吳 偉，吳俊汐，紀(jì)旭旭，劉 戟，劉 彬，耿福昌

(1.涼山州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院彝族醫(yī)藥研究所＆消化內(nèi)科，四川 西昌 615000；2.好醫(yī)生藥業(yè)集團(tuán)，四川 成都 610000；3.成都中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610000；4.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)實驗室，四川 成都 610041；5.睿美贊科技有限公司，四川 成都 610044)

根據(jù)世界衛(wèi)生組織2023年2月17日提交的最新數(shù)據(jù)提示，由SARS-CoV-2引起的新型冠狀病毒感染（coronavirus disease-2019，COVID-19）流行已造成全球范圍確診病例感染7.56億，死亡684多萬[1]。當(dāng)前，SARS-CoV-2已衍生出多種變體，如奧密克戎的系列變體，嚴(yán)重變異，具高度感染風(fēng)險[2]。目前疫苗能否有效預(yù)防這些新變體仍在研究中[3]?；诖?，一些國家針對預(yù)防和抗擊新型冠狀病毒感染也將替代療法納入了健康指南[4]。天然化合物具廣泛生物活性和治療特性，對新型冠狀病毒感染具潛在預(yù)防及治療作用[5]。故而，尋求有效且容易獲得的天然化合物作為新型冠狀病毒感染的替代和補充藥物，可能有助于預(yù)防和治療新型冠狀病毒感染。

SARS-CoV-2感染始于病毒S蛋白與細(xì)胞表面血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）的結(jié)合，這導(dǎo)致病毒顆粒的內(nèi)吞（細(xì)胞進(jìn)入）和病毒內(nèi)容物的釋放，以允許病毒復(fù)制[6]。分子對接研究表明，SARS-CoV-2的天然S蛋白還可以直接結(jié)合并激活 Toll樣受體（Toll like receptor，TLR）[TLR1、TLR4和TLR6]，這將導(dǎo)致核因子（NF）-κB[nuclear factor（NF）-κB，NFKB]通路的激活，從而上調(diào)抗病毒和促炎介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄[7]。當(dāng)免疫反應(yīng)不受控制時，會引發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴，并導(dǎo)致多器官衰竭[8]。這種激烈的炎性程度與新冠肺炎和肺損傷的嚴(yán)重程度以及高死亡率密切相關(guān)[9-11]。因此，阻斷S蛋白介導(dǎo)的SARSCoV-2細(xì)胞進(jìn)入對預(yù)防SARS-CoV-2感染至關(guān)重要，改善S蛋白介介導(dǎo)的細(xì)胞因子風(fēng)暴被認(rèn)為是預(yù)防新冠肺炎發(fā)展到更嚴(yán)重階段的關(guān)鍵治療方法。

據(jù)古籍記載，中國有一種古老的彝族醫(yī)藥防疫藥方。該方是彝族醫(yī)藥采用熏蒸法防治流行性傳染病的有效措施，至今仍經(jīng)常使用。青蒿和側(cè)柏葉是這一古老方劑的主要兩種藥材。體外研究表明，青蒿熱水提取物在體外對SARS-Cov-2變體顯示出強大的活性[12]。網(wǎng)絡(luò)、GO和KEGG分析表明，青蒿通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、增殖、分化和凋亡來應(yīng)對新冠肺炎[13]?；诰W(wǎng)絡(luò)的數(shù)據(jù)庫分析表明，側(cè)柏葉通過增強個人免疫力來管理和緩解呼吸道病毒感染，包括新冠肺炎[14]。

青蒿素和槲皮素是分別存在于青蒿和側(cè)柏中的主要生物活性化合物[15-16]。青蒿素在VeroE6細(xì)胞中測定的預(yù)處理或后處理抗SARS-CoV-2測定中顯示出優(yōu)異的效果（選擇性指數(shù)分別為35或54）[17]。槲皮素在VeroE6細(xì)胞中測定的抗SARS-CoV-2測定中也顯示出良好的效果（選擇性指數(shù)=39.81）[18]。因此，青蒿素和槲皮素作為彝族醫(yī)藥古代防疫方劑中的主要生物活性成分，單獨或聯(lián)合使用這兩種化合物都可能有效預(yù)防和治療新冠肺炎。

基于上述背景，我們的研究旨在調(diào)查：青蒿素和槲皮素單用或聯(lián)合使用是否可以通過抑制S新冠病毒刺突蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞因子風(fēng)暴來改善新冠肺炎。

