步 營，何圣琪，王 飛，朱文慧，勵建榮，李學鵬*，林 洪，郭曉華

（1 渤海大學食品科學與工程學院 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯(lián)合工程研究中心 遼寧錦州 121013 2 中國海洋大學食品科學與工程學院 山東青島 266003 3 山東美佳集團有限公司 山東日照 276800）

珍珠龍膽石斑魚（Epinephelus lanceolatus♀×Epinephelus fuscoguttatus♂）是近幾年通過龍膽石斑魚和老虎斑雜交產(chǎn)生的石斑魚新品種，具有生長快速和抵抗力強的雜交優(yōu)勢，是一種極具潛力的商業(yè)養(yǎng)殖品種。珍珠龍膽石斑魚適宜生長于溫暖的水域，其必需氨基酸指數(shù)高達0.99，為優(yōu)質(zhì)蛋白源，脂肪酸中多不飽和脂肪酸的占比較高，肉質(zhì)鮮美，經(jīng)濟價值高，市場前景好[1-3]。我國的石斑魚養(yǎng)殖主要集中在東海南部及南海各沿岸，福建、廣東及海南的石斑魚養(yǎng)殖量占我國石斑魚總量的95%以上[4]。由于分布地區(qū)不均勻，因此難以滿足市場需求。石斑魚性格暴躁，背部和腹部有尖刺，運輸過程中的振動及擁擠，容易造成應激反應，不利于?；钸\輸[5]。無水?；罴夹g是對水產(chǎn)運輸方式的一次巨大革命，是通過預冷或麻醉誘導魚體休眠，然后在低溫、無水及潮濕的環(huán)境下長時間保鮮運輸，該技術具有投入低、運輸效率高、死亡率低、環(huán)境污染小等優(yōu)點，其主要原理是利用麻醉、電擊、梯度降溫等方式，誘導魚類緩慢進入半休眠或完全休眠狀態(tài)[6-8]。人們對水產(chǎn)品的肌肉品質(zhì)評價中，質(zhì)地是其主要的評價指標[9]。質(zhì)構能夠反映魚肉的質(zhì)地，該指標受到很多條件的影響，例如魚的品種、生活習性、脂肪含量、蛋白質(zhì)含量、環(huán)境溫度及pH 等。王彩霞等[10]研究發(fā)現(xiàn)隨著?；顣r間的延長，加州鱸肌肉的硬度、膠黏性、咀嚼性有所下降。肌肉的持水力是指肌肉對水分的保持能力，持水力弱，大量水分流失會導致商品質(zhì)量損失及小分子物質(zhì)隨水分流失，降低魚肉品質(zhì)。而水分顯著影響肌肉的色澤及硬度，失水過多會導致肌肉的色澤暗淡無光，同時肌肉的硬度上升。在無水運輸后，持水性變化與?；畹臈l件及魚的品種有關。Refaey 等[11]發(fā)現(xiàn)在有水運輸24 h 后，肌肉的水、脂肪和能量含量顯著降低，肌肉pH 值和剪切力在0 h 時顯著降低，24 h 后升高，72 h 后再次降低，168 h 時再次升高。而Wang 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，運輸后中華鱘的持水性在無水?；詈鬅o顯著變化。Fan 等[13]探究了石斑魚低溫無水?；钸^程中的能量代謝與氧化應激的規(guī)律。本課題組前期研究亦發(fā)現(xiàn)，隨著無水?；顣r間的延長，石斑魚魚肉中糖原含量逐漸降低。目前，如何快速鑒定石斑魚的?；顣r間以及如何通過檢測糖原含量鑒定石斑魚無水?；顮顟B(tài)尚未見報道。

