可知水提物質(zhì)量濃度為5，10，20 g/L 時，茶褐素含量都在發(fā)酵第9 天時達到最大，分別為2.92，5.25，8.88 g/L，分別是發(fā)酵初始的3.07，2.88，2.62 倍，隨后保持穩(wěn)定。由表2 可知，茶樹修剪老葉水提物質(zhì)量濃度為10 g/L 和20 g/L 時，茶褐素生產(chǎn)速率（QTB）較高，且在10 g/L 水提物質(zhì)量濃度時底物轉(zhuǎn)化率最高，故選擇10 g/L的水提物質(zhì)量濃度作為發(fā)酵培養(yǎng)基。

表2 不同單因素發(fā)酵條件下塔賓曲霉合成茶褐素的發(fā)酵參數(shù)Table 2 Fermentation parameters of theabrownin production by Aspergillus tubingensis under different single factor fermentation conditions

2.2.2 不同孢子接種量對塔賓曲霉合成茶褐素的影響 由圖1d 可看出孢子接種量為103，105，107CFU/mL，發(fā)酵14～15 d 后，茶褐素含量均達到最大值，分別為4.94，5.16，5.32 g/L。由表2 可知，接種量為105，107CFU/mL 時，茶褐素的生成速率和底物轉(zhuǎn)化率均顯著高于103CFU/mL（P＜0.05）。接種量為105，107CFU/mL 時，茶褐素的生成速率和底物轉(zhuǎn)化率均無顯著差異（P＞0.05），而接種量為107CFU/mL 時，底物轉(zhuǎn)化率略高于105CFU/mL，故選用107CFU/mL 作為后續(xù)孢子接種量。

2.2.3 不同溫度對塔賓曲霉合成茶褐素的影響如圖1f 所示，發(fā)酵溫度為37 ℃和42 ℃時，茶褐素的生成快于30 ℃和45 ℃，發(fā)酵6 d 時，30，37，42，45 ℃下，茶褐素的含量分別為4.30，4.95，4.91，4.24 g/L，表明溫度過低或過高均不利于塔賓曲霉的生長及其胞外酶的分泌，以及胞外酶氧化多酚合成茶褐素的酶催化作用。發(fā)酵溫度為37 ℃和42 ℃時，茶褐素的生成速率顯著高于30 ℃和45℃（P＜0.05），而兩者的底物轉(zhuǎn)化率無顯著差異（P＞0.05）（表2），從節(jié)能角度出發(fā)，后續(xù)試驗選用37℃作為發(fā)酵溫度。

2.2.4 不同轉(zhuǎn)速對塔賓曲霉合成茶褐素的影響由圖1h 可知，靜置和100 r/min 下，氧氣供應(yīng)不足，茶褐素的生成較少，發(fā)酵2 d 時，茶褐素含量分別為2.18 g/L 和2.39 g/L，僅為發(fā)酵初始的1.65倍左右，隨后保持穩(wěn)定。而200 r/min 和300 r/min下，茶褐素含量最高可達5.00 g/L，約為發(fā)酵初始的3.75 倍。表明塔賓曲霉的生長及茶褐素的合成均需氧氣參與。由表2 發(fā)酵參數(shù)可知，轉(zhuǎn)速為200 r/min 和300 r/min 時，底物轉(zhuǎn)化率顯著高于靜置和100 r/min（P＜0.05），且200 r/min 底物轉(zhuǎn)化率最高，因此后續(xù)試驗選用200 r/min。

根據(jù)上述單因素實驗結(jié)果得到塔賓曲霉利用茶樹修剪老葉合成茶褐素的較佳條件為茶樹修剪老葉水提物質(zhì)量濃度10 g/L，溫度37 ℃，孢子接種量107CFU/mL，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min。正交試驗選取老葉水提物質(zhì)量濃度（A）、培養(yǎng)溫度（B）、搖床轉(zhuǎn)速（C）三因素三水平即L9（33），以茶褐素含量穩(wěn)定為發(fā)酵終點，以底物轉(zhuǎn)化率作為評價指標(biāo)，結(jié)果如圖2 和表3 所示。

圖2 正交試驗優(yōu)化下總多酚和茶褐素的變化Fig.2 Changes of total polyphenols and theabrownin optimized by orthogonal design

表3 正交試驗優(yōu)化下塔賓曲霉合成茶褐素的發(fā)酵參數(shù)Table 3 Fermentation parameters for theabrownin production by Aspergillus tubingensis optimized by orthogonal test

如圖2 所示，采用不同質(zhì)量濃度水提物時，發(fā)酵過程中總多酚和茶褐素的含量變化趨勢相同，總多酚均在0～3 d 時大量下降，隨后逐漸穩(wěn)定。水提物質(zhì)量濃度為5 g/L 和15 g/L 時，茶褐素含量在第6 天時穩(wěn)定，水提物質(zhì)量濃度為10 g/L 時，茶褐素含量在第7 天穩(wěn)定。在水提物質(zhì)量濃度為10 g/L，發(fā)酵溫度40 ℃，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min 時，茶褐素的含量變化介于水提物質(zhì)量濃度為10 g/L，發(fā)酵溫度37 ℃，搖床轉(zhuǎn)速250 r/min 和水提物質(zhì)量濃度為15 g/L，發(fā)酵溫度34 ℃，搖床轉(zhuǎn)速250 r/min 之間，茶褐素最終含量可達到5.78 g/L。

通過比較表3 中YTB/TP的極差r可知，各因素關(guān)系為B＞C＞A，即影響塔賓曲霉利用茶樹修剪老葉水提物合成茶褐素的因素依次為發(fā)酵溫度＞搖床轉(zhuǎn)速＞水提物質(zhì)量濃度；最佳因素水平組合為A2B3C1，即最佳的發(fā)酵條件為茶樹修剪老葉水提物質(zhì)量濃度為10 g/L，發(fā)酵溫度為40 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min。在最優(yōu)條件下，茶褐素含量為5.78 g/L，茶褐素的生成速率為0.026 g/L·h，底物轉(zhuǎn)化率為3.922 g/g。

3 結(jié)論

正常和粗老大葉曬青茶的成分差異較小，而冬季茶樹修剪老葉除總糖高于正常和粗老大葉曬青茶外，其余均低于二者。冬季茶樹修剪老葉含有豐富的水溶性物質(zhì)，可作為塔賓曲霉生長所需的碳源和氮源。以冬季茶樹修剪老葉水提物為培養(yǎng)基，接種塔賓曲霉進行發(fā)酵，合成茶褐素的最優(yōu)條件為修剪老葉水提物質(zhì)量濃度為10 g/L，發(fā)酵溫度為40 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min。在最優(yōu)條件下，茶褐素含量為5.78 g/L，生成速率為0.026 g/L·h，底物轉(zhuǎn)化率為3.922 g/g。