韓國全，吳任之，張 翼，饒均鑰，曹蕓榕，楊茂杰

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 食品加工與安全研究所 四川雅安 625014）

金黃色葡萄球菌（S.aureus）生物膜（Biofilm）是一種微生物群落，嵌在由聚合物組成的自生細(xì)胞外間質(zhì)中，使微生物逃避先天免疫系統(tǒng)的作用，與浮游的活躍生長培養(yǎng)物相比，生物膜中的細(xì)胞耐藥性更強(qiáng)，導(dǎo)致傷口愈合時(shí)間延長或形成不可愈合創(chuàng)口[1]。針對金黃色葡萄球菌生物膜的檢測方法有很多，包括剛果紅法、96 孔微量板定量檢測法、激光共聚焦掃描顯微鏡等。生物膜基因（bap、icaA、icaD）、黏附相關(guān)基因（fnbA、fnbB、clfA、clfB、can）等均是導(dǎo)致其成膜的重要因素，其中合成細(xì)胞間黏附多糖的icaA、D、B、C操縱子的表達(dá)至關(guān)重要。Bazari 等[2]研究證明，金黃色葡萄球菌胞外多糖層與生物膜的形成有一定關(guān)系，分離株中icaA、D基因的存在與體外生物膜的形成無關(guān)。clfA、clfB是導(dǎo)致金黃色葡萄球菌黏附的主要因素之一。目前針對牛乳或者牛乳腺炎中該基因的研究較多，而針對生鮮豬肉的研究極少。Ren 等[3]發(fā)現(xiàn)奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌分離株的clfA、clfB基因的檢出率為100%。

在探索金黃色葡萄球菌生物膜形成能力同時(shí)，也需要進(jìn)行多位點(diǎn)序列分型分析（MLST），該分型結(jié)果可在不同實(shí)驗(yàn)室、地區(qū)甚至國家之間進(jìn)行對比，進(jìn)行全球性的流行病學(xué)調(diào)查研究。截至2021 年12 月，金黃色葡萄球菌數(shù)據(jù)庫中包含7 330 種ST 型，不同金黃色葡萄球菌管家基因片段因不同的等位基因而有不同序列，擴(kuò)增管家基因后測序，與MLST 數(shù)據(jù)庫（http：//www.mlst.net）中的序列進(jìn)行比較，即可獲得等位基因譜和相應(yīng)的ST 型。王琦等[4]總結(jié)了亞洲、北美洲、歐洲金黃色葡萄球菌的ST 起源及流行現(xiàn)狀，ST59、ST72、ST772 是起源于亞洲的金黃色葡萄球菌分型，ST5/USA100、ST1/USA400、ST8/USA300 是北美洲主要的ST 型，醫(yī)院獲得克隆ST22/EMRSA-15 和動(dòng)物中流行的ST398 都首先出現(xiàn)于歐洲。隨著時(shí)代和社會的發(fā)展，這些ST 型也在不同地區(qū)、宿主中交叉?zhèn)鞑ァ?/p>

鑒于金黃色葡萄球菌的生物膜及不同ST 型對其耐藥性、致病性等方面的較大影響，本研究對前期從雅安市生鮮豬肉中分離的金黃色葡萄球菌進(jìn)行生物膜的形成和MLST 分型檢測，分析分離株的成膜機(jī)制及遺傳多樣性，同時(shí)完善金黃色葡萄球菌的MLST 數(shù)據(jù)庫。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

試驗(yàn)用73 株金黃色葡萄球菌為本團(tuán)隊(duì)前期從雅安市生鮮豬肉中分離所得，夏季37 株，冬季36 株[5]；標(biāo)準(zhǔn)菌株：金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC 25923），表皮葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC 12228），由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院微生物團(tuán)隊(duì)保存。

1.2 主要試劑與儀器

剛果紅瓊脂：BHI 肉湯37 g/L，蔗糖36 g/L，剛果紅0.8 g/L，瓊脂10 g/L，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min；Baird-Parker 瓊脂平板、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）、腦心浸出液肉湯（BHI）；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用2×Taq Master Mix、DL2000 DNA Marker、引物（成都擎科生物技術(shù)有限公司）。