1 材料和方法

1.1 Venn分析和富集分析 首先，將COVID-19、青蒿素和槲皮素分別輸入CTD數(shù)據(jù)庫，下載基因集。分別在這些基因組之間進(jìn)行Venn分析。其次，交叉部分的基因集被上傳到DAVID生物信息數(shù)據(jù)庫、PANTHER數(shù)據(jù)庫、GO（基因本體）數(shù)據(jù)庫、KEGG數(shù)據(jù)庫、Reactome數(shù)據(jù)庫和字符串?dāng)?shù)據(jù)庫。然后，對這些交叉基因進(jìn)行富集分析，以評估這些基因?qū)ι镞^程（BP）、分子功能（MF）、細(xì)胞成分（CC）和信號通路的影響。

1.2 細(xì)胞、藥品和試劑 Vero細(xì)胞來自四川大學(xué)生物化學(xué)和分子生物學(xué)實驗室。將細(xì)胞保存在補充有10% FBS的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM）中，并在 37℃下用5% CO2孵育。胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、Dulbecco's改良 Eagle（Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM）培養(yǎng)基和磷酸鹽緩沖鹽水（phosphate-buffered saline，PBS）購自 Gibco（Grand Island，NY，USA）。 吡咯烷二硫代氨基甲酸銨（Pyrrolidinedithiocarbamate ammonium，PDTC）、青蒿素和檞皮素從Solarbio獲得。Ebselen是從Beyotime購買的。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 將含有1 mL Vero E6細(xì)胞懸液凍存管在37℃水浴中快速搖晃解凍，加4 mL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基混合均勻；在1 000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，加1～2 mL培養(yǎng)基后用槍輕輕吹打混勻；將Vero E6細(xì)胞接種至細(xì)胞培養(yǎng)板，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；Vero E6細(xì)胞密度達(dá)80%～90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞活力測定 將細(xì)胞以適宜密度接種到96孔板內(nèi)培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到約70%～90%；吸出96孔板孔內(nèi)的培養(yǎng)基，加入適量PBS清洗細(xì)胞；而后使用無血清DMEM培養(yǎng)基和CCK8溶液配置反應(yīng)液（比例為10∶1），混合均勻后，每孔加入100 μL反應(yīng)液，并設(shè)置空白未鋪細(xì)胞對照孔加入100 μL反應(yīng)液，放置于37℃和5% CO2恒溫箱內(nèi)孵育1 h；在450 nm處測量吸光度。

1.5 NFKB p65轉(zhuǎn)錄活性測定 HEK293T-hACE2細(xì)胞用青蒿素、檞皮素、青蒿素+檞皮素或NFKB抑制劑PDTC預(yù)處理6 h，然后與SARS-CoV-2 S蛋白孵育18 h。用NFKB p65轉(zhuǎn)錄因子試劑盒分析核細(xì)胞部分的NK-κB轉(zhuǎn)錄因子活化。使用細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)蛋白提取試劑盒制備細(xì)胞質(zhì)和核細(xì)胞級分。通過BCA蛋白質(zhì)測定法測定蛋白質(zhì)濃度。將0～2 μg核提取物在涂有NFKB p65共有序列的孔中孵育1 h。第一次孵育后，洗滌孔并與NFKB p65的特異性一級抗體孵育1 h。與一級抗體孵育后，洗滌孔并與HRP綴合的二級抗體孵孵育1 h，然后洗滌。向孔中加入化學(xué)發(fā)光工作溶液，并使用光度計檢測所得信號。據(jù)報道，活性NFKB轉(zhuǎn)錄因子為每μg蛋白質(zhì)的化學(xué)發(fā)光。

1.6 使用ELISA試劑盒評估IL-1β、IL-18、IL-6和IL-8 如上（NFKB p65轉(zhuǎn)錄活性測定）所述處理HEK293T-hACE2細(xì)胞。收集培養(yǎng)上清液并以3 000 rpm離心20 min。根據(jù)說明完成試劑制備。將100 μL樣品稀釋劑、連續(xù)稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品和測試樣品作為零孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和測試樣品孔添加到微量滴定板中，并在37℃下孵育2 h。洗滌后，加入檢測抗體并在37℃下孵育1 h。與抗體孵育后，洗滌孔并與HRP綴合的二級抗體孵育40 min，然后洗滌。加入100 μL顯色溶液，在37℃的黑暗中顯色15～20 min后加入停止溶液，并使用波長為450 nm的微板讀數(shù)儀測量OD值。數(shù)據(jù)分析：需要從零井的OD值中減去每個標(biāo)準(zhǔn)和樣品的OD值。以標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行四參數(shù)擬合。根據(jù)樣品的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算擬合濃度，并乘以稀釋系數(shù)，以獲得樣品的測量濃度。

