王丹鳳，薛舒苑，周學(xué)府，鐘 宇，鄭遠(yuǎn)榮，鄧 云*

（1 上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院 上海 201100 2 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 呼和浩特 010018 3 乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院 上海 200436）

酪蛋白（Casein）占牛奶蛋白的80%左右，是牛奶中最主要的蛋白質(zhì)，由αs1-、αs2-、β-和κ-casein 組成，分子質(zhì)量在19～24 ku 之間，具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和功能特性。酪蛋白是牛奶的主要過敏原，其中αs1-casein 致敏性最強(qiáng)，牛奶過敏人群中約有65%對(duì)αs1-casein 過敏[1]。對(duì)αs1-casein 的致敏性及降低其致敏性研究至今仍是熱點(diǎn)[2-5]。

漢麻籽蛋白（Hemp protein isolate，HPI）由70%左右的麻仁球蛋白和30%左右的白蛋白組成，是一種新興的植物蛋白源。研究顯示，白蛋白比麻仁球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)更有序[6]。HPI 包含所有必需氨基酸（EAA）[7]，必需氨基酸指數(shù)（＞80）顯著高于其它植物蛋白，如板栗蛋白（76～79）、藜麥種子蛋白（79）[8]。此外，HPI 幾乎沒有致敏性且抗?fàn)I養(yǎng)因子含量極低，有助于其在食品工業(yè)中的廣泛應(yīng)用[9]。

食品配方中植物蛋白替代動(dòng)物蛋白已成為重要趨勢(shì)[10]。HPI 因獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)特性和低致敏性而被認(rèn)為是酪蛋白優(yōu)良的替代品[11]。然而，HPI 較差的溶解性和加工特性使其簡(jiǎn)單地替換酪蛋白會(huì)對(duì)食品品質(zhì)產(chǎn)生不利影響。如何降低HPI 對(duì)其替代后的動(dòng)植物蛋白復(fù)合體系的影響鮮有報(bào)道。谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（TG 酶）能誘導(dǎo)蛋白質(zhì)分子間或分子內(nèi)的共價(jià)交聯(lián)，進(jìn)而修飾蛋白特性[12]。通過TG 酶強(qiáng)化酪蛋白與HPI 間的相互作用，以實(shí)現(xiàn)HPI 對(duì)酪蛋白的部分替代，具有降低HPI 對(duì)食品體系不利影響的潛力。本團(tuán)隊(duì)前期研究已證實(shí)Casein-HPI復(fù)合物具有更強(qiáng)的乳化性、凝膠性，而交聯(lián)降低了復(fù)合物的抗氧化性。本文采用響應(yīng)面法優(yōu)化Casein-HPI 復(fù)合物的制備工藝，目的是制備具有最優(yōu)乳化活性、凝膠持水率和抗氧化性保留率的復(fù)合蛋白。考察最優(yōu)工藝下制備的復(fù)合物的體外消化率、致敏性、微觀結(jié)構(gòu)，旨在為實(shí)現(xiàn)HPI 替代或部分替代酪蛋白提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

漢麻籽，巴馬十瑯生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司。

酪蛋白（C3400-500 g），上海Sigma 公司。胃蛋白酶、胰蛋白酶，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，江蘇一鳴生物股份有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

D-1903 掃描電子顯微鏡，德國(guó)WITec 公司；UV-1800 紫外分光光度計(jì)，島津國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；PT 10-35GT 均質(zhì)機(jī)，瑞士Kinematica公司；Z326K 低溫離心機(jī)，德國(guó)哈默股份公司；Triad 冷凍干燥機(jī)，美國(guó)Labconoco 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 HPI 提取 參照Alavi 等[13]的方法，粉碎后的漢麻籽粉中添加正己烷（0.33 g/mL）攪拌2 h 脫脂，該過程重復(fù)3 次。將脫脂后的漢麻籽粉置于通風(fēng)櫥中，室溫（20 ℃）下風(fēng)干24 h，后將漢麻籽粉分散在去離子水中（0.1 g/mL），用6 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH 值至11，并在25 ℃下連續(xù)攪拌2 h。將混合物在6 000×g 下離心10 min，取上清液，用6 mol/L HCl 調(diào)節(jié)pH 值至4.5，并在4 ℃下過夜以沉淀蛋白質(zhì)。沉淀通過6 000×g 離心10 min 分離，然后分散于蒸餾水中并調(diào)節(jié)pH 值至7.0，最后將混合物凍干，并在4 ℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 Casein-HPI 復(fù)合物的制備 Casein-HPI 的制備參考Yang 等[14]的方法。將酪蛋白溶液（6%）和HPI 溶液（6%）以一定比例混合，加入TG 酶并充分?jǐn)嚢韬?，?0 ℃條件下水浴交聯(lián)一段時(shí)間。交聯(lián)結(jié)束后在80 ℃下水浴10 min，使TG 酶失活以終止反應(yīng)。蛋白溶液經(jīng)真空冷凍干燥，并于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 Casein-HPI 復(fù)合物制備條件的響應(yīng)面設(shè)計(jì)