LMQ.C-100E 自動(dòng)高壓滅菌器，山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；T100 型PCR 儀、SUBCELLGT 水平電泳槽、GELDOCXR 凝膠成像分析儀，美國Bio-Rad 公司；S4800 場發(fā)射掃描電鏡，日本日立公司；Varioskan LUX 酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技公司；麥?zhǔn)媳葷醿x，法國梅里埃公司。

1.3 方法

1.3.1 剛果紅瓊脂試驗(yàn) 挑取單菌落接種于TSB培養(yǎng)基，37 ℃，180 r/min 培養(yǎng)過夜，將培養(yǎng)好的細(xì)菌劃線于剛果紅瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)18 h，置于室溫72 h 后觀察菌落特點(diǎn)。產(chǎn)生物膜的菌落為黑色，不產(chǎn)生物膜的菌落為紅色，試驗(yàn)重復(fù)3 次[6-7]。

1.3.2 96 孔微量板定量檢測試驗(yàn) 通過酶標(biāo)儀測量菌株在96 微孔板中生長后的吸光度值，進(jìn)行金黃色葡萄球菌生物膜形成定量研究。具體操作參照Wang 等[8]和張陽[9]的方法：挑取單菌落接種于TSB 培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)，將菌液稀釋至0.5 麥?zhǔn)蠞岫龋瑐溆?。?00 μL 含1%葡萄糖的新鮮TSB（TSBglc）培養(yǎng)基分別加入96 微孔板中，再取上述菌液按1%的接種量加入96 微孔板中。金黃色葡萄菌株ATCC 25923 作為陽性對照，表皮葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 12228 作為陰性對照，TSBglc培養(yǎng)基作為試劑空白。37 ℃培養(yǎng)72 h 后棄去菌液，用200 μL PBS 洗滌3 次，200 μL 甲醇固定20 min 后棄去，自然干燥，用200 μL 0.4%結(jié)晶紫染色15 min，再用無菌PBS 洗滌3 次，自然風(fēng)干，最后用200 μL 33%冰醋酸溶解30 min，酶標(biāo)儀測定波長570 nm 處的光密度值，OD 值反映生物膜與接觸表面黏附的牢固程度，試驗(yàn)重復(fù)3 次。

依據(jù)臨界ODc 值（ODc 等于空白孔的平均值加上其3 倍標(biāo)準(zhǔn)差）對生物膜分類[8-9]：OD≤ODc為 不黏附，ODc ＜OD ≤2ODc 為弱黏附，2ODc ＜OD≤4ODc 為中等黏附，OD＞4ODc 為強(qiáng)黏附。

1.3.3 生物膜掃描電鏡觀察 銹鋼片的清洗：丙酮浸泡不銹鋼片（1.0 cm×1.0 cm）除去表面油脂，然后把不銹鋼片放在5 mol/L 鹽酸溶液中浸泡15 min，用洗滌劑清洗，再用蒸餾水沖洗干凈。最后把不銹鋼片放入18 mm×180 mm 試管中，加入10 mL TSB 培養(yǎng)基，滅菌[10]。

接種培養(yǎng)：將不同黏附能力的菌株在TSB 培養(yǎng)基中37 ℃，180 r/min 培養(yǎng)6～8 h，按1%的接種量接入上述試管中，37 ℃培養(yǎng)48 h。

樣品制備：不銹鋼片用PBS 溶液沖洗2 次，去除浮游菌，用2.5%戊二醛溶液固定至少2 h 后，用PBS 沖洗2 次，依次用30%，50%，70%，99%的乙醇脫水15 min，經(jīng)醋酸乙戊酯置換、臨界點(diǎn)干燥儀干燥、噴金，經(jīng)過掃描電鏡觀察生物膜微觀形態(tài)，觀察其是否能夠在不銹鋼片上形成不同密度的生物膜，試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.4 生物膜基因檢測 PCR 技術(shù)檢測金黃色葡萄球菌的成膜基因和黏附基因，分析被膜基因與表型之間的相關(guān)性。成膜基因包括：bap、icaA、icaD，黏附基因包括：fnbA、fnbB、clfA、clfB、can[8]。PCR 反應(yīng)體系為PrieSTAR mix 12.5 μL，模板2 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 補(bǔ)足25 μL。PCR擴(kuò)增條件見表5。將反應(yīng)好的PCR 產(chǎn)物吸取5 μL 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測（121 V，30 min）后，觀察目的條帶。

