蘇小艷 楊梅 燕霞 侯蓉 肖梅 王勁松劉圣 王路才 張文平* 黃虹秀

（1 成都大熊貓繁育研究基地，四川省瀕危野生動(dòng)物保護(hù)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610081）（2 大熊貓國家公園廣元管理分局，廣元 628000）（3 四川省唐家河國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理處，廣元 628109）（4 四川省毛寨自然保護(hù)區(qū)管理局，廣元 628401）

大腸桿菌病是由大腸桿菌 (Escherichia coli) 的某些致病性血清型菌株引起的疾病總稱，為三類疫病 (何宏軒，2014)。當(dāng)機(jī)體在應(yīng)激或抵抗力下降時(shí)，大腸桿菌可導(dǎo)致人類和動(dòng)物發(fā)生細(xì)菌性腹瀉，給人和畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來嚴(yán)重的影響 (趙彤等，2019)。

許多學(xué)者在大腸桿菌對(duì)野生動(dòng)物的危害方面進(jìn)行了大量調(diào)查和研究。珍珠雞 (Numida melea‐gris)、火雞 (Meleagris gallopavo)、鵪鶉 (Coturnix japonica)、鷓鴣 (Francolinus pintadeanus)、金絲鳥 (Serinus canaria) 等野生禽鳥類，海貍鼠 (Myo‐castor coypus)、北極狐 (Vulpes lagopus)、銀黑狐(Vulpes vulpes fulva) 等毛皮動(dòng)物，獅 (Panthera leo)、金錢豹 (Panthera pardus)、雪豹 (Panthera uncia)、東北虎 (Panthera tigris altaica)、華南虎(Panthera tigris amoyensis)、黃金貓 (Pardofelis tem‐minckii) 等貓科動(dòng)物均有感染大腸桿菌導(dǎo)致疾病的報(bào)道 (賀文琦等，2008；楊陽，2017；那春子，2017；李依然，2021；吳新宇，2022)。一般而言，幼齡動(dòng)物更容易感染大腸桿菌，且死亡率較高，可達(dá)38% ～ 60% (高齊瑜等，1987；陳德威和高齊瑜，1987；那春子，2017)。大量的文獻(xiàn)也報(bào)道了大腸桿菌感染大熊貓 (Ailuropoda melanoleuca) 患病的病例。大腸桿菌感染會(huì)嚴(yán)重?fù)p害大熊貓的免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)，甚至造成大熊貓的急性死亡(張志和和魏輔文，2006；楊虎田等，2014)。1987 年，首次報(bào)道大熊貓感染腸道致病性大腸桿菌死亡的病例 (陳德威和高齊瑜，1987)。孫飛龍等 (2002) 發(fā)現(xiàn)1 只亞成年大熊貓感染大腸桿菌后，導(dǎo)致腸道粘膜炎癥并腹瀉。20 世紀(jì)80 年代成都大熊貓繁育研究基地因搶救野外大熊貓而傳入圈養(yǎng)種群由侵襲性大腸桿菌 (EnterinvasiveE. coli,EIEC) O152引起的出血性腸炎，2 年內(nèi)導(dǎo)致近20 只大熊貓死亡 (http://www. panda. org. cn/china/research/control/2013-01-07/1.html)。