近紅外光譜（Near infrared spectroscopy，NIRS）技術是一種快速無損檢測物質(zhì)含量和鑒別物質(zhì)的現(xiàn)代分子光譜分析技術。近紅外區(qū)域是指波長在780～2 526 nm 范圍的電磁波，是人們最早發(fā)現(xiàn)的非可見光區(qū)域。近紅外光譜分析技術是一種間接的定性及定量分析技術，可以通過建立的預測模型在幾十秒甚至幾秒內(nèi)測定一個樣品的幾種甚至幾十種物質(zhì)或濃度數(shù)據(jù)[14-15]。若能利用近紅外光譜技術建立一個快速預測模型來預測石斑魚中的糖原含量，便能夠鑒定石斑魚無水?；顣r間和保活狀態(tài)，加大應用范圍。

本文研究石斑魚無水?；钸^程中的肌肉品質(zhì)變化，應用近紅外光譜分析技術建立石斑魚無水?；畹亩ㄐ苑治瞿Ｐ图疤窃糠治瞿Ｐ?，旨在快速、無損、精確檢測魚體的?；顣r間及糖原含量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

珍珠龍膽石斑魚，購于錦州市林西路水產(chǎn)市場。挑選健康、無疾病，體表完好的石斑魚作為試驗樣品，體質(zhì)量（800±50）g，1 齡，充氧運輸至實驗室后，將其放入人工海水中（22 ℃），暫養(yǎng)水溫為（22±0.5）℃，溶解氧質(zhì)量濃度為6 mg/L，鹽質(zhì)量分數(shù)為（27±2）‰，暫養(yǎng)24 h 以消除應激反應。

葡萄糖和蒽酮，北京索萊寶科技有限公司；氫氧化鉀，濱化集團股份有限公司；氯化鉀，福晨（天津）化學試劑有限公司。上述試劑均為分析純級。

1.2 儀器與設備

MS105DU 型分析天平、PE28 型pH 計，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UV2550 型紫外-可見分光光度計，日本島津公司；PEN3 型電子鼻，德國Airsense 公司；PQ001 型低場核磁共振分析儀，上海紐邁電子科技有限公司；TA.XT plus 型質(zhì)構儀，英國Stable Micro Systems 公司；2600XTR型近紅外分析儀，美國Unity 公司；HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司；Biofuge Stratos 型高速冷凍離心機，美國賽默飛公司；BSC-250 生化培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 質(zhì)構測定 取石斑魚魚肉測定TPA，參數(shù)：探頭類型p/5，測前速度3 mm/s，測試速度0.5 mm/s，測后速度3 mm/s，壓縮比例50%，感應力5.0 g，測定時間5 s。選取硬度、彈性、咀嚼、回復性、黏聚性進行質(zhì)構分析。

1.3.2 pH 測定 稱取5 g 石斑魚肉，絞碎，添加45 mL 蒸餾水，高速均質(zhì)機均質(zhì)，室溫靜置30 min，取上清液，用pH 計測定。

1.3.3 離心損失 取3 g 樣品包裹在濾紙中，離心前稱重，記為m1。將其轉移至50 mL 離心管中，以4 ℃，3 000 r/min 條件下離心10 min，用濾紙吸附魚肉表面水分，稱重，記為m2。計算離心損失。

1.3.4 蒸煮損失 取10 g 解凍后的肉樣，記為M3，放入蒸煮袋中封口，置于85 ℃水浴鍋中加熱25 min，待溫度降至室溫，用濾紙吸附魚肉表面水分，稱重，記為M4。計算蒸煮損失。

1.3.5 低場核磁分析 低場核磁共振分析條件參考年琳玉[16]的方法并稍作修改。將魚肉切成2 cm×1 cm×1 cm，置于直徑15 mm 的核磁管中。具體測試條件：采用Carr-Purcell-Meiboom-Gill 脈沖序列測定凝膠樣品的橫向弛豫時間T2。SFI=22 MHz，P90=14 μs，SW=200 kHz，TR=2 000 ms，NS=8，τ=200 μs，Echocnt=4 000。所得CPMG 指數(shù)衰減曲線采用儀器自帶的軟件進行反衍，得到T2圖譜。