1.3.5 MLST 分型 根據(jù)MLST 數(shù)據(jù)庫（https：//pubmlst.org/organisms/staphylococcus-aureus/primers）提供的7 對管家基因（arcC，aroE，glpF，gmk，pta，tpi和yqiL）的引物序列及條件進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，將反應(yīng)好的PCR 產(chǎn)物送至有康生物科技有限公司進(jìn)行雙向測序。將返回的測序結(jié)果使用DNASTAR軟件進(jìn)行拼接后，上傳至金黃色葡萄球菌多位點(diǎn)分型數(shù)據(jù)庫，以檢索出等位基因譜和相應(yīng)的ST型。若上傳的數(shù)據(jù)無法檢索出部分等位基因型或檢索出全部等位基因型，而無相應(yīng)的ST 型，則需在該網(wǎng)站中上傳序列和等位基因譜。

表1 PCR 擴(kuò)增引物序列及退火溫度Table 1 PCR primer sequence and annealing temperature

1.3.6 MLST 分組和聚類分析 使用PHYLOViZ v2.0a 軟件，基于goeBURST 算法將分離株的ST型分為不同的BGs（BURST group），達(dá)到分組和聚類的作用。

1.3.7 分離株遺傳進(jìn)化分析 使用MEGA11 軟件將本研究得到的ST 型與國內(nèi)3 種醫(yī)源性ST 型（ST6754 食物中毒分離、ST4957 皮膚感染傷口拭子、ST7064 菌血癥）、3 種動(dòng)物源型ST 型（ST7181奶牛乳腺炎、ST6556 健康豬、ST6267 牦牛）和3 種食源性ST 型（ST6650 雞肉、ST5715 豬肉、ST5731涼面）結(jié)合分析，以研究分離株的遺傳特性。

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法 使用Excel、SPSS 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理與分析，PHYLOViZ v2.0a 軟件進(jìn)行聚類分析，MEGA11 軟件進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 剛果紅定性結(jié)果

剛果紅瓊脂試驗(yàn)中，84.93%（62/73）的菌株為生物膜陽性菌株，夏季和冬季分離株的差異不大，2 株冷藏樣品分離株均為生物膜陽性，15.07%（11/73）的菌株為生物膜陰性菌株，夏季分離株的陰性檢出率明顯高于冬季（表2）。

表2 剛果紅瓊脂試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Congo red test results

2.2 96 孔微量板定量檢測

對73 株菌進(jìn)行96 孔微量板定量檢測，形成強(qiáng)黏附菌株最多，占61.64%（45/73），中黏附菌株占20.55%（15/73），弱黏附菌株占12.33%（9/73），不黏附即不形成生物膜的菌株最少，占5.48%（4/73）。夏季、冬季和常溫樣品菌株的強(qiáng)黏附能力菌株數(shù)均最多，不黏附的菌株最少。2 株冷藏樣品分離株中，1 株為不黏附，1 株為中黏附（表3）。

表3 96 孔微量板定量檢測結(jié)果Table 3 Quantitative detection results of 96-well microplate

2.3 生物膜掃描電鏡結(jié)果

利用掃描電鏡更為直觀的確定上述方法中的菌株是否能在鋼板糙面上黏附，形成不同密度的菌體細(xì)胞。黏附能力強(qiáng)的菌株能在鋼板上形成致密的細(xì)胞（圖1a），中等成膜能力的菌株在鋼板上數(shù)量中等（圖1b），形成弱生物膜的菌在鋼板上數(shù)量最少，分布稀疏（圖1c），圖1d 為空白對照。

