劉鑄 錢洪安 王再山 韓美鳳 蔡赫 張春鳳時艷菁 金志民 陳歡 張雋晟

（1 牡丹江師范學院生命科學與技術(shù)學院，牡丹江157011）（2 黑龍江農(nóng)業(yè)經(jīng)濟職業(yè)學院，牡丹江157041）

大麝鼩 (Crocidura lasiuraDobson, 1890) 隸屬于勞亞食蟲目 (Eulipotyphla) 鼩鼱科(Soricidae) 麝鼩屬 (Crocidura)。在國外主要分布于俄羅斯遠東地區(qū)東南部和朝鮮半島，在我國主要分布于東北和華東。其東北亞種 (C. l. lasiuraDobson, 1890)，模式產(chǎn)地：黑龍江烏蘇里江附近；韓國亞種 (C.l. thomasiSowerby, 1917)，模式產(chǎn)地：韓國首爾東南177 km；華東亞種 (C. l. camplus-lincolnensisSowerby, 1945)，模式產(chǎn)地：上海西區(qū)。Sowerby(1917) 認為東北亞種 (C. l. lasiura) 頭體長和尾長均大于韓國亞種 (C. l. thomasi)，東北亞種的背部顏色更黑，韓國亞種 (C. l. thomasi) 背部顏色更灰。Jones 等 (1960) 報道分布于韓國的大麝鼩與分布于中國東北和俄羅斯遠東地區(qū)的大麝鼩，在體型和頭骨大小上存在區(qū)別。Corbet (1978) 基于形態(tài)學，認為來自于俄羅斯烏蘇里地區(qū)、中國東北和韓國的大麝鼩為同一亞種 (C. l. lasiura)，分布于中國上海的為另一個亞種 (C. l. campus-lincol‐nensis)。Hutterer (2005) 認為大麝鼩有7 個同階元亞種名稱。Smith 和解焱 (2009) 認為中國有2 個亞種，分別為分布于東北的亞種 (C. l. lasiura) 和分布于東部和四川的亞種 (C. l. campus-lincolnen‐sis)。劉鑄等 (2019) 認為中國東北的大麝鼩與俄羅斯遠東分布的大麝鼩在形態(tài)上沒有明顯區(qū)分，應(yīng)該屬于同一亞種 (C. l. lasiura)。魏輔文等 (2022)認為大麝鼩全世界有3 個亞種，中國有2 個亞種，即東北亞種 (C. l. lasiura) 和華東亞種 (C. l. cam‐pus-lincolnensis)。可見大麝鼩亞種分類仍存異議，種下分類問題還沒有很好解決 (Burgin and He,2018)。

近些年，分子系統(tǒng)地理學在不斷揭示大麝鼩種下遺傳分化問題。Motokawa等 (2000) 基于Cytb基因部分序列 (402 bp)，發(fā)現(xiàn)來自于中國東北長春的1 個單倍型與來自于韓國陜川 (Hapchon) 的1 個單倍型存在明顯分化。Han 等 (2002) 利用同樣的分子標記，發(fā)現(xiàn)來自于中國東北長春和俄羅斯烏蘇里 (Ussurisk ) 的2 個單倍型與來自于韓國陜川、內(nèi)藏 (Naejang) 和席毛 (Seokmo) 的3 個單倍型存在明顯分化。Ohdachi 等 (2004) 基于Cytb基因全序列 (1 140 bp)，發(fā)現(xiàn)來自于俄羅斯烏蘇里和克拉斯基諾 (Kraskino) 的2 個單倍型與來自于韓國歐岱山(Mt. Odae) 的1 個單倍型存在明顯分化。Koh 等(2014) 基于Cytb基因全序列，認為分布于韓國的大麝鼩與俄羅斯遠東分布的大麝鼩存在明顯分化，韓國的大麝鼩應(yīng)是一個獨立亞種 (C. l. thomasi)，同時也提出需要進一步采集中國東北樣本進行確認。可見大麝鼩的分子系統(tǒng)地理學分析涉及到中國樣本甚少，導致中國分布大麝鼩的分子系統(tǒng)分化地位不明確，使得大麝鼩種下分類缺乏分子生物學證據(jù)。