大熊貓國家公園于2021 年10 月正式成立，總面積為22 000 km2，其中四川片區(qū)19 300 km2，占總面積的87.70%。大熊貓國家公園廣元片區(qū)依托四川省青川縣境內(nèi)的東陽溝省級(jí)自然保護(hù)區(qū)、毛寨省級(jí)自然保護(hù)區(qū)和唐家河國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)建立，總面積868 km2(其中核心保護(hù)區(qū)面積656 km2，控制區(qū)面積212 km2)，分別占大熊貓國家公園總面積、四川部分總面積的4.0%、4.5%。大熊貓國家公園的設(shè)立有利于保障大熊貓棲息地的連通性、協(xié)調(diào)性和完整性，實(shí)現(xiàn)大熊貓種群穩(wěn)定；同時(shí)，也利于加強(qiáng)大熊貓及其傘護(hù)種的生物多樣性和典型生態(tài)脆弱區(qū)的整體保護(hù)，打造國家重要生態(tài)屏障，維護(hù)國土生態(tài)安全。其轄區(qū)內(nèi)分布有國家一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物大熊貓、川金絲猴 (Rhinopithecus roxellana)、扭角羚 (Budorcas tax‐icolor)、豹 (Panthera pardus)、云豹 (Neofelis nebu‐losa)、林麝 (Moschus berezovskii)、馬麝 (Moschus chrysogaster)、白尾海雕 (Haliaeetus albicitta)、金雕 (Aquila chrysaetos)、斑尾榛雞 (Tetrastes sewer‐zowi)、紅喉雉鶉 (Tetraophasis obscurus) 及綠尾虹雉 (Lophophorns lhuysii) 等，是連接岷山山系北部大熊貓種群的重要走廊地帶和大熊貓重要的避難所 (劉洋等，2007；張君等，2009，2010；陳詩穎，2021)。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，野生動(dòng)物疫病流行可引起野生動(dòng)物大量死亡，使得許多物種處于瀕危狀態(tài)，因此野生動(dòng)物疫病成為危害野生動(dòng)物資源的重要因素之一。細(xì)菌性疾病為野生動(dòng)物疫病學(xué)研究的重要組成部分，對(duì)其進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查和研究，可為人獸共患病的防控提供生態(tài)學(xué)依據(jù)。因此，本研究針對(duì)大熊貓國家公園廣元片區(qū)野生動(dòng)物的糞便及環(huán)境中的水和土壤開展大腸桿菌流行病學(xué)調(diào)查以及對(duì)大腸桿菌的抗生素耐藥表型、耐藥基因型、毒力基因等生物學(xué)特性進(jìn)行研究，明確大熊貓國家公園廣元片區(qū)大腸桿菌流行情況，進(jìn)而科學(xué)防控，實(shí)現(xiàn)人類與自然和諧相處，具有公共衛(wèi)生學(xué)意義和生態(tài)學(xué)意義。

1 研究方法

1.1 樣本來源

2022 年8—9 月在大熊貓國家公園廣元片區(qū)采集野生動(dòng)物糞便、環(huán)境中的水和土壤。糞便樣本采集要求：盡量采集新鮮的糞便樣本 (3 d 以內(nèi)) 置于無菌潔凈的采樣密封袋內(nèi)，每處糞便選取1 ～ 3 個(gè)完整的糞團(tuán)裝入同一個(gè)采樣袋；根據(jù)糞便的成分、形狀、顏色、大小、氣味，結(jié)合周圍環(huán)境的生態(tài)學(xué)信息，根據(jù)自身的經(jīng)驗(yàn)判斷物種。環(huán)境水樣采集要求：每次采集10 mL即裝滿無菌采樣管。環(huán)境土壤樣本采集要求：去除表面浮土、凋落物后，每次采集15 mL裝入無菌采樣管。水樣和土樣采集均間隔3 km 及以上，采集范圍應(yīng)覆蓋整條樣線。每份樣品采集均須佩戴一次性無菌PE 手套完成，不同樣品采集須更換手套；采樣后在盛放樣品的容器 (樣品袋或離心管) 上清晰標(biāo)注樣品編號(hào)、采集時(shí)間、采集地坐標(biāo) (經(jīng)緯度) 等信息。統(tǒng)一置于有冰袋的采集箱中保存并及時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)及凍存。共計(jì)采集野生動(dòng)物糞便、環(huán)境中的水和土壤樣品243 份，其中糞便樣品124份 (東陽溝43 份、毛寨30 份、唐家河51 份)，土壤樣品70 份(東陽溝26 份、毛寨19 份、唐家河25 份)，水樣49 份 (東陽溝23 份、毛寨11 份、唐家河15 份)(表1)；從數(shù)據(jù)采集的地理信息坐標(biāo)分析，這243份樣品基本覆蓋了廣元片區(qū)的所有區(qū)域 (圖1)；野生動(dòng)物糞便樣品124 份，主要包括斑羚 (Naemorhed‐us goral，41 份)、扭角羚 (31 份)、毛冠鹿 (Ela‐phodus cephalophus，12 份)、大熊貓 (10 份)、林麝 (6 份)、中華鬣羚 (Capricornis milneedwardsii，5 份)、花面貍 (Paguma larvata，4 份)、馬來豪豬(Hystrix brachyura，3 份)、金貓 (Pardofelis tem‐minckii，3 份)、小麂 (Muntiacus reevesi，3 份)、豹貓 (Prionailurus bengalensis， 1 份)、 藏酋猴(Macaca thibetana，1 份)、亞洲黑熊 (Ursus thibet‐anus，1 份)、川金絲猴 (1 份)、獼猴 (Macaca mu‐latta，1 份)、野豬 (Sus scrofa，1 份)。