1.3.6 肌糖原的測定 參考依鴻莉等[17]的方法，糖原采用蒽酮比色法測定。準確稱取2.0 g 魚肉樣品，剪碎后加入4 mL 30%KOH 溶液，沸水浴消化20 min，取出后冷卻至室溫，加入20 mL 無水乙醇，3 000×g 離心15 min，取沉淀后棄上清液，向沉淀中加10 mL 蒸餾水、0.05 mL 飽和KCl 和15 mL無水乙醇，攪拌溶解沉淀物質(zhì)，3 000×g 離心15 min 后棄上清液，攪拌使沉淀溶解并定容10 mL，靜置10 min 后取50 μL 糖原稀釋液加入4.5 mL蒸餾水，再取0.5 mL 糖原稀釋液加入2 mL 蒽酮顯色液，混勻后冷卻，在沸水浴中反應10 min，取出，用流水快速冷卻，靜置10 min，于波長620 nm處測定其吸光度。

1.3.7 近紅外光譜采集 將制備好的魚肉樣本均勻置于紅外光譜儀的石英比色皿上，確保比色皿表面被魚肉樣品完全覆蓋。光譜采集條件為波長680～2 600 nm，掃描次數(shù)24 次。分為鮮樣、0，3，6，9，12 h 組，每組設置20 個樣品，共計120 組樣品。每組樣品平均采集3 次，取平均值作為原始近紅外光譜數(shù)據(jù)。

1.3.8 SIMCA 模型的建立 將樣品按照3∶1 的比例分成校正集和驗證集，利用分析建模軟件The Unscrambler 10.4 分別在6 個?；顣r間的魚肉樣品中隨機挑選90 個樣本作為訓練集，對其進行主成分分析（Principal component analysis，PCA），得到聚類分析的模型。剩下的30 個樣本作為預測樣本，建立SIMCA 模型，用于檢驗模型的可靠性。

1.3.9 肌糖原定量分析模型的建立 用采集的近紅外譜圖與紫外-可見分光光度計測定的糖原數(shù)據(jù)建立偏最小二乘（Partial least squares，PLS）定量分析模型。為消除背景干擾，采用Savitzky-Golay 平滑（SG）、歸一化（Normalization）、標準歸一化（Standard normal variate，SNV）、多元散射校正（Multiplicative scatter correction，MSC）、基線校正（Baseline correction，BC）、均值中心化（Mean centering）等方式對原始光譜進行預處理。

1.3.10 模型的評價 采用驗證集樣品對最終模型進行外部驗證，用判別率指標評價SIMCA 定性模型。通過校正集相關系數(shù)（Correction determination coefficents，Rc2）和校正集均方根差（Root mean squared error of calibration，RMSEC）判斷模型的質(zhì)量，一般Rc2越大，近紅外分析結果與化學分析結果越吻合，可信度越高。采用驗證集相關系數(shù)（Determination coefficient，Rc2）和驗證集均方根誤差（Root mean squared error of validation，RMSEP）判斷模型的精確性，當Rc2越大，RMSEP越小，說明模型的準確度越高，模型的預測能力越好。作為糖原定量分析模型的評判指標。

1.3.11 數(shù)據(jù)分析 對每個樣品做3 次平行試驗，使用軟件SPSS 19.0 進行正交試驗數(shù)據(jù)分析，結果用“平均值±標準差”表示。用Origin 9.1 作圖，The Uscrambler 10.4 進行光譜預處理及模型的構建。