1.7 統(tǒng)計分析 結(jié)果以平均值±SD表示。Graphpad Prism 7.0軟件用于分析數(shù)據(jù)。通過Student的非配對t檢驗比較兩組之間的差異。通過單因素方差分析和事后Tukey檢驗分析不同組間的多重比較。P值小于0.05，被認(rèn)為是顯著的。

2 結(jié)果

2.1 Venn分析和富集分析 來自Gene或Pubchem數(shù)據(jù)庫的結(jié)果顯示，與新冠肺炎、青蒿素和槲皮素相關(guān)的基因集中，經(jīng)智人過濾的基因數(shù)分別為9 889、30和4 149。Venn分析結(jié)果如表1和圖1所示。對基因集1和基因集2、3或4之間的交叉基因進(jìn)行GO術(shù)語富集和通路富集分析的結(jié)果如下：1.新冠肺炎和青蒿素（24 BP，18 MF，0 CC，75 KEGG 途徑和 95 REACTOME通路），2.新冠肺炎和槲皮素（782 BP、139 MF、128 CC、208 KEGG 通路和 444 REACTOME通路），3.新冠肺炎和青蒿素+槲皮素（787 BP、145 MF、128 CC、208 KEGG 通路和 444 REACTOME 通路）。根據(jù)研究方向，篩選出富集分析結(jié)果中的重要相關(guān)項目（涉及炎癥和冠狀病毒病-COVID-19等），并顯示在表2-7中。

圖1 新冠肺炎和青蒿素+槲皮素之間兩組基因的維恩圖

表1 Venn分析

表2 新冠肺炎與青蒿素交叉基因的GO富集分析

表3 新冠肺炎與槲皮素交叉基因的GO富集分析

表4 新冠肺炎與青蒿素+槲皮素交叉基因的GO富集分析

表5 新冠肺炎與青蒿素交叉基因的通路富集分析

表6 新冠肺炎與槲皮素交叉基因的通路富集分析

表7 新冠肺炎與青蒿素+槲皮素交叉基因的通路富集分析

2.2 青蒿素或槲皮素對Vero E6或HEK293-ACE2細(xì)胞的細(xì)胞毒性 細(xì)胞毒性試驗結(jié)果表明：用濃度≤100 μM的青蒿素或槲皮素分別處理Vero E6或HEK293-ACE2細(xì)胞24 h，不會導(dǎo)致 Vero E6和HEK293-ACE2細(xì)胞活力顯著性降低（P＞0.05）（如圖2所示）。

圖2 青蒿素或槲皮素對Vero E6和HEK293-ACE2細(xì)胞活力的影響

2.3 SARS-CoV-2S蛋白通過介導(dǎo)NFKB的過度激活誘導(dǎo)細(xì)胞因子風(fēng)暴 基于圖3所示的數(shù)據(jù)，對結(jié)果的解釋如下：1）S蛋白可以通過以濃度依賴性方式介導(dǎo)NFKB的過度激活而顯著誘導(dǎo)細(xì)胞因子風(fēng)暴（aP<0.05）；2）NFKB抑制劑PDTC通過抑制S蛋白介導(dǎo)的NFKB的過激活而顯著逆轉(zhuǎn)細(xì)胞因子風(fēng)暴（bP<0.05）。

圖3 SARS-CoV-2S蛋白通過介導(dǎo)NFKB的過度激活而誘導(dǎo)細(xì)胞因子風(fēng)暴

2.4 青蒿素和槲皮素對SARS-CoV-2S蛋白介導(dǎo)的NFKB過度激活引發(fā)的細(xì)胞因子風(fēng)暴的逆轉(zhuǎn)作用

如圖4和圖5所示，結(jié)果如下：1）S蛋白顯著誘導(dǎo)NFKB的過度激活以介導(dǎo)細(xì)胞因子風(fēng)暴（aP<0.05）；2）青蒿素（15 μM）和槲皮素（15 μM）單獨或聯(lián)合治療通過抑制由S蛋白介導(dǎo)的NFKB的過度激活顯著改善了細(xì)胞因子風(fēng)暴（bP<0.05）；3）青蒿素（15μM）和槲皮素（15 μM）聯(lián)合治療顯示出比單獨治療更好的改善效果（cP<0.05）；4）NFKB抑制劑PDTC顯示出比單獨青蒿素（15 μM）和槲皮素（15 μM）更有效的改善效果（dP<0.05）；5）與 PDTC 相比，青蒿素（15 μM）與槲皮素（15 μM）的聯(lián)合治療顯示出類似的改善效果（eP＞0.05）。

