胡 靖，郭 琰，馬雅鴿，趙聲蘭

（云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500）

阿爾茲海默?。ˋlzheimer's disease，AD），是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床特征為學(xué)習(xí)記憶障礙和認(rèn)知功能減退[1]。阿爾茨海默病是老年人最為常見的一種癡呆類型，也是老年人最常見的慢性疾病之一，因而，又被稱為老年癡呆。AD發(fā)病機(jī)制包括β淀粉樣蛋白的沉積[2]、tau蛋白異常過度磷酸化[3-4]、膽堿能損傷、興奮性氨基酸毒性和免疫炎癥反應(yīng)等[5-7]。目前，有膽堿酯酶抑制劑以及非競(jìng)爭(zhēng)性N-甲基-D-天門冬氨酸（NMDA）受體拮抗劑（美金剛），但仍無理想的臨床新型抗阿爾茨海默病藥物[8]。近年來的相關(guān)研究表明，傳統(tǒng)中藥三七（Notoginseng Flos）對(duì)治療阿爾茲海默病具有良好的療效。孫天賜等[9]基于系統(tǒng)生物學(xué)的角度對(duì)三七防治AD的作用機(jī)理進(jìn)行研究；鐘振國等[10]以D-半乳糖腹腔注射致亞急性損傷合并鵝膏蕈氨酸損毀雙側(cè)大腦Meynert基底核建立AD大鼠動(dòng)物模型，使用三七總皂苷進(jìn)行治療，發(fā)現(xiàn)三七總皂苷對(duì)AD大鼠模型大腦膽堿能神經(jīng)的病理損害具有保護(hù)作用；范亞軍等[11]利用蛋白磷酸酶抑制劑岡田酸（OA）模擬AD病細(xì)胞損傷模型，研究表明三七總皂苷對(duì)OA引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡具有一定的保護(hù)作用。三七花是否具有治療阿爾茲海默病的效果，尚未見有報(bào)道，本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)對(duì)三七花治療阿爾茲海默病的物質(zhì)基礎(chǔ)以及潛在的作用機(jī)制進(jìn)行探索和預(yù)測(cè)分析研究，以期為三七花防治老年癡呆提供理論依據(jù)。

1 數(shù)據(jù)來源及分析方法

1.1 三七花活性成分及作用靶點(diǎn)的收集 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（traditional Chinese medicine database and analysis platform，TCMSP），（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）輸入關(guān)鍵詞“三七花”檢索。口服生物利用度是藥物篩選的關(guān)鍵參數(shù)[12]，因?yàn)槿呋ㄔ谌粘Ｉ钪写蠖嘁燥嬈穪硎褂?，故選擇口服生物利用度作為篩選關(guān)鍵參數(shù)，根據(jù)口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥15%進(jìn)行篩選[13]，得到三七花的主要化學(xué)成分，并匹配相應(yīng)的作用靶點(diǎn)。

1.2 疾病靶點(diǎn)收集 利用DisGeNET數(shù)據(jù)庫（疾病基因數(shù)據(jù)庫，http：//www.disgenet.org/） 和 GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/），以“Alzheimer's disease”為關(guān)鍵詞檢索阿爾茲海默病相關(guān)靶點(diǎn)，將2個(gè)數(shù)據(jù)庫的靶點(diǎn)進(jìn)行歸并得到與阿爾茲海默病相關(guān)的基因和靶蛋白信息。

1.3 三七花化合物-靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將三七花活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)和阿爾茲海默病相關(guān)的靶點(diǎn)進(jìn)行比較，獲得二者共有的靶點(diǎn)，然后使用Cytoscape 8.0圖形化網(wǎng)絡(luò)分析和編輯軟件，進(jìn)行“三七花活性化合物-疾病靶點(diǎn)”的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)表示三七花活性成分、疾病相關(guān)靶點(diǎn)，網(wǎng)絡(luò)中的邊用來連接藥物與活性成分、活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)，疾病與關(guān)鍵靶點(diǎn)；網(wǎng)絡(luò)中一個(gè)節(jié)點(diǎn)的度表示和節(jié)點(diǎn)相連的條數(shù)，度值越大說明這個(gè)節(jié)點(diǎn)越可能是關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)[14]。