1）因素及水平 通過單因素實(shí)驗(yàn)，根據(jù)Box-Behnken 設(shè)計(jì)原理，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法，研究其對(duì)Casein-HPI 復(fù)合物乳化活性、抗氧化性保留率和凝膠持水率的影響。因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面的因素及水平Table 1 Response surface factors and levels

2）響應(yīng)面試驗(yàn)方案 試驗(yàn)方案由Design-Expert 8.0 軟件隨機(jī)生成，如表2 所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)Table 2 Response surface design

3）最優(yōu)工藝選擇 在Design-Expert 軟件中選擇乳化活性、抗氧化性保留率和凝膠持水率均最高的值（各指標(biāo)的權(quán)重為1∶1∶1），由軟件進(jìn)行最優(yōu)工藝選擇，使用RSM 法預(yù)測(cè)最優(yōu)工藝和處理效果，從而得到Casein-HPI 復(fù)合物最優(yōu)的制備工藝。

4）最優(yōu)工藝驗(yàn)證 按照最優(yōu)工藝制備Casein-HPI 復(fù)合物，測(cè)定其乳化活性、抗氧化性保留率和凝膠持水率，并與軟件計(jì)算出的理論值對(duì)比，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果與實(shí)際檢測(cè)結(jié)果的一致性與可靠性。

1.3.4 乳化活性測(cè)定 蛋白質(zhì)的乳化活性指數(shù)（EAI）測(cè)定參照J(rèn)iang 等[15]的方法并稍作修改。將6 mL 質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL 蛋白質(zhì)樣品與3 mL大豆油混合以制備水包油乳液，并使用均質(zhì)器以10 000 r/min 均質(zhì)1 min。然后吸取30 μL 乳液加入至3 mL SDS（1 g/L）溶液中，于波長(zhǎng)500 nm 處測(cè)量吸光度。根據(jù)式（1）計(jì)算EAI：

式中，T——log 與ln 的換算常數(shù)，ln10≈2.303；A0——稀釋的乳液吸光度；D——稀釋倍數(shù)（100）；C——蛋白溶液質(zhì)量濃度（2.5 mg/mL）；Φ——油相體積分?jǐn)?shù)（1/3）。

1.3.5 凝膠持水率測(cè)定 將葡萄糖酸內(nèi)酯（GDL）粉末以0.2 g/g 蛋白質(zhì)的比例添加到Casein-HPI溶液（60 mg/mL）中，40 ℃孵育3 h，將凝膠樣品轉(zhuǎn)移到4 ℃下穩(wěn)定24 h。凝膠持水率測(cè)定參照Tang等[16]的方法并稍作修改。凝膠樣品以2 000×g 離心15 min。根據(jù)式（2）通過凝膠中的水損失計(jì)算持水率（WHC）：