圖4 青蒿素（15 μM）和槲皮素（15 μM）單獨或聯(lián)合治療對S蛋白介導(dǎo)的NFKB過度激活的抑制作用

圖5 青蒿素和槲皮素聯(lián)合治療對刺突糖蛋白介導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子風(fēng)暴的逆轉(zhuǎn)作用

3 討論

早在4 000年前的母系社會，彝族的醫(yī)療活動已經(jīng)進(jìn)行了很長時間[17]。彝族的祖先積累了大量的醫(yī)學(xué)知識，包括針灸、藥酒和草藥，為進(jìn)一步研究中國少數(shù)民族的醫(yī)學(xué)奠定了寶貴的基礎(chǔ)[17]。民族藥物研究對于預(yù)防未來毀滅性的流行病緊急情況非常重要[18]。

自2019年以來，由SAS-CoV-2引起的新冠肺炎疫情對全球健康產(chǎn)生了深遠(yuǎn)影響[19]。直到今天，青蒿和側(cè)柏葉一直被彝族用來治療咳嗽、肺病和呼吸道傳染病。本研究證明，青蒿素（濃度≤100 μM）或槲皮素（濃度≤100 μM）對Vero E6和HEK293-ACE2細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性（圖2）。這與先前的研究結(jié)果一致，即青蒿素和槲皮素對Vero E6細(xì)胞的CC50分別為3.32 mM和29.1 mM[20-21]。根據(jù)本研究中的富集分析，可以推測青蒿素、槲皮素或青蒿素+槲皮素可能通過影響病毒介導(dǎo)的炎性反應(yīng)來防治新冠肺炎（表2-7）。這些預(yù)測需要進(jìn)一步的實驗來證實。

SARS-CoV-2病毒感染可在體內(nèi)引發(fā)復(fù)雜的信號級聯(lián)反應(yīng)并刺激NFKB，NFKB可誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄，并增加 IL-1β、IFN-γ、IP-10、MCP-1、IL-4和IL-1057的分泌[22]。特別是TLR4最可能參與識別SARS-CoV-2的分子模式，以誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[23]。SARS-CoV-2感染后，宿主的炎性細(xì)胞因子風(fēng)暴通?？赡茉诓皇芸刂频拿庖叻磻?yīng)下啟動，失控的炎癥反應(yīng)可能是SARS-CoV-2感染死亡的主要原因[24]。細(xì)胞因子風(fēng)暴會通過免疫系統(tǒng)觸發(fā)宿主細(xì)胞的損傷，并與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)，導(dǎo)致多器官衰竭或死亡[25]。該研究證明，刺突蛋白可以通過以濃度依賴的方式介導(dǎo)HEK293T-hACE2細(xì)胞中NFKB的過度激活，顯著誘導(dǎo)細(xì)胞因子風(fēng)暴（圖3）。青蒿素以其抗瘧活性而聞名。除了抗瘧活性外，青蒿素還具有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)作用。青蒿素可以抑制多種炎癥信號通路，如MAPK、PI3K/AKT和NFKB，抑制淋巴細(xì)胞活化，增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量，抑制胞質(zhì)分裂的釋放，最終減少炎癥損傷[26-28]。槲皮素具有良好的抗炎和抗病毒作用，可顯著減少IL-6、IL-1β、IL-8和 TNF-α46的分泌[29]。這兩種化合物在新型冠狀病毒肺炎中都有一定的應(yīng)用潛力。該研究證明，青蒿素或槲皮素的單獨或聯(lián)合治療可以通過抑制刺突蛋白介導(dǎo)的NFKB的過度激活來顯著改善細(xì)胞因子風(fēng)暴，聯(lián)合治療顯示出比單獨治療更好的效果（圖4和圖5）。這些結(jié)果提示，青蒿素或槲皮素的單獨或聯(lián)合治療可以通過抑制SARS-CoV-2刺突蛋白介導(dǎo)的NFKB的過度激活來有效地改善夸大的炎癥反應(yīng)。

4 小結(jié)

總之，本項研究結(jié)果表明SARS-CoV-2刺突蛋白會介導(dǎo)細(xì)胞因子風(fēng)暴。在SARS-CoV-2刺突蛋白的刺激下，青蒿素或槲皮素的單獨或聯(lián)合治療可以通過抑制NFKB的過度激活來顯著減輕細(xì)胞因子風(fēng)暴。聯(lián)合治療顯示出比單獨治療更好的效果。我們的研究為預(yù)防和治療新冠肺炎提供了替代和補充藥物的參考。