圖1 掃描電鏡下金黃色葡萄球菌的形態(tài)Fig.1 Morphology of S.aureus under scanning electron microscope

2.4 生物膜基因檢測結(jié)果

73 株菌均攜帶生物膜基因，fnbA、clfB檢出率最高，為100%。成膜基因icaA、icaD和bap的檢出率分別為30.14%，93.15%和0。黏附基因fnbB、clfA、cna、檢出率分別為95.89%，86.30%，46.58%。夏季檢出率較高的基因?yàn)閒nbA、clfB、fnbB、icaD、clfA。冬季菌株中，fnbA、fnbB、clfB、icaD檢出率最高（表4）。

表4 金黃色葡萄球菌生物膜基因檢出情況Table 4 Detection of biofilm genes of S.aureus

多重生物膜基因結(jié)果顯示，12.33%菌檢出4種生物膜基因，38.36%的菌檢出5 種生物膜基因，34.25%的菌檢出6 種生物膜基因，15.07%的菌檢出7 種生物膜基因（表5）。

表5 金黃色葡萄球菌多重生物膜基因攜帶情況Table 5 Carrying status of multiple biofilm genes of S.aureus

2.5 金黃色葡萄球菌MLST 分型情況

73 株金黃色葡萄球菌有11 株未能分型，占15.07%，夏季6 株，冬季5 株，其余分離株分為26個(gè)ST 型，其中7 個(gè)ST 型是本研究首次發(fā)現(xiàn)并上傳至數(shù)據(jù)庫，分別是：ST6770、ST6771、ST6772、ST6775、ST6781、ST6782、ST6990。

在已分型的菌株中，ST188（16.13%，10/62），ST88（14.52%，9/62），ST15（12.90%，8/62），ST398（9.68%，6/62）4 種ST 型的檢出率相對較高。26 個(gè)ST 型中有31 株菌無克隆群（50.79%），其余菌株分為6 個(gè)克隆群，CC1（24.19%，15/62）、CC15（16.13%，10/62）、CC5（6.45%，4/62）、CC8（1.61%，1/62）、CC22（1.61%，1/62）（表6）。

表6 73 株金黃色葡萄球菌MSLT 分型分析Table 6 MSLT typing analysis of 73 strains of S.aureus

2.5.1 不同季節(jié)分離株MLST 分型情況 不同季節(jié)生鮮豬肉中金黃色葡萄球菌MLST 分型情況見表7，夏季37 株分離株共有20 種ST 型，優(yōu)勢ST型有5 種：ST1、ST88、ST398、ST188 和ST25。冬季36 株分離株共有12 種ST 型，優(yōu)勢ST 型有5 種：ST188、ST15、ST88、ST6、ST398。兩個(gè)季節(jié)的優(yōu)勢ST 型數(shù)量一致，冬季優(yōu)勢ST 型涵蓋的菌株數(shù)量明顯多于夏季，而夏季分離株的ST 型明顯多于冬季。值得注意的是ST398、ST88、ST188 在兩個(gè)季節(jié)中均為優(yōu)勢ST 型。

表7 不同季節(jié)分離株MLST 分型情況Table 7 Types of MLST isolates in different seasons

7 個(gè)新的ST 中，ST6770、ST6771、ST6781、ST6772、ST6990 在夏季分離株中被檢出，ST6782、ST6775 在冬季分離株中被檢出。

2.5.2 不同季節(jié)分離株克隆群分析 對金黃色葡萄球菌進(jìn)行MLST 分型后，可得到分離株的克隆群，食品中最常見的克隆群包括CC5，所含菌株有較強(qiáng)的致病性。本研究中，夏季共計(jì)5 種克隆群，CC1 和CC5 是優(yōu)勢克隆群；冬季共計(jì)3 種克隆群，CC15、CC1 所含菌株數(shù)較CC5 多。