表1 三個(gè)自然保護(hù)區(qū)樣本采集情況Table 1 Sample collection in the three nature reserves

1.2 大腸桿菌分離純化培養(yǎng)

無菌條件下使用無菌接種環(huán)沾取采集的糞便、土壤和水的中心位置接種于滅菌的腦心浸液肉湯(Brain Heart Infusion Broth, BHI) 中，置于搖床37 ℃恒溫震蕩培養(yǎng)16 ～ 18 h。在無菌條件下，將過夜培養(yǎng)后的菌液使用接種環(huán)連續(xù)Z字形劃線接種于伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基，置于細(xì)菌培養(yǎng)箱37 ℃過夜培養(yǎng)后觀察菌落形態(tài)特征。挑取在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上呈深紫黑色或黑色、圓形、光滑、濕潤、帶有金屬光澤的單個(gè)菌落接種于BHI 肉湯，置于搖床37 ℃恒溫震蕩培養(yǎng)16 ～ 18 h，直至獲得純培養(yǎng)菌株。對(duì)篩選出的菌株進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢。

1.3 大腸桿菌生化鑒定

根據(jù)杭州微生物試劑公司生產(chǎn)的生化鑒定管操作說明書對(duì)疑似菌株進(jìn)行生化鑒定。

1.4 大腸桿菌16S rRNA PCR鑒定

采用天根細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取的疑似大腸桿菌細(xì)菌基因組 DNA 為模板，細(xì)菌16S rRNA 基因通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，目的片段為1 500 bp。引物序列為：27F：5′- AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3′ ，1492R：5′-TACCTTGTTACGACTT-3′，由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系25 μL：模板DNA 2 μL、2×Dream Taq Green PCR 預(yù)混液12.5 μL、ddH2O 8.5 μL、上下游引物各1 μL。ddH2O 設(shè)置為陰性對(duì)照。擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，54 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后放入凝膠成像儀進(jìn)行條帶分析，并送生工生物工程 (上海) 股份有限公司測(cè)序后在NCBI 上進(jìn)行BLAST 比對(duì)。并利用MEGA 7.0軟件對(duì)測(cè)序序列采用Neighbor-joining 法繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用IBM SPSS Statistics 25.0進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。

1.5 大腸桿菌藥敏實(shí)驗(yàn)

參考美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì) (Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSL, 2020) 標(biāo)準(zhǔn)，采用K-B紙片擴(kuò)散法檢測(cè)大腸桿菌分離株對(duì)臨床常用的15種抗生素的敏感性，包括以下7大類抗生素的藥敏制片，β-內(nèi)酰胺類：氨芐西林 (AM, 10 μg)、阿莫西林 (AMX, 20 μg)、頭孢他啶 (CAZ, 30 μg)、頭孢噻肟 (CTX, 30 μg)；氨基糖苷類：卡那霉素(K, 30 μg)、慶大霉素 (GM, 10 μg)、鏈霉素 (S, 10 μg)；大環(huán)內(nèi)酯類：阿奇霉素 (AZM, 15 μg)；喹諾酮類：環(huán)丙沙星 (CIP, 5 μg)；氯霉素類：氯霉素 (C, 30 μg)、氟苯尼考 (FON, 30 μg)；四環(huán)素類：四環(huán)素 (TE,30 μg)、多西環(huán)素 (DX, 30 μg)；磺胺類抗生素：復(fù)方新諾明 (SXT, 23.75/1.25)、甲氧芐氨嘧啶(TMP, 5 μg)。結(jié)果判定：根據(jù)CLSI (2020) 標(biāo)準(zhǔn)，將判定結(jié)果分為敏感 (S)、中介 (I) 和耐藥 (R)，大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株 ATCC25922 作為質(zhì)控菌株。耐藥率 = 耐藥菌株數(shù) / 分離菌株總數(shù)。

1.6 大腸桿菌耐藥基因檢測(cè)