本研究對中國東北地區(qū)分布的大麝鼩進行采樣，結(jié)合已報道數(shù)據(jù)，一并進行大麝鼩的形態(tài)學和Cytb基因比較分析，以進一步探討大麝鼩的亞種分化問題。

1 研究方法

1.1 樣本采集

主要采用陷阱法，輔以鋏捕法，在中國東北地區(qū)捕獲大麝鼩標本共13 號。其中，在黑龍江省橫道河子地區(qū)采集到大麝鼩4 號標本 (HD8、HD28、HD33、HD34)，牡丹峰地區(qū)采集到4 號標本 (MD1、MD4、MD13、MD14)，鳳凰山地區(qū)采集到2 號標本 (FH18、FH132)，遼寧省新賓地區(qū)采集到3 號標本 (XB1、XB26、XB27)，具體見圖1。采集標本存放于牡丹江師范學院動植物標本館。從GenBank 下載了其他分布區(qū)大麝鼩Cytb基因序列共15 個，具體地理位置見圖1，序列基本信息見表1。

表1 GenBank下載的大麝鼩Cyt b基因序列Table 1 The Cyt b gene sequences of Crocidura lasiura downloaded from GenBank

圖1 大麝鼩樣本分布地. 中國東北：1. 橫道河子地區(qū)，2. 牡丹峰地區(qū)，3. 鳳凰山地區(qū)，4. 新賓地區(qū)，5. 撫松地區(qū)；中國東部：6.浙江省，7. 江蘇省南京，8. 江蘇省張家港；俄羅斯遠東：9. 烏蘇里地區(qū)，10. 濱海邊疆區(qū)，11. 哈巴羅夫斯克；韓國：12. 曾坪郡，13. 臨津江，14. 歐岱山，15. 釜山Fig. 1 The distribution of the samples of Crocidura lasiura. Northeast China: 1. Hengdaohezi region; 2. Mudanfeng region; 3. Phoenix Mountain region; 4. Xinbin region; 5. Fusong region. East China: 6.Zhejiang Province; 7. Nanjing, Jiangsu Province; 8. Zhangjiagang, Jiangsu Province. Far East Russia: 9. Ussurisk; 10. Primorye; 11.Khabarovsk. South Korea: 12. Jeungpyeong; 13. Imjin River; 14.Odaesan; 15.Busan

1.2 形態(tài)特征測量與分析

對采集的大麝鼩標本中4 號 (HD33、HD34、MD1、MD4) 成體標本測量外部形態(tài)、稱量體重(精確至0.1 g) 和特征描述，制作假剝制標本與頭骨標本。外部形態(tài)測量包括頭體長 (Head and Body length, HB)、尾長 (Tail length, TL)、尾長/體長 (TL/HB)、后足長 (Hind feet length, HF)、耳長(Ear length, EL) (精確至1 mm)。頭骨指標利用數(shù)顯式游標卡尺測量，精度為0.1 mm，包括顱全長(Greatest length of skull, GLS)、顱基長 (Condylobasal length of skull, CLS)、 腦顱寬 (Cranial breadth, CB)、腦顱高 (Height of the braincase, BH)、眶間寬 (Interorbital breadth, IOB)、上齒列長 (Upper tooth row length, UTRL) 和下齒列長 (Length of mandibular tooth row, LTRL)。對采集的大麝鼩標本的形態(tài)學量度包括標本數(shù)、均值 ± 標準差 (mean ±SD) 和量度范圍統(tǒng)計。梳理已有文獻報道的形態(tài)學數(shù)據(jù)和描述 (Sowerby, 1917；壽振黃等，1958；馬逸清，1986；丁魯民和徐友祥，2001，2007；丁魯民等，2010)，進行列表對比。