式中，M1——離心前的凝膠質(zhì)量（g）；M2——離心后去除水分的凝膠質(zhì)量（g）。

1.3.6 抗氧化保留率測(cè)定 復(fù)合物抗氧化性通過ABTS 法測(cè)定，具體參照J(rèn)iang 等[17]的方法，其保留率為交聯(lián)后與交聯(lián)前復(fù)合物抗氧化能力的比值。將7.4 mmol/L ABTS 溶液加到2.6 mmol/L 過硫酸鉀中，使用前室溫下暗處?kù)o置至少12 h。然后將ABTS 溶液用5 mmol/L pH 7.0 的磷酸鈉緩沖鹽水溶液稀釋，直至在波長(zhǎng)734 nm 下的吸光度達(dá)到0.7±0.02。測(cè)定時(shí)，將1 mL 蛋白樣品加到2 mL 稀釋的ABTS 溶液中。室溫下反應(yīng)6 min 后，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)734 nm 處測(cè)定樣品的吸光值A(chǔ)S。以蒸餾水為空白對(duì)照測(cè)定的吸光值為AC?？寡趸员Ａ袈视?jì)算公式如下：

式中，AS0——未經(jīng)TG 酶交聯(lián)的蛋白樣品吸光值；AS——經(jīng)TG 酶交聯(lián)的蛋白樣品吸光值；AC——空白對(duì)照的吸光值。

1.3.7 體外消化率測(cè)定 參照He 等[18]的方法，通過體外消化過程中的氮釋放分析，評(píng)估蛋白樣品的體外消化率。為模仿人體內(nèi)消化環(huán)境，整個(gè)過程在37 ℃水浴中進(jìn)行。首先配制質(zhì)量濃度為10 g/L的蛋白懸浮液，并用2 mol/L 鹽酸調(diào)節(jié)pH 值至2.0。隨后向懸浮液中加入胃蛋白酶（20 mg/g pro），振蕩孵育1 h。用1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)懸浮液pH 值至7.5，以終止胃消化階段，后加入胰蛋白酶（20 mg/g pro），振蕩孵育2 h。在體外消化1，2，3 h時(shí)，分別收集樣品溶液，并用同體積的15%的三氯乙酸洗滌，隨后在8 000×g 下離心15 min，收集上清液。通過凱氏定氮測(cè)定上清液的氮含量，根據(jù)公式（4）計(jì)算樣品的體外消化率：

式中，N0——上清液N 含量（mg）；N總——樣品總氮含量（mg）。

1.3.8 致敏性測(cè)定 參照Hu 等[19]的方法，用ELISA 測(cè)定蛋白樣品消化前、后的致敏性。將樣品稀釋適當(dāng)倍數(shù)，將100 μL 稀釋液加入到包被有特異性抗體的微孔板中，室溫下（20～25 ℃）孵育10 min，倒出孔中液體，倒置微孔板并在吸水紙上拍打3 次，加入250 μL 洗滌緩沖液洗滌，重復(fù)洗滌3 次。加入酶標(biāo)記的抗體，小心混勻，室溫下孵育10 min，倒出孔中的液體，并重復(fù)上述洗滌動(dòng)作，后加入100 μL 底物，室溫下暗處孵育10 min，使底物與酶連接物結(jié)合。最后加入100 μL 反應(yīng)終止液并充分混合，于波長(zhǎng)450 nm 處測(cè)量吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品的抗原性。

1.3.9 微觀結(jié)構(gòu)觀察 將蛋白樣品噴金處理，隨后用掃描電子顯微鏡在5 kV 電壓條件下觀察其微觀結(jié)構(gòu)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 26.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用Duncan多范圍檢驗(yàn)（P＜0.05）進(jìn)行單向方差分析。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）”表示，使用OriginPro 2018進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇酶活（10，30，50 U/g）、交聯(lián)時(shí)間（1，2，3 h）、Casein/HPI 的質(zhì)量比（11∶1，10∶2，9∶3）進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.1 響應(yīng)面優(yōu)化Casein-HPI 復(fù)合物制備

2.1.1 Box-Behnken 試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)上述試驗(yàn)方案，在不同酶活、交聯(lián)時(shí)間及Casein/HPI 質(zhì)量比條件下制備Casein-HPI 復(fù)合物，并測(cè)定其乳化活性、凝膠持水率及抗氧化性保留率。結(jié)果如表3 所示。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of the response surface experiment