2 結果與分析

2.1 石斑魚無水?；钸^程中的質(zhì)構變化

質(zhì)構反映魚肉組織的特性變化，是評判魚肉品質(zhì)的重要指標[18]，因此測定質(zhì)構對判斷魚肉品質(zhì)的好壞及變化很有必要。由表1 可知，與鮮樣對比，?；?，3，6，9 h 和12 h 后，魚肉的硬度、彈性、咀嚼度和黏聚性顯著降低（P＜0.05），回復性無顯著變化。這可能是由于低溫條件下魚體受到一定的脅迫，提高了魚體的能量代謝，肌肉中的能量物質(zhì)發(fā)生分解，造成成分變化，導致其硬度、彈性、咀嚼度和黏聚性降低[6，19]。

表1 不同?；顣r間的珍珠龍膽石斑魚魚肉質(zhì)構的變化Table 1 The changes in texture of the fish of pearl gentian grouper with different survival time

2.2 石斑魚無水保活過程中的pH 變化

新鮮的魚肉pH 偏弱堿性，pH 值急劇降低會影響魚肉的新鮮度[20]，且pH 變化會引起機體酸堿發(fā)生變化，增加肝臟功能的負擔，甚至造成損傷[21]。由圖1 可以看出，保活12 h 后，pH 值由7.0降至6.7，顯著低于鮮樣的pH 值（P＜0.05）。這可能是因為持續(xù)的低溫及饑餓刺激魚體對能量需求增加，糖原和脂肪等儲能物質(zhì)被細胞分解用于供給能量，由于無水環(huán)境下只能通過皮膚進行微弱的呼吸，使有氧代謝受到較大程度的抑制，無氧呼吸增加，而通過無氧呼吸產(chǎn)生能量時，不可避免地生產(chǎn)乳酸，從而造成魚肉的pH 值下降[22-23]。

圖1 不同保活時間的珍珠龍膽石斑魚魚肉pH 值的變化Fig.1 The changes in pH of pearl gentian grouper with different keep alive time

2.3 石斑魚無水?；钸^程中持水力的變化

持水力是指肌肉保持水分的能力，影響肉的嫩度、硬度、營養(yǎng)成分及滋味等，能夠快速、準確表明魚肉品質(zhì)的變化。持水力的強、弱主要與蛋白質(zhì)三維網(wǎng)狀結構和變性程度相關[24]。通常用離心損失和蒸煮損失表示持水力的大小，由圖2a、2b 可知無水保活后，魚肉的離心損失率與蒸煮損失率均顯著升高，這表明其持水力顯著下降。可能是因為肌肉pH 下降，導致部分蛋白質(zhì)分解、變性，大分子的空間網(wǎng)絡結構發(fā)生變化，減少了水和蛋白質(zhì)的相互作用，從而降低其水分保持能力[25-26]。

圖2 不同?；顣r間的珍珠龍膽石斑魚魚肉持水力的變化Fig.2 The changes in water retention capacity of pearl gentian grouper with different keep alive time

2.4 石斑魚無水?；钸^程中水分分布變化

低場核磁共振技術可以測量質(zhì)子弛豫，在食品加工領域經(jīng)常被用來檢測水的遷移和肌肉結構的變化[27-28]，在肉品中水分被分為3 種相態(tài)，分別為結合水（T21，0.01～10 ms）、不易流動水（T22，10～100 ms）和自由水（T23＞100 ms）。弛豫峰面積變化可以反映不同相態(tài)水分的相對含量，其變化情況可以表征各相態(tài)水分群的流動遷移情況[23]。由圖3及表2 可知，與新鮮石斑魚相比，經(jīng)無水?；?2 h 后，T22的峰面積減少了2.53%，T23的峰面積增加了111.63%，表明魚肉中不易流動水含量下降，自由水含量增加，說明?；钸^程中不易流動水向自由水方向轉化，水分的流動性增強。

圖3 不同保活時間的珍珠龍膽石斑魚魚肉水分分布變化Fig.3 Changes of water distribution in pearl gentian grouper with different keep alive time

表2 ?；钸^程中石斑魚橫向弛豫時間T2 峰面積比例的變化Table 2 Changes in the area ratio of T2 peak of lateral relaxation time in grouper during waterless preservation