1.4 GO功能富集和KEGG信號(hào)通路分析 利用Metascape數(shù)據(jù)庫對(duì)三七花改善阿爾茲海默病的靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集和KEGG通路分析，將所交集后的基因靶點(diǎn)名輸入Multiple Gene List，上傳后選擇“H.sapiens”進(jìn)行個(gè)性化分析，點(diǎn)擊Enrichment選擇通路進(jìn)行分析。

1.5 蛋白互做網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 STRING是搜索已知蛋白和未知蛋白相互作用的數(shù)據(jù)庫，為了闡述三七花改善阿爾茲海默病的相互作用關(guān)系，將1.3得到三七花改善阿爾茲海默病靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)庫，物種選擇“human”，該數(shù)據(jù)庫可以對(duì)蛋白質(zhì)的相互作用關(guān)系進(jìn)行打分，分值越高表明相互作用的置信度越高[15]，本文將相互作用評(píng)分設(shè)置為中置信度（0.400），得到三七花改善阿爾茲海默病的相互作用關(guān)系圖（PPI）。

1.6 分子對(duì)接 為了確定網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)三七花改善記憶靶點(diǎn)的準(zhǔn)確性，采用分子對(duì)接技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。將蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中評(píng)分較高的蛋白與KEGG結(jié)果中靠前的通路進(jìn)行比較分析，得到準(zhǔn)備驗(yàn)證的關(guān)鍵靶點(diǎn)，將靶點(diǎn)輸入PDB數(shù)據(jù)庫，選擇最佳的蛋白晶體結(jié)構(gòu)，并從PubChem數(shù)據(jù)庫中下載三七花化學(xué)成分2D結(jié)構(gòu)式，通過chem3D軟件將其優(yōu)化，將關(guān)鍵靶點(diǎn)的蛋白結(jié)構(gòu)、三七花主要成分結(jié)構(gòu)式導(dǎo)入到AutoDock－Tools在線平臺(tái)進(jìn)行分子對(duì)接前處理，之后使用命令提示符進(jìn)行對(duì)接，預(yù)測(cè)潛在蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)，使用Vinascore軟件對(duì)其打分，查看其分子對(duì)接的親和力，用PyMOL軟件進(jìn)行分子對(duì)接并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 三七花活性成分及其潛在作用靶點(diǎn)篩選結(jié)果從中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（TCMSP）通過OB≥15%篩選得到三七花化學(xué)成分共38種，其中血腦屏障透過率（BBB）較好的有beta-bourbonene（β-波旁烯）、alpha-cubebene（Alpha-蓽澄茄油烯）、beta-sitosterol（β-谷甾醇）等成分。血腦屏障透過率較低的可通過修飾和劑型選擇加以提高。通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（TCMSP）得到上述已知三七花38種成分中有作用靶點(diǎn)的成分25個(gè)，使用uniprot數(shù)據(jù)庫匹配相應(yīng)的作用靶點(diǎn)，得到64個(gè)作用靶點(diǎn)（見表1）。

2.2 疾病相關(guān)的靶點(diǎn) 利用DisGeNET數(shù)據(jù)庫，以“Alzheimer's disease”為關(guān)鍵詞檢索阿爾茲海默病相關(guān)靶點(diǎn)，獲取到已知與阿爾茲海默病相關(guān)的基因和靶蛋白信息123個(gè)。同時(shí)利用GeneCards數(shù)據(jù)庫，以“Alzheimer's disease”為關(guān)鍵詞檢索阿爾茲海默病相關(guān)靶點(diǎn)，以score大于1為條件篩選，獲取到已知與阿爾茲海默病相關(guān)的基因和靶蛋白信息有3 508個(gè)。

2.3 三七花活性成分作用靶點(diǎn)-疾病靶點(diǎn)的交集 將三七花活性成分對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)和疾病相關(guān)的靶點(diǎn)進(jìn)行交集，交集后的得到交集靶點(diǎn)34個(gè)（如表2所示）。

表2 三七花活性成分與老年癡呆疾病的交集靶點(diǎn)