2.1.2 自變量對(duì)Casein-HPI 復(fù)合物乳化活性的影響 用Design-Expert 軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析（ANOVA），結(jié)果表明了各個(gè)變量的重要性以及變量之間的相互作用，如表4 所示。模型的F=58.31，P=0.0001＜0.05，差異顯著，表明方程可能由于噪音干擾導(dǎo)致0.01%的概率與實(shí)際結(jié)果有差異。函數(shù)模型R2=0.964，說明模型預(yù)測(cè)值和試驗(yàn)值擬合度高，預(yù)測(cè)Casein-HPI 乳化活性最大值是可信的?；貧w方程的方差分析結(jié)果顯示，一次項(xiàng)X1，X2，X3，交互項(xiàng)X1X2和二次項(xiàng)X12對(duì)乳化活性的影響顯著。回歸分析得到的回歸方程為：

表4 乳化活性的響應(yīng)面模型擬合結(jié)果Table 4 Model fitting for EAI

如圖1 所示，隨TG 酶酶活增大，Casein-HPI復(fù)合物乳化活性先增大后減小，TG 酶交聯(lián)暴露出Casein-HPI 的疏水性基團(tuán)，并在低酶活條件下達(dá)到親水性和疏水性平衡。蛋白乳化活性在酶活較低的條件下呈增大趨勢(shì)，然而隨酶活繼續(xù)增大，過度交聯(lián)導(dǎo)致其親水和疏水相互作用被打破，而使其乳化活性降低[20]。然而此趨勢(shì)在交聯(lián)時(shí)間縮短時(shí)發(fā)生改變，尤其在1 h 時(shí)，隨TG 酶酶活增大乳化活性呈持續(xù)增大的趨勢(shì)，說明短時(shí)間交聯(lián)條件下，達(dá)到親水性和疏水性平衡需要更大的TG 酶酶活。另外，隨交聯(lián)時(shí)間的延長(zhǎng)，Casein-HPI 復(fù)合物乳化活性呈增大趨勢(shì)，而該趨勢(shì)隨著酶活增大變得不顯著。尤其當(dāng)TG 酶酶活為50 U/g 時(shí)，Casein-HPI 復(fù)合物的乳化活性隨處理時(shí)間延長(zhǎng)基本無顯著變化?？赡苁且?yàn)樵诟呙富顥l件下，交聯(lián)反應(yīng)達(dá)到飽和所需的時(shí)間更短。此外，由圖1 可知，增大HPI 在復(fù)合物中的配比會(huì)降低Casein-HPI的乳化活性。

圖1 不同自變量對(duì)Casein-HPI 復(fù)合物乳化活性影響的響應(yīng)面等高線圖Fig.1 The response surface and contour for the effect of emulsifying activity index（EAI）of casein-HPI complex between different independent variables

2.1.3 自變量對(duì)Casein-HPI 復(fù)合物抗氧化性保留率的影響 如表5 所示，模型的F=76.13，P=0.0001＜0.05，差異顯著，表明方程可能由于噪音干擾導(dǎo)致0.01%的概率與實(shí)際結(jié)果有差異。函數(shù)模型R2=0.9786，說明模型的預(yù)測(cè)值和試驗(yàn)值擬合度高，預(yù)測(cè)Casein-HPI 復(fù)合物抗氧化性保留率最大值可信。由回歸方程的方差分析結(jié)果可以看出，一次項(xiàng)X1，X2，X3，交互項(xiàng)X1X2和二次項(xiàng)X12，X22對(duì)抗氧化性保留率的影響顯著?；貧w分析得到的回歸方程為：

表5 抗氧化性保留率的響應(yīng)面模型擬合結(jié)果Table 5 Model fitting for antioxidant retention rate

如圖2 所示，隨酶活增大，Casein-HPI 復(fù)合物的抗氧化性保留率呈下降趨勢(shì)，表明交聯(lián)處理對(duì)Casein-HPI 復(fù)合物的抗氧化性有抑制作用。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，酶活增大使得Casein-HPI 交聯(lián)度增大，蛋白質(zhì)的共價(jià)交聯(lián)導(dǎo)致更多自由基清除活性位點(diǎn)被掩埋。然而，增大HPI 在復(fù)合蛋白中的配比能有效提高Casein-HPI 的抗氧化性保留率，如圖2b 所示。結(jié)合預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，添加HPI 導(dǎo)致復(fù)合蛋白交聯(lián)度降低，復(fù)合物聚集程度降低，有效抑制了抗氧化基團(tuán)的掩埋，從而使得蛋白質(zhì)抗氧化性保留率提高。