2.5 不同保活時間的石斑魚魚肉的肌糖原含量

糖原是魚體的主要儲備能源，包括肝糖原和肌糖原，在?；钸\輸過程中作為能源物質(zhì)被消耗。圖4 顯示不同無水?；顣r間的肌糖原含量變化，從?；? h 至12 h，肌糖原含量呈下降趨勢。無水?；钸^程中，由于缺氧，珍珠龍膽石斑魚肌肉中的糖原由有氧代謝轉化為無氧代謝，糖原經(jīng)無氧酵解產(chǎn)生乳酸，因此導致無水?；钸^程中肌糖原含量下降。

圖4 不同?；顣r間的石斑魚的肌糖原含量Fig.4 The content of muscle glycogen in pearl gentian grouper during waterless preservation

2.6 不同?；顣r間的石斑魚魚肉的紅外光譜分析

圖5 為石斑魚的近紅外原始光譜。不同?；顣r間的石斑魚魚肉樣本的近紅外光譜譜線相近，形狀大致相同，不完全重合，吸光值強度在0.45～3.05 之間，在波長970，1 190，1 440，1 910，2 530 nm 處有強烈的吸收峰。研究表明，近紅外光譜不同波段代表的信息不同，波長1 501 nm 為OH 伸縮振動和NH 伸縮振動的一級倍頻吸收帶，在1 400 nm 處為水的吸收帶，1 728 nm 處是脂肪分子中CH 基團伸縮振動一級倍頻吸收帶[29]。魚肉中的水分含量大于70%，在1 400 nm 處吸收峰非常明顯，在1 934～2 040 nm 范圍是N-H 鍵伸縮振動產(chǎn)生的合頻峰，反映魚肉中與蛋白質(zhì)或氨基酸相關組分的含量信息，而1 100～1 400 nm 和2 200～2 400 nm 是C-H 鍵的合頻和一級倍頻峰，可以指示與碳水化合物及脂肪有關的含量信息[30]。因脂肪、水分含量及碳水化合物含量均與肌肉的品質(zhì)有關，故這些吸收峰的變化對預測結果的準確性尤其重要。

圖5 不同?；顣r間的珍珠龍膽石斑魚魚肉近紅外原始光譜圖Fig.5 The original near-infrared spectra of pearl gentian grouper with different keep alive time

2.7 SIMCA 定性模型分析

在光譜掃描范圍，取90 個石斑魚魚肉樣本的近紅外光譜，對這些光譜數(shù)據(jù)組成的矩陣進行主成分分解，以其前2 個得分向量作圖，結果見圖6。X 軸為樣本的第1 主成分PC1，Y 軸表示樣本第2 主成分PC2，圖中不同形狀和顏色的圖標分別代表不同?；顣r間的魚肉，PCA 定性描述了不同?；顣r間的石斑魚魚肉間的特征差異?？梢钥闯鲺r樣，0，3，12 h 幾個組的樣品有較好的聚類效果，而6 h 和9 h 的魚肉光譜雖有一定的重疊性，但重疊不明顯。這可能是由于在石斑魚?；? h前，生存環(huán)境發(fā)生變化，為適應環(huán)境，魚體消耗大量糖原為機體供能，導致前期糖原含量下降明顯，6 h 到9 h 時，魚體中糖原消耗速率較低，而?；顣r間12 h 后，糖原含量處于一個較低的水平。反映在主成分圖上則表現(xiàn)為6 h 和9 h 的糖原含量差異較小，導致區(qū)分度有所下降，且鮮樣，0，3 h 與12 h 相聚較遠，能夠被較好地區(qū)分識別。

圖6 不同?；顣r間的珍珠龍膽石斑魚魚肉的主成分分析Fig.6 Principal component analysis of pearl gentian grouper with different keep alive time