1.3 分子系統(tǒng)分析

對采集的樣本肌肉組織用酚-氯仿法進行基因組DNA 提取。mtDNA 的Cytb基因序列PCR反應(yīng)體系為50 μL， 含200 μmol/L 的dNTP，1.5 mmol/L 的MgCl2，Primer (L14724/ H15915, Irwinet al., 1991) 各10 pmol，Taq DNA polymerase 2.5 U (大連寶生物)，模板為250 ng。擴增程序為94 ℃ 3 min，94 ℃ 45 s，50 ℃ 50 s，72 ℃ 45 s，30 cycles，72 ℃ 7 min。PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)純化回收，進行測序。

使用EditSeq (DNASTAR 軟件包) 對采集樣本(13 個) 和GenBank 下載序列 (15 個) 一并進行序列編輯，再利用Clustal W (Thompsonet al., 1997) 軟件進行序列聚類比對。利用DnaSP 5.10 (Librado and Rozas, 2009) 分析多態(tài)位點數(shù)量 (Number of polymorphic sites)、單倍型數(shù)量 (Number of haplotypes)、核苷酸多態(tài)性 (Nucleotide diversity)、核苷酸差異平均數(shù) (Average number of nucleotide differences) 及單倍型多態(tài)性 (Haplotype diversity)。利用MEGA 5.05 計算遺傳距離。遺傳分化時間 (T)利用公式T = K / (2r) 進行計算；其中K 為序列差異率 (Sequence divergence)，由MEGA 5.05 計算獲得K，r 為替換率 (substitution rate)，根據(jù)已有最古老麝鼩屬化石 (5.03 Mya ago; Butler, 1998) 計算的Cytb基因麝鼩屬替換率，r= 0.0261/位點/Mya(Esselstynet al., 2009; Leeet al., 2018)。利用軟件RAxML 構(gòu)建最大似然法 (Maximum likelihood,ML) 系統(tǒng)發(fā)生樹 (Stamatakis, 2014)。利用Network 4.6 (Bandeltet al., 1999) 構(gòu)建中介網(wǎng)絡(luò)圖 (medianjoining network) 分析單倍型間的進化關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)比較

對形態(tài)學數(shù)據(jù)和描述進行分析，在絕大多數(shù)個體中，分布于中國東北—俄羅斯遠東的大麝鼩體型大于分布于韓國的個體，頭體長：＞ 82 mmvs.＜ 82 mm，尾長：＞ 39 mmvs. ＜ 39 mm，顱基長：＞ 20 mmvs. ＜ 20 mm；中國東北—俄羅斯遠東種群體背毛色更黑，韓國種群體背毛色更灰；中國東部種群尾較長，絕大多數(shù)超過體長之半；而分布于中國東北—俄羅斯遠東、韓國的大麝鼩種群尾長絕大多數(shù)不及體長之半 (表2)。

表2 大麝鼩的形態(tài)學數(shù)據(jù)和描述 (體重單位：g，長度單位：mm)Table2 Morphological data and description of Crocidura lasiura (body weight: g, measure: mm)

2.2 分子系統(tǒng)學分析

2.2.1 遺傳多樣性

本研究分析的28 個大麝鼩樣本Cytb基因序列(897 bp) 中，包含41 個變異位點，其中24 個簡約信息位點 (Parsimony informative sites)，17 個單變異位點 (Singleton variable sites)，變異位點數(shù)占總位點數(shù)的4.57%，未發(fā)現(xiàn)插入和缺失。在28 個大麝鼩樣本中發(fā)現(xiàn)15 個單倍型，單倍型多態(tài)性為0.899 0，核苷酸差異平均數(shù)7.672 0，核苷酸多態(tài)性0.008 5。