采用天根細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取的大腸桿菌分離株細(xì)菌基因組DNA 為模板，采用超高通量熒光定量PCR 法 (HT-qPCR) 在合肥元哉生物科技有限公司完成大腸桿菌分離株耐藥基因的檢測(cè)，共使用了54 對(duì)引物 (包括一對(duì)16S rRNA 基因引物) (Yanet al., 2021)。PCR反應(yīng)混合液先使用納升級(jí)多樣品點(diǎn)樣儀 (MSND) 的96 (samples) × 54(assays) 模式加入到微孔芯片中，隨后在cycler 上進(jìn)行qPCR 反應(yīng)。每個(gè)樣品的每個(gè)引物均設(shè)置一個(gè)空白對(duì)照，并通過兩個(gè)以上的陽性重復(fù)確認(rèn)擴(kuò)增。100 nL的反應(yīng)體系：1× LightCycler 480 SYBR Green Imaster，500 nmol/L each primer，DNA template 2 ng/μL。PCR 反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃，10 min；(95 ℃, 30 s; 60 ℃, 30 s) 40 上cycles+ 溶解曲線。qPCR 結(jié)果使用儀器的qPCR 軟件進(jìn)行自動(dòng)分析。Ct = 31 設(shè)為檢出域，滿足曲線擬合分析的則判為檢出。計(jì)算耐藥基因的相對(duì)拷貝數(shù)，并通過標(biāo)準(zhǔn)化將 16S rRNA 基因拷貝數(shù)轉(zhuǎn)化為絕對(duì)拷貝數(shù)，這些基因拷貝數(shù)從Wafergen 平臺(tái)單獨(dú)量化 (Chenet al., 2016; Yanet al., 2021)。利用qPCR 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)檢出的耐藥基因數(shù)量、種類、抵抗機(jī)制和抵抗的抗生素種類。

1.7 大腸桿菌毒力基因PCR檢測(cè)

以大腸桿菌分離株基因組DNA 為模板，根據(jù)Ewers 等 (2005) 選取10 類，共計(jì)13 種大腸桿菌常見毒力基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增 (表2)，檢測(cè)本研究分離鑒定到的大腸桿菌毒力基因攜帶情況。PCR 反應(yīng)體系為25 μL：模板DNA 2 μL、2×Dream Taq Green PCR 預(yù)混液 12.5 μL、ddH2O 8.5 μL、上下游引物各1 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，66 ℃ 45 s，72 ℃ 50 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后放入凝膠成像儀對(duì)其進(jìn)行條帶分析，并送生工生物工程 (上海) 股份有限公司測(cè)序后在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)。

表2 大腸桿菌檢測(cè)毒力基因引物信息表Table 2 Primers for detection of virulence genes of E. coli

1.8 致瀉性大腸桿菌PCR檢測(cè)

為掌握本研究中大腸桿菌分離株的致病情況，按食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) (大腸桿菌GB 4789.6—2016)對(duì)5 種致瀉性大腸桿菌 (腸道致病性大腸桿菌EPEC、腸道出血性大腸桿菌EHEC、腸道產(chǎn)毒性大腸桿菌ETEC、腸道集聚性大腸桿菌EAEC 和腸道侵襲性大腸桿菌EIEC) 攜帶情況進(jìn)行了檢測(cè)。5 種致瀉性大腸桿菌的引物序列和陽性標(biāo)準(zhǔn)見表3，以大腸桿菌分離株DNA為模板，PCR反應(yīng)體系為25 μL：模板 DNA 2 μL、2×Dream Taq Green PCR 預(yù)混液12.5 μL、ddH2O 8.5 μL、上下游引物各 1 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃1.5 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后放入凝膠成像儀對(duì)其進(jìn)行條帶分析，并送生工生物工程 (上海) 股份有限公司測(cè)序后在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)。

表3 致瀉性大腸桿菌的引物序列與陽性標(biāo)準(zhǔn)Table3 Primer sequence and positive criteria of diarrhoeal E. coli

1.9 數(shù)據(jù)分析

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 20.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，P＜ 0.05表示組間有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離純化培養(yǎng)結(jié)果

243 份樣品接種BHI 肉湯增菌培養(yǎng)后使用一次性接種環(huán)劃線接種到伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)并進(jìn)行鑒別：黑色帶金屬光澤、光滑的單個(gè)菌落為疑似大腸桿菌，共挑取86 株疑似菌株單菌落接種到BHI 肉湯進(jìn)行細(xì)菌純化培養(yǎng)。對(duì)純化后的疑似菌株進(jìn)行革蘭氏染色和鏡檢，結(jié)果顯示：疑似菌株菌體呈兩端鈍圓、粉紅色的革蘭氏陰性桿菌，大小0.5 × 1 ～ 3 μm。