表3 為SIMCA 對不同?；顣r間石斑魚魚肉的判別率。鮮樣，0，3 h 下判別率均達到100%，而保活6 h 和9 h 的判別率為80%。SIMCA 可區(qū)分不同?；顣r間的30 個石斑魚樣品，出現(xiàn)2 個錯判現(xiàn)象，正確判別率93.3%，說明近紅外譜具有區(qū)分不同?；顣r間的魚肉的能力。

表3 珍珠龍膽石斑魚魚肉保活時間的SIMCA 判別的有效性（n=5）Table 3 Validity of SIMCA discrimination of pearl gentian grouper（n=5）

2.8 肌糖原定量模型分析

為了得到準確可靠的分析結果，對光譜數(shù)據(jù)進行預處理是十分必要的。為校正光譜數(shù)據(jù)，建立更簡單、更穩(wěn)健的回歸模型，常采用Savitzky-Golay 平滑（SG）、歸一化（Normalization）、多元散射校正（Multiplicative scatter correction，MSC）、基線校正（Baseline correction，BC）、均值中心化（Mean centering）等預處理方法對原始光譜圖進行處理[31-32]。數(shù)學預處理可以減少干擾，改善待分析化合物的化學信號[33]。圖7 為不同預處理的紅外譜圖，可以看出MSC、Mean Centering 和SNV 在簡化譜的復雜性和增加模型預測方面效果很好。表4 為以不同預處理方式對原始光譜進行預處理后，構建PLS 糖原定量模型所得評價結果。經(jīng)Mean centering 預處理的模型的RMSEP 值最?。?.24），Rp2值最大（0.89），說明該模型的準確度最高，模型的預測能力最好。圖8 為石斑魚近紅外光譜經(jīng)Mean Centering 處理后，肌糖原的真實值和預測值的相關關系圖。相關性方程y=0.9522x＋0.0523，相關系數(shù)R2為0.9408，表明其具有較好的預測能力和定標關系。

圖7 不同預處理的紅外光譜圖Fig.7 Near infrared spectra with different pretreatments

圖8 珍珠龍膽石斑魚糖原含量真實值與預測值關系圖Fig.8 The relationship between the true value and the predicted value of glycogen content in pearl gentian grouper

表4 不同光譜預處理方法建立的珍珠龍膽石斑魚糖原PLS 分析結果Table 4 PLS analysis results of pearl gentian grouper glycogen established by different spectral pretreatment methods

2.9 肌糖原定量模型的外部驗證

利用驗證集中的樣品光譜代入建立的模型中，得到一系列預測值。將預測值和實測值進行比較，計算預測值與實際值的相對偏差，結果見表5。魚肉肌糖原模型測定值和真實值比較接近，預測值與實際值的相對偏差（Relative deviation，RD）在0.01～0.15 之間，這表明所構建的模型具有較好的預測能力，能較為準確地預測糖原含量，可用于?；詈笫唪~魚肉樣品糖原含量的快速檢測。

表5 珍珠龍膽石斑魚肌糖原含量模型外部驗證結果Table 5 External verification results of pearl gentian grouper glycogen content model

3 結論

對不同?；顣r間的石斑魚魚肉肌肉品質(zhì)的變化情況進行分析，隨著?；顣r間的延長，石斑魚魚肉的硬度和黏聚性顯著降低，pH 有所下降，離心損失率和蒸煮損失率有不同程度的增大。這表明在無水后，魚肉的品質(zhì)受到一定影響。低場核磁共振結果顯示魚肉中不易流動水含量下降，自由水含量增加，說明?；钸^程中不易流動水向自由水方向轉化，水分的流動性增強。

通過近紅外檢測技術結合化學計量學方法對不同保活時間的魚肉的紅外光譜進行分析，PCA和SIMCA 結合能夠實現(xiàn)對不同保活時間魚肉的判別分析，正確判別率達93.3%。通過Mean centering 預處理后建立的PLS 模型能夠用于?；詈篝~肉肌糖原的快速檢測。