圖2 不同自變量對(duì)Casein-HPI 復(fù)合物抗氧化性保留率影響的響應(yīng)面等高線圖Fig.2 The response surface and contour for the effect of antioxidant retention rate of casein-HPI complex between different independent variables

2.1.4 自變量對(duì)Casein-HPI 復(fù)合物凝膠持水率的影響 如表6 所示，回歸模型方差分析（ANOVA）F=23.47，P=0.0001＜0.05，差異顯著，表明方程可能由于噪音干擾導(dǎo)致0.01%的概率與實(shí)際結(jié)果有差異。函數(shù)模型R2=0.9591，說明模型的預(yù)測(cè)值和試驗(yàn)值擬合度高，預(yù)測(cè)Casein-HPI 凝膠持水率最大值可信。由回歸方程的方差分析結(jié)果可以看出，一次項(xiàng)X1，X3，交互項(xiàng)X1X2、X2X3和二次項(xiàng)X12，X22，X32對(duì)凝膠持水率的影響顯著?；貧w分析得到的回歸方程為：

表6 凝膠持水率的響應(yīng)面模型擬合結(jié)果Table 6 Model fitting for WHC of gel

如圖3 所示，Casein-HPI 凝膠持水率隨TG酶酶活的升高和交聯(lián)時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升后下降的趨勢(shì)。TG 酶交聯(lián)能誘導(dǎo)蛋白凝膠形成致密的蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，有利于凝膠中保留更多水分。這使得在酶活和交聯(lián)時(shí)間增大的初始階段Casein-HPI復(fù)合物凝膠的持水率提升。而繼續(xù)增大酶活或延長(zhǎng)交聯(lián)時(shí)間，過度交聯(lián)導(dǎo)致Casein-HPI 與水分子的結(jié)合位點(diǎn)減少，凝膠持水率下降[21]。如圖3c 所示，隨著復(fù)合物中HPI 配比增大，Casein-HPI 復(fù)合物凝膠的持水率顯著降低，是由于HPI 導(dǎo)致復(fù)合蛋白的交聯(lián)度降低，形成更為疏松的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而使得持水能力降低。HPI 含量增大導(dǎo)致凝膠持水率下降的趨勢(shì)在高酶活條件下尤為明顯，證實(shí)HPI 在高酶活條件下對(duì)復(fù)合物的交聯(lián)存在更強(qiáng)的抑制能力。

圖3 不同自變量對(duì)Casein-HPI 復(fù)合凝膠持水率影響的響應(yīng)面等高線圖Fig.3 The response surface and contour for the effect of WHC of casein-HPI complex between different independent variables

2.1.5 最優(yōu)交聯(lián)工藝驗(yàn)證 將乳化活性、抗氧化性保留率、凝膠持水率的權(quán)重設(shè)為1∶1∶1，經(jīng)RSM預(yù)測(cè)，Casein-HPI 最優(yōu)交聯(lián)條件為TG 酶酶活為31.90，交聯(lián)時(shí)間為2.06 h，Casein/HPI 質(zhì)量比為10.51∶1.49。按最優(yōu)工藝制備Casein-HPI 復(fù)合物，對(duì)比實(shí)際值與預(yù)測(cè)值，結(jié)果如表7 所示，各預(yù)測(cè)值的相對(duì)偏差均小于5%，可見響應(yīng)面法優(yōu)化得到的最優(yōu)工藝結(jié)果可靠。

表7 最優(yōu)工藝條件制備的Casein-HPI 復(fù)合物實(shí)際值與預(yù)測(cè)值對(duì)比Table 7 Comparison of optimal processing Casein-HPI response value and prediction value