2.2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

利用臺灣長尾麝鼩 (Crocidura tadae) 和日本麝鼩 (Crocidura dsinezumi) 做外群構(gòu)建ML 系統(tǒng)發(fā)生樹 (圖2)，發(fā)現(xiàn)大麝鼩樣本分為3個地理譜系結(jié)構(gòu)：中國東北—俄羅斯遠東譜系、韓國譜系、中國東部譜系。中國東北與俄羅斯遠東大麝鼩樣本間沒有形成進一步明顯的遺傳分化，聚類于同一進化支上。

圖2 基于Cyt b基因構(gòu)建的大麝鼩ML系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.2 Phylogenetic tree of Crocidura lasiura inferred from ML based on the Cyt b gene

2.3 遺傳距離和遺傳分化時間

大麝鼩各地理分布區(qū)域間的遺傳距離結(jié)果 (表3) 顯示中國東北—俄羅斯遠東譜系與韓國譜系的遺傳距離為0.012 4，中國東部譜系與中國東北—俄羅斯遠東譜系的遺傳距離為0.017 4。中國東部譜系與韓國譜系的遺傳距離為0.017 0。中國東北—俄羅斯遠東譜系與韓國譜系遺傳分化時間為0.023 9 Mya。中國東部譜系與中國東北—俄羅斯遠東譜系的遺傳分化時間為0.033 4 Mya。中國東部譜系與韓國譜系的遺傳分化時間為0.032 6 Mya。

表3 大麝鼩各地理分布區(qū)域間的遺傳距離 (左下) 和遺傳分化時間T (右上，單位：Mya)Table 3 Genetic distances between Crocidura lasiura of different geographical distribution (below) and time of divergence (above, Unit: Mya)

2.4 中介網(wǎng)絡(luò)分析

大麝鼩中介網(wǎng)絡(luò)圖 (圖3) 顯示出與系統(tǒng)發(fā)育分析類似的結(jié)果，分為3個明顯進化地理譜系。中國東北—俄羅斯遠東譜系具有的單倍型都分布在中介網(wǎng)絡(luò)圖的一側(cè)，并且具有一個主要的共有單倍型，所有中國東北—俄羅斯遠東譜系具有的單倍型都源于1 個突變節(jié)點。韓國譜系具有的單倍型分布在中介網(wǎng)絡(luò)圖一側(cè)，不存在共享單倍型，通過2 ～ 4 個突變節(jié)點與中國東北、俄羅斯遠東和中國東部單倍型相聯(lián)系。中國東部譜系單倍型位于中介網(wǎng)絡(luò)圖下方，都來自于中部的1個突變節(jié)點。

圖3 大麝鼩的單倍型中介網(wǎng)絡(luò)圖 (最短樹的突變數(shù)為51)Fig. 3 Median-joining network of haplotypes of Crocidura lasiura specimens (number of mutations of the shortest tree = 51)