2.6 基于goeBURST 算法的進(jìn)化分析

對73 株分離株的26 個(gè)ST 進(jìn)行分組和聚類，在SLV＝1 的條件下，分為5 個(gè)BGs（BG1、BG2、BG3、BG4、BG5）和8 個(gè)單體，5 個(gè)BGs 共含有42株菌。BG3 以ST2139 首要奠基者（Primary founder），包括5 種ST 型，17 株菌，其中7 株夏季分離株，10 株冬季分離株；BG4 以ST15 首要奠基者，包括4 種ST 型，11 株菌，其中夏季分離株僅占1 株，冬季分離株有10 株，4 個(gè)ST 型可能由ST15 演化而來；BG5 以ST398 首要奠基者，包括3種ST 型，8 株菌，夏季分離株占6 株，冬季分離株占2 株；BG1 和BG2 分別以ST5730 和ST59 為奠基者，均包括3 種ST 型和3 株夏季分離株。

總體上，BG1 和BG2 全部為夏季分離株，BG3兩個(gè)季節(jié)分離株差異不大，BG4 以冬季分離株為主，BG5 以夏季分離株為主（圖2）。

圖2 不同季節(jié)分離株MLST 分型情況Fig.2 Types of MLST isolates in different seasons

2.7 分離株遺傳進(jìn)化分析

如圖3 所示，結(jié)果顯示，分離株與參考ST 型的相關(guān)性很強(qiáng)，ST6 為代表的3 株菌與浙江省涼面分離株的親緣關(guān)系最近，ST88 為代表的9 株菌與上海市醫(yī)院從女性皮膚感染傷口拭子分離株的親緣性最近，ST9 為代表的1 株菌與河南省豬肉中的分離株親緣關(guān)系最近，而二者的克隆群不同，湖北省健康豬中的ST 型與本研究中的ST6990 親緣關(guān)系最近，推測豬肉中該ST 型的分離株可能直接來自生豬本身。值得注意的是，ST59 為代表的2株菌與北京食物中毒分離株的ST 型親緣最近，表明這兩株菌有導(dǎo)致食物中毒的風(fēng)險(xiǎn)，四川牦牛、奶牛乳腺炎中的ST 型也與部分菌株有一定的相關(guān)性。有研究表明，ST5 是我國醫(yī)院環(huán)境中分離率最高ST 型之一[11]，本研究中ST5 與ST188 親緣關(guān)系最近，推測ST188 可能來源于醫(yī)院環(huán)境，ST5 與ST188 共分離得到11 株菌，這些分離株可能與醫(yī)院環(huán)境有關(guān)。

圖3 分離株遺傳進(jìn)化分析Fig.3 Genetic evolution analysis of isolates

表8 不同季節(jié)分離株克隆群分析Table 8 Clonotype analysis of isolates in different seasons

3 討論

剛果紅瓊脂法測定金黃色葡萄球菌生物膜形成能力的準(zhǔn)確性，在國內(nèi)外部分研究中有一定爭議，Knobloch 等[12]、郭慧琴等[6]、錢衛(wèi)東等[13]的研究表明，剛果紅瓊脂法與96 孔微量板法、平板培養(yǎng)法測定結(jié)果的相關(guān)性不強(qiáng)；而閆兵等[14]研究證明，二者得到的結(jié)果基本一致。因此，本研究中，利用剛果紅瓊脂法、96 孔微量板法與掃描電鏡相結(jié)合，從定性、定量到驗(yàn)證的流程進(jìn)行測定。剛果紅瓊脂法試驗(yàn)中陽性成膜菌株占84.93%，與Demir等[1]從慢性創(chuàng)面感染中分離的金黃色葡萄球菌的陽性率較為一致（86.61%），而高于陳程等[15]從牛乳中分離的金黃色葡萄球菌的黏附率（72%），低于張鵬飛等[16]的黏附率（95.45%），可能與菌株來源以及試驗(yàn)誤差有一定關(guān)系。96 孔微量板定量檢測法中，強(qiáng)、中、弱成膜能力的菌株占比為94.52%，與剛果紅法在數(shù)據(jù)上有一定差異，這與剛果紅法結(jié)果的低重現(xiàn)性和96 孔微量板法洗板力度有較大關(guān)系。通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，不同黏附能力的菌株確實(shí)在鋼板上形成了不同程度的聚集，因此前兩種方法在一定程度上能夠起到對菌株的前期篩選作用，而筆者認(rèn)為在用專業(yè)的洗板機(jī)沖洗96孔板的條件下，96 孔微量板法更準(zhǔn)確。此外，培養(yǎng)溫度、時(shí)間、狀態(tài)、培養(yǎng)基組成等均是影響其成膜率的重要因素。Thiran 等[17]將不同菌株接種在聚苯乙烯組織培養(yǎng)板上，不同溫度（37，20 ℃）培養(yǎng)不同時(shí)間（24，48，72 h）發(fā)現(xiàn)，37 ℃培養(yǎng)24 h 后，54%的菌株無法產(chǎn)生被膜，20 ℃培養(yǎng)48 h 和72 h 后均有70.80%的菌株無法產(chǎn)生被膜，同時(shí)該研究還表明，在動(dòng)態(tài)培養(yǎng)條件下更有利于被膜的形成；Lade 等[18]發(fā)現(xiàn)添加1.0%葡萄糖的TSB 更利于金黃色葡萄球菌生物膜形成的生長和試驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)，而添加氯化鈉的培養(yǎng)基導(dǎo)致生物膜形成的測量結(jié)果有很大差異。