2.2 大腸桿菌生化鑒定結(jié)果

取新培養(yǎng)的疑似菌株進(jìn)行生化鑒定培養(yǎng)，結(jié)果顯示：受檢疑似菌株均表現(xiàn)為吲哚、觸酶、葡萄糖產(chǎn)氣、阿拉伯糖、硝酸鹽還原、麥芽糖、甘露醇、山梨醇和賴氨酸脫羧酶陽性；阿東醇、VP、谷氨酸、苯丙氨酸、硫化氫實(shí)驗(yàn)均為陰性；86株疑似菌株中有76株 (88.37%) 分離株乳糖陽性，54株(62.79%) 蔗糖陽性，64株 (74.42%) 木糖陽性，72株(83.72%) 精氨酸陽性，69株 (80.23%) 鳥氨酸陽性，受檢菌株與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》中大腸桿菌生化特征一致，表明86株疑似菌株可能為大腸桿菌。

2.3 大腸桿菌16S rRNA PCR鑒定結(jié)果

86 株疑似菌株提取DNA，通過PCR 擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA 基因，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)在1 500 bp處出現(xiàn)條帶，將該產(chǎn)物送生工生物工程 (上海) 股份有限公司測(cè)序后在NCBI 數(shù)據(jù)庫比對(duì)，結(jié)果顯示分離菌株與GenBank 中大腸桿菌同源性高于99%。對(duì)分離鑒定的大腸桿菌的16S rRNA 序列利用MEGA 11.0 軟件中Neighbor-joining 法繪制系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，所有序列均與大腸桿菌 (X80724.1) 聚為一支，與金黃色葡萄球菌 (L37597.1)、肺炎克雷伯菌 (AB642256.1)、綠膿桿菌 (AM419153.2)分開 (圖2)。根據(jù)分子生物學(xué)結(jié)果并結(jié)合菌株染色、鏡檢和生化鑒定特征，確認(rèn)從243份樣本中分離到大腸桿菌86 株，分離率為35.39% (86/243)。大腸桿菌在3個(gè)保護(hù)區(qū)中均有分布，分析發(fā)現(xiàn)毛寨自然保護(hù)區(qū)土壤中大腸桿菌分離率極顯著高于東陽溝和唐家河自然保護(hù)區(qū) (P＜ 0.01)；糞便樣本大腸桿菌分離率為53.23% (66/124)，土壤樣本為18.57% (13/70)，水樣為14.29% (7/49)；糞便和水在3個(gè)保護(hù)區(qū)的分離率沒有顯著差異 (P＞ 0.05) (圖3)。

圖2 三個(gè)自然保護(hù)區(qū)分離鑒定的部分大腸桿菌16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹. 編號(hào)EC01～EC30為分離到的大腸桿菌菌株；圖中僅展示節(jié)點(diǎn)自展值高于50%的值Fig.2 Phylogenetic tree of E. coli isolated from three nature reserves based on 16S rRNA sequence. Numbers EC01 - EC30 were suspected Esch‐erichia coli strains isolated from samples; the bootstrap value below 50% was not shown

圖3 三個(gè)自然保護(hù)區(qū)分離的大腸桿菌在各類樣本中的分離情況.** P ＜ 0.01Fig. 3 Isolation of E. coli isolated from various samples in three nature reserves.** P ＜ 0.01

2.4 大腸桿菌藥敏實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

對(duì)分離鑒定的86 株大腸桿菌采用K-B 法進(jìn)行15 種臨床常見抗生素的敏感性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示：大腸桿菌分離株對(duì)阿莫西林的耐藥率最高(52.33%)，對(duì)鏈霉素、氨芐西林、阿奇霉素、四環(huán)素、頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、多西環(huán)素、卡那霉素、慶大霉素和復(fù)方新諾明的耐藥率較低 (1.16% ～9.30%)，對(duì)頭孢他啶、氯霉素、氟苯尼考、甲氧芐氨嘧啶均敏感 (圖4)。此外，3 個(gè)保護(hù)區(qū)分離的大腸桿菌均對(duì)阿莫西林、鏈霉素和氨芐西林有不同程度的耐藥性，唐家河保護(hù)區(qū)分離的大腸桿菌對(duì)阿莫西林的耐藥率最高 (83.33%)，東陽溝和毛寨分別為55.56%和17.24%；鏈霉素耐藥率唐家河、東陽溝、毛寨分別為3.33%、18.52%、6.90%，氨芐西林耐藥性3 個(gè)保護(hù)區(qū)為3.33% ～7.41%；此外，東陽溝和毛寨分離的大腸桿菌還對(duì)阿奇霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星具有耐藥性 (3.45% ～18.52%)；僅東陽溝分離的大腸桿菌對(duì)多西環(huán)素、卡那霉素、慶大霉素、復(fù)方新諾明具有耐藥性，耐藥率為3.70% ～ 7.41% (表4)。