3 討論

3.1 大麝鼩的分子系統(tǒng)分化分析

本研究中介網(wǎng)絡(luò)圖結(jié)果暗示朝鮮半島為冰期避難所。第四紀冰期的大量積冰導致全球海平面下降120 ～ 140 m (Lambecket al., 2002)，在冰期東北亞地區(qū)的黃海作為陸橋出現(xiàn)，很可能成為大麝鼩進入朝鮮半島 (避難所) 的路徑 (Kohet al.,2012)，進而進入韓國。鴨綠江和長白山是我國東北與朝鮮半島的地理阻隔，推測第四紀冰期后大麝鼩離開避難所 (朝鮮半島) 向中國東北以及俄羅斯遠東地區(qū)遷移，海平面上升，黃海陸橋消失，鴨綠江和長白山發(fā)揮了地理阻隔作用，阻斷了朝鮮半島與中國東北的基因流。本研究估算的韓國譜系與中國東北—俄羅斯遠東譜系遺傳分化時間0.023 9 Mya。這與Koh 等 (2014) 推測韓國的大麝鼩與俄羅斯遠東地區(qū)的大麝鼩在很長時期都沒有進行過遺傳交流的結(jié)果一致。研究結(jié)果顯示韓國譜系與中國東北—俄羅斯遠東譜系存在較為明顯的遺傳分化 (遺傳距離為0.012 4)，推測大麝鼩離開冰期避難所 (朝鮮半島) 進入中國東北分布區(qū)的時間比較早，使得鴨綠江和長白山有足夠長的一段時間發(fā)揮一定地理阻隔作用，使韓國譜系與中國東北—俄羅斯遠東譜系產(chǎn)生一定遺傳分化。黑龍江、烏蘇里江、大興安嶺和小興安嶺是中國東北與俄羅斯遠東的地理阻隔，本研究結(jié)果顯示分布于中國東北與俄羅斯遠東地區(qū)的大麝鼩共同構(gòu)成1個進化譜系，說明中國東北與俄羅斯遠東地區(qū)的大麝鼩具有較近的遺傳距離，推測大麝鼩進入俄羅斯遠東分布區(qū)的時間較晚，由于時間較短，自然景觀未能充分發(fā)揮地理阻隔作用，使得兩個分布區(qū)未能形成進一步的遺傳分化。中國東部譜系與其他2個譜系存在明顯遺傳分化，可見這個最南端的譜系已經(jīng)與分布于中國東北、俄羅斯遠東以及韓國的譜系形成了較明顯的地理隔離，在一定程度上影響了遺傳交流。

3.2 大麝鼩的亞種分化

分布于中國東北和俄羅斯遠東的大麝鼩的絕大多數(shù)個體，頭體長大于82 mm，尾長大于39 mm，顱基長大于20 mm；體背顏色淺黑或黑褐色；尾長短于體長之半。形態(tài)特征符合75%亞種分類定律(Mayret al., 1965)，可作為亞種 (C. l. lasiura) 成立。本研究采集的東北樣本的采集地都屬于長白山山脈，可見我國長白山山脈分布的大麝鼩屬于C. l. lasiura。劉鑄等 (2019) 認為中國東北的大麝鼩與俄羅斯遠東分布的大麝鼩在形態(tài)上沒有明顯區(qū)分，本研究結(jié)果與其一致。分布于韓國的大麝鼩，絕大多數(shù)個體，頭體長小于82 mm，尾長小于39 mm，顱基長小于20 mm；體背顏色黑灰色；尾長短于體長之半。形態(tài)特征符合75%亞種分類定律 (Mayret al., 1965)，可作為亞種 (C. l. thoma‐si) 成立。Koh 等 (2014) 的研究結(jié)果認為韓國分布的大麝鼩為獨立亞種，本研究結(jié)果與其一致。朝鮮半島北部地區(qū)未見大麝鼩的形態(tài)學和Cytb基因報道，因此該地區(qū)大麝鼩的亞種歸類，有待進一步采樣明確。中國東部的大麝鼩形態(tài)學結(jié)果顯示其尾部較長，大多數(shù)個體尾長長于體長之半，形態(tài)特征符合75%亞種分類定律，可作為亞種 (C.l. campus-lincolnensis) 成立。 該結(jié)果與Corbet(1978) 及Smith 和解焱 (2009) 的觀點一致。壽振黃等 (1958) 在對上海一帶的大麝鼩標本進行形態(tài)學測量時，也獲得了尾部較長的測量結(jié)果 (5個標本，4 個尾長長于體長之半)，并發(fā)現(xiàn)其體色更褐。本研究Cytb基因遺傳分化結(jié)果支持將大麝鼩劃分為上述3 個亞種。Smith 和解焱 (2009) 認為華東亞種(C. l. campus-lincolnensis) 在四川有分布區(qū)，有待進一步采樣明確。