2.4 三七花活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 構(gòu)建“中藥化合物-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)[16]，如圖1。網(wǎng)絡(luò)中共有3部分內(nèi)容，紅色為通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選出來的活性成分25個(gè)，其中與疾病靶點(diǎn)相交的成分有23個(gè)；藍(lán)色為阿爾茲海默?。痪G色為活性成分作用靶點(diǎn)與疾病相關(guān)靶點(diǎn)相交互的靶點(diǎn)34個(gè)，分別是CHRM1、CHRM2、PTGS2、ADRB2、SLC6A4、PTGS1、RELA、IL10、CALM1、MAOB、HTR3A、SLC6A2、ADRA1A、BAX、EIF6、TP53、CCNB1、RHOA、BCL2、SLC6A3、ADH1C、ADH1A、PIK3CG、HTR2A、OPRM1、TNF、CASP9、JUN、IL6、CASP8、PON1、CASP3、MAP2、BCHE。通過Cytoscape計(jì)算網(wǎng)絡(luò)參數(shù)，得到三七花活性成分和靶點(diǎn)作用關(guān)系[17]。三七花中化學(xué)成分按節(jié)點(diǎn)度值排序由高到低依次是 β-谷甾醇（19）、β-欖香烯（12）、β-石竹烯（9）、（-）-異香木蘭烯（8）、β-桂烯（8）、西多糖苷（7）、棕櫚酸甲酯（7）、β-波旁烯（6）、冰片（6）、β-立方體蛋白（5）、（1R，4aR，8aS）-1-異丙基-7-甲基-4-亞甲基-2，3，4a，5，6，8a-六氫-1H-萘（5）、EEE（4）、蓽澄茄油烯（4）、糠醇（3）、T-依蘭油烯（3）、糠醛（3）、苯乙醛（3）、（1R）-（+）-樟腦（3）、α-古蕓烯（3）、正庚烷（2）、甲酸混酯（2）、辛酸乙酯（2）、甲酸丙酯（2）。這些化學(xué)成分被諸多學(xué)者認(rèn)為可能是改善阿爾茲海默病的物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖1 三七花活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

同時(shí)節(jié)點(diǎn)度值較高的靶點(diǎn)是CHRM1（毒蕈堿乙酰膽堿受體M1）、CHRM2（毒蕈堿乙酰膽堿受體M2）、PTGS2（前列腺素 G/H 合成酶 2）、PTGS1（前列腺素G/H合成酶1）、ADH1C（醇類脫氫酶1C）等。詳細(xì)參數(shù)見圖2。

圖2 靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)度值

2.5 GO和KEGG富集分析 用Metascape數(shù)據(jù)庫對(duì)三七花改善阿爾茲海默病的靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集和 KEGG通路分析，得到圖3，GO分析得到的主要通路為對(duì)異物刺激的反應(yīng)（response to xenobiotic stimulus）、細(xì)胞對(duì)有機(jī)環(huán)狀化合物的反應(yīng)（cellular respose to organic cyclic compound）、對(duì)糖皮質(zhì)激素的反應(yīng)（response to glucocorticoid）、對(duì)無機(jī)物的反應(yīng)（response to inorganic substance）、離子運(yùn)輸?shù)恼{(diào)節(jié)（regulation of ion transport）、調(diào)節(jié)神經(jīng)元的凋亡過程（regulation of neuron apoptotic process）、膜筏（membrane raft）以及蛋白質(zhì)磷酸化的正向調(diào)節(jié)（positive regulation of protein phosphorylation） 等；KEGG 富集主要通路為脂質(zhì)和動(dòng)脈硬化（lipid and atherosclerosis）、C型凝集素受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑（C-type lectin receptor signaling pathway）、5-羥色胺突觸（serotonergic synapse）以及神經(jīng)營養(yǎng)劑（neurotrophin signaling pathway）等。詳細(xì)參數(shù)見表3。

圖3 圖a為GO分析，圖b為KEGG富集分析

表3 GO分析與KEGG富集分析參數(shù)