圖4 三個(gè)自然保護(hù)區(qū)分離的大腸桿菌藥敏結(jié)果熱圖Fig. 4 Heat map of drug sensitivity results of E. coli isolated from three nature reserves. AMX: Amoxicillin, S: Streptomycin, AM: Ampicillin,AZM: Azithromycin, TE: Tetracycline, CTX: Cefotaxime, CIP: Ciprofloxacin, DX: Doxycyline, K: Kanamycin, GM: Gentamicin, SXT: Compound Sulfamehoxazole, CAZ: Ceftazidime, C: Chloramphenicol, FON: Florfenicol, TMP: Trimethoprim

表4 三個(gè)自然保護(hù)區(qū)分離的大腸桿菌藥敏結(jié)果情況表Table 4 Drug sensitivity result of E. coli isolated from three nature reserves

2.5 大腸桿菌耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

對(duì)86 株大腸桿菌分離株進(jìn)行53 種耐藥基因的檢測(cè)結(jié)果顯示，所有耐藥基因均被檢測(cè)到。不同類別耐藥基因檢出率為：多重耐藥類83.14%、磺胺類55.52%、四環(huán)素類48.52%、β-內(nèi)酰胺類35.72%、 大環(huán)內(nèi)酯類30.52%、 氨基糖苷類30.23%、氯霉素類26.98%、喹諾酮類26.16%；其中攜帶率排名前十的基因分別是dfrA12(97.67%)、tet(X1)(89.53%)、blaPER(86.05%)、acrA-05(83.72%)、acrA-04(82.56%)、tetB-02(82.56%)、ampC-04(81.40%)、tetD-02(80.23%)、blaOXY(75.58%)、tet(X2) (69.77%)，以上基因的豐度也排名前十 (圖5)。

圖5 三個(gè)自然保護(hù)區(qū)分離的大腸桿菌耐藥基因檢測(cè)結(jié)果熱圖Fig.5 Heat map of drug resistance genes result of E. coli isolated from three nature reserves

2.6 大腸桿菌毒力基因PCR檢測(cè)結(jié)果

采用PCR 方法檢測(cè)13 種大腸桿菌常見毒力基因 (irp2、FyuA、fimH、PapA、tsh、stx2f、ibeB、vat、ompA、iroN、mat、iucD、cva/cvi) 在86 株大腸桿菌分離株的攜帶情況。結(jié)果顯示：耶爾森毒力島中irp2和FyuA基因、外膜蛋白o(hù)mpA基因、侵襲素ibeB基因、血凝素tsh基因的檢出率分別為91.86% (79/86) 和17.44% (15/86)、69.77% (60/86)、55.81% (49/86)、52.33% (45/86)，以上確定為主要流行的毒力基因；另外I 型菌毛fimH基因的檢出率為19.77% (17/86)、P 型菌毛PapA基因僅1.16% (1/86)；stx2f、vat、iroN、mat、iucD、cva/cvi基因均未檢出 (圖6)。

圖6 三個(gè)自然保護(hù)區(qū)分離的大腸桿菌毒力基因檢測(cè)結(jié)果熱圖Fig.6 Heat map of virulence genes result of E. coli isolated from three nature reserves

2.7 致瀉性大腸桿菌PCR檢測(cè)結(jié)果

對(duì)86 株大腸桿菌分離株進(jìn)行針對(duì)5 種致瀉性大腸桿菌的檢測(cè)，結(jié)果顯示：所有致病性均為陰性，均未檢測(cè)出5種致瀉性大腸桿菌 (圖7)。

圖7 部分大腸桿菌分離株致瀉性大腸桿菌PCR檢測(cè)結(jié)果.A： pic基因；B：lt基因；C：sth基因；D：aggR基因；E：bfpB基因；F：invE基因. M：DL 1000分子量標(biāo)準(zhǔn)，1 ～ 4 為部分大腸桿菌分離菌株，P：陽性對(duì)照，N：