在成膜基因和黏附基因PCR 試驗(yàn)中，成膜基因icaA、icaD和bap的檢出率分別為30.14%，93.15%和0，其中，bap基因的檢出率與Chen 等[19]和馬伊薩蘭等[20]的研究結(jié)果一致，而icaA、icaD的檢出率低于Demir 等[1]從創(chuàng)面分離得到的菌株檢出率，這可能是創(chuàng)面分離株的致病性更強(qiáng)導(dǎo)致相應(yīng)基因的檢出率較高。Pereyra 等[21]研究證明，icaA、icaD的高檢出率與生物膜的形成有必然關(guān)系。在本研究中，icaA的檢出率低，有5.48%（4/73）的菌株在剛果紅瓊脂平板和96 孔板培養(yǎng)中均為生物膜陽性，而icaA和icaD基因未檢出，一種原因是依賴于icaB和icaC形成被膜，另一種原因是ica非依賴性生物膜的調(diào)控系統(tǒng)所致，涉及雙組分系統(tǒng)（Tcs）和轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，包括RNA分子[22]，同時(shí)其黏附基因也是一個(gè)重要因素。纖維連接蛋白結(jié)合蛋白基因fnbA和fnbB的檢出率為100%和95.89%，主要介導(dǎo)金黃色葡萄球菌與纖維蛋白原、彈性蛋白和纖維連接蛋白的黏附；針對生鮮豬肉中clfA、clfB基因的研究極少，在本研究中其檢出率為86.30%和100%。

在MLST 分型試驗(yàn)中，ST188、ST88、ST15、ST398 的檢出率最高，26 個(gè)ST 型分為5 個(gè)BGs，BG1 和BG2 全部為夏季分離株，然而由于二者涵蓋的菌株數(shù)較少，因此代表性并不強(qiáng)；BG4 和BG5涵蓋的菌株較多，至于BG4 以冬季分離株為主，BG5 以夏季分離株為主的原因有待進(jìn)一步探究。在系統(tǒng)發(fā)育樹分析中，部分分離株與食源性、醫(yī)源性、動(dòng)物源性的分離株的相關(guān)性很大，存在即食食品中分離株與豬肉交叉污染，致病性強(qiáng)的菌血癥分離株，以及食物中毒菌株與豬肉交叉污染，生鮮豬肉中的分離株有直接來自生豬的可能。研究表明，金黃色葡萄球菌通過水平基因轉(zhuǎn)移方式獲得耐藥、定植和感染相關(guān)因子，可能是某一克隆株能成功流行的重要原因，細(xì)菌遺傳背景、外部條件等都會影響克隆群流行傳播[23-24]。同時(shí)，本研究中少部分ST 型與參考ST 型親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，原因可能與筆者選擇的參考ST 型有關(guān)，或二者的親緣關(guān)系本身就較遠(yuǎn)。