2.6 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心基因分析 將三七花改善阿爾茲海默病的靶點(diǎn)輸入到String數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，獲得靶點(diǎn)蛋白相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖（見圖4），共有34個(gè)節(jié)點(diǎn)和132條相互作用連線，節(jié)點(diǎn)平均數(shù)為7.76。將圖導(dǎo)入Cytoscape，依據(jù)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度值排序，得到前五個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白依次為IL6（白介素-6）、TNF（腫瘤壞死因子）、CASP3（鈣化酶-3）、TP53（細(xì)胞腫瘤抗原P53）、PTGS2（前列腺素G/H合成酶和環(huán)氧酶2）。由PPI圖4可知這些關(guān)系來自3大類：已知交互，預(yù)測(cè)的相互作用以及其它。已知交互多來自于數(shù)據(jù)庫和實(shí)驗(yàn)證明，預(yù)測(cè)的相互作用來自基因共同產(chǎn)生，其他來自于文本挖掘。

圖4 三七花改善阿爾茲海默病靶蛋白互做（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖

2.7 分子對(duì)接 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）中評(píng)分較高的蛋白可以認(rèn)為起到重要作用，將評(píng)分較高的潛在蛋白相對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)與KEGG通路分析結(jié)果進(jìn)行比較分析，將三七花改善阿爾茲海默病的潛在靶點(diǎn)PTGS2（前列腺素G/H合酶2）和CHRM2（毒蕈堿乙酰膽堿受體M2）作為分子對(duì)接的對(duì)象，導(dǎo)入PDB數(shù)據(jù)庫，通過數(shù)據(jù)庫自帶排練方式，得分由高到低選擇，得到PTGS2、BCL2分辨率較高的蛋白結(jié)構(gòu)5f19、5yc8。在“活性成分–疾病靶點(diǎn)”中選擇度值較高的三七花活性成分，西多糖苷（sitogluside）、β-谷甾醇（betasitosterol）作為對(duì)接分子，在AutoDockTools在線平臺(tái)處理配體和受體，并得到運(yùn)行參數(shù)，通過命令提示符進(jìn)行對(duì)接處理，得到Vinascore得分分別為-7.3和-7.7。之后在PyMOL軟件上將處理好的配體和受體對(duì)接，得到圖5。Vina是以相應(yīng)的口袋參數(shù)對(duì)受體和配體進(jìn)行分子對(duì)接所得到復(fù)合物的得分，這個(gè)值越低代表受體和配體親和力越高，對(duì)接結(jié)果越好。結(jié)果發(fā)現(xiàn)篩選得到的活性成分與預(yù)測(cè)的靶點(diǎn)均有結(jié)合。其中西多糖苷（sitogluside）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）與PTGS2、CHRM2靶點(diǎn)有較強(qiáng)的親和力。

圖5 活性成分與靶點(diǎn)蛋白的分子對(duì)接

3 討論

中醫(yī)是我國的國粹，老年人對(duì)中藥有較高的信任度，近年來關(guān)于中藥用于改善癡呆患者癥狀的研究日益增多，目前主要為活血化瘀、改善循環(huán)類藥物。中藥個(gè)體化方案靈活性高，患者依從性較好，但目前缺乏臨床隨機(jī)雙盲試驗(yàn)，且樣本量較小，有不同程度的毒副作用，故中藥多為輔助用藥。喬森等[18]研究認(rèn)為，血管相關(guān)病變是AD的重要原因，血瘀既是病理產(chǎn)物又是致病因素，從“瘀”進(jìn)行治療，取得不錯(cuò)的臨床效果。三七花性甘涼，具有清熱平肝、生津止渴、活血化瘀等功效，適用于頭暈、目眩、耳鳴等癥[19]。葉長(zhǎng)青等[20]通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)，發(fā)現(xiàn)西多糖苷（sitogluside）與靶點(diǎn)PTGS2結(jié)合較好，可能是治療AD的關(guān)鍵。同時(shí)大量網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇[21-23]是治療AD的關(guān)鍵成分。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，篩選出23個(gè)三七花活性成分交集到34個(gè)AD靶點(diǎn)，通過Cytoscape 8.0軟件構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)”關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集和KEGG通路分析表明，主要通過西多糖苷（sitogluside）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、β-欖香烯等活性成分調(diào)控 CHRM1、CHRM2、PTGS2等AD靶點(diǎn)。分子對(duì)接表明三七花的活性成分西多糖苷（sitogluside）[20]、β-谷甾醇（beta-sitosterol）[20-21]與老年癡呆的PTGS2、CHRM2等靶點(diǎn)有較強(qiáng)的結(jié)合，為三七花防治AD的提供了理論基礎(chǔ)。