2.2 體外消化率

蛋白質(zhì)體外消化率揭示了蛋白質(zhì)被消化酶水解的能力，直接影響消化后氨基酸和肽的吸收，因此可體現(xiàn)出待測(cè)物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及在食品領(lǐng)域是否具有廣泛應(yīng)用的潛力[22]。圖4 顯示了酪蛋白、HPI、Casein-HPI 混合物（不添加TG 酶）以及最優(yōu)工藝下制備的Casein-HPI 復(fù)合物體外消化過程中的氮釋放曲線。4 種蛋白樣品顯示出相似的氮釋放特性，其消化過程主要集中于胃消化階段（0～1 h）和腸道消化前半階段（1～2 h）。而在消化的2～3 h內(nèi)，所有蛋白樣品的氮釋放曲線逐漸趨于平穩(wěn)。He等[18]也報(bào)道了相似的結(jié)論，其發(fā)現(xiàn)大米谷蛋白的體外消化過程中腸道消化的后半階段氮釋放變得緩慢。在胃消化階段中，酪蛋白、HPI 及Casein-HPI 混合物顯示出較相似的消化特性。胃消化階段結(jié)束后，上述3 種蛋白的消化率呈酪蛋白＞Casein-HPI 混合物＞HPI 的規(guī)律。而交聯(lián)后的Casein-HPI 復(fù)合物在胃消化1 h 后消化率顯著降低。賴氨酸作為胃蛋白酶酶切位點(diǎn)之一，在TG 酶誘導(dǎo)下與谷氨酰胺殘基共價(jià)交聯(lián)形成異肽鍵，從而抑制胃蛋白酶的水解作用[23]。Romano 等[24]研究了TG 酶對(duì)豆粉蛋白體外消化率的影響，發(fā)現(xiàn)TG酶誘導(dǎo)豆粉蛋白形成致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)而降低了其在胃消化階段的消化率。

圖4 酪蛋白、HPI、Casein-HPI 混合物、Casein-HPI 復(fù)合物的體外消化氮釋放曲線Fig.4 Protein digestion curves of casein，HPI，Casein-HPI mixture，Casein-HPI complex in vitro

進(jìn)入腸道消化階段后，4 種蛋白氮釋放量持續(xù)增加證實(shí)了胰蛋白酶的水解作用。在腸道消化階段，酪蛋白、Casein-HPI 混合物以及Casein-HPI復(fù)合物的氮釋放增加了3～4 倍，而HPI 顯示出最平緩的釋放曲線，其氮釋放量?jī)H增大1 倍左右，最終消化率僅有50%左右，表明HPI 含有較少的胰蛋白酶酶切位點(diǎn)。據(jù)報(bào)道[22，25]，HPI 的體外消化率可達(dá)70%～80%，顯著高于本文HPI 的消化率。一方面是因?yàn)轶w外消化階段的時(shí)長(zhǎng)不同，另一方面可能是因?yàn)楸疚牡腍PI 是由未脫殼的漢麻籽制備，殼中的酚類物質(zhì)與蛋白形成多酚-蛋白質(zhì)復(fù)合體從而導(dǎo)致消化率降低[25]。體外消化中，酪蛋白消化率最高，Casein-HPI 混合物介于酪蛋白和HPI之間。與上述胃消化階段相似，TG 酶交聯(lián)顯著降低了Casein-HPI 復(fù)合物的體外消化率，歸因于TG 酶誘導(dǎo)更大分子質(zhì)量的抗消化共聚物的形成。然而，Casein-HPI 復(fù)合物消化率的降低有利于增強(qiáng)飽腹感，并且在胃腸道特異性藥物遞送方面具有應(yīng)用潛力[18]。

2.3 致敏性測(cè)試

檢測(cè)了蛋白質(zhì)消化前、后的抗原含量以表征蛋白質(zhì)的致敏性。如圖5 所示，酪蛋白、Casein-HPI 混合物在體外消化前致敏性沒有明顯差異。TG 酶交聯(lián)顯著降低了混合物體外消化前的致敏性。這是因?yàn)門G 酶能催化賴氨酸殘基和谷氨酰胺殘基生成異肽共價(jià)鍵，最終形成多分支結(jié)構(gòu)的共聚物。當(dāng)有足夠多的交聯(lián)位點(diǎn)參與交聯(lián)時(shí)，TG酶誘導(dǎo)的多分支結(jié)構(gòu)可能會(huì)掩蓋潛在的IgE 結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)而降低蛋白質(zhì)的致敏性[26]。Li 等[26]也曾證明TG 酶交聯(lián)具有降低蛋白致敏性的潛力，其發(fā)現(xiàn)酪蛋白、乳清蛋白、大豆蛋白通過TG 酶交聯(lián)能有效降低其致敏性。

圖5 酪蛋白、HPI、Casein-HPI 混合物、Casein-HPI 復(fù)合物致敏性Fig.5 Allergenicity of casein，HPI，Casein-HPI mixture，Casein-HPI complex

消化作用顯著降低了蛋白的致敏性，歸因于消化酶的水解作用破壞了IgE 結(jié)合位點(diǎn)[27]。消化結(jié)束后，酪蛋白、Casein-HPI 混合物，Casein-HPI 復(fù)合物顯示出相似的致敏性。表明仍有未被消化酶水解的過敏原表位，這也證實(shí)了TG 酶交聯(lián)只能降低消化前或輕度水解時(shí)的致敏性，其交聯(lián)作用并未破壞蛋白的IgE 結(jié)合位點(diǎn)，而是通過聚合作用掩埋其過敏原表位。因此隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)，尤其是后期階段，Casein-HPI 致敏性的降低主要是由于蛋白酶對(duì)過敏原表位的破壞作用而與TG酶無關(guān)。

2.4 微觀結(jié)構(gòu)

通過掃描電子顯微鏡觀察進(jìn)一步表征蛋白質(zhì)交聯(lián)前、后的微觀結(jié)構(gòu)。如圖6 所示，酪蛋白呈現(xiàn)表面光滑的片狀微觀結(jié)構(gòu)。而HPI 的表面相對(duì)粗糙，可能是堿溶酸沉法提取HPI 過程中蛋白質(zhì)有輕微變性。交聯(lián)后的Casein-HPI 顯示出不同于其它3 種蛋白的微觀結(jié)構(gòu)，表面出現(xiàn)明顯的顆粒狀突起。證明TG 酶交聯(lián)顯著改變了復(fù)合蛋白的微觀形貌，主要是因?yàn)門G 酶對(duì)復(fù)合蛋白的結(jié)構(gòu)修飾。Yang 等[14]也發(fā)現(xiàn)卵黃高磷蛋白與面筋蛋白通過TG 酶交聯(lián)后，其微觀結(jié)構(gòu)從蜂窩狀空腔結(jié)構(gòu)逐漸向致密、光滑的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化。

圖6 酪蛋白、HPI、Casein-HPI 混合物、Casein-HPI 復(fù)合物微觀形貌Fig.6 Morphology of casein，HPI，Casein-HPI mixture，Casein-HPI complex

3 結(jié)論

1）以乳化活性、凝膠持水率和抗氧化性保留率作為響應(yīng)指標(biāo)，TG 酶酶活、處理時(shí)間和酪蛋白/HPI 質(zhì)量比為自變量，采用響應(yīng)面法優(yōu)化了Casein-HPI 制備條件。3 個(gè)響應(yīng)值模型擬合方程的R2值均超過0.9，P 值均小于0.05，失擬項(xiàng)均不顯著，證實(shí)了模型的有效性。通過響應(yīng)面法擬合后得出的最優(yōu)工藝條件為：TG 酶酶活31.90 U/g，交聯(lián)時(shí)間2.06 h，酪蛋白/HPI 質(zhì)量比10.51∶1.49。

2）在最優(yōu)工藝下制備的Casein-HPI 復(fù)合物與未交聯(lián)蛋白相比具有更強(qiáng)的抗酶解能力。酪蛋白通過TG 酶與HPI 交聯(lián)在消化前或輕度水解階段致敏性顯著降低，而在消化末期復(fù)合物致敏性和未交聯(lián)蛋白沒有顯著區(qū)別。同時(shí)，交聯(lián)改變了混合蛋白的微觀形貌，源于TG 酶對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的修飾。

3）本文通過TG 酶強(qiáng)化酪蛋白和HPI 的相互作用以實(shí)現(xiàn)HPI 部分替代酪蛋白的同時(shí)，能有效緩解HPI 對(duì)復(fù)合蛋白的不利影響，進(jìn)而促進(jìn)HPI 在食品工業(yè)中的廣泛應(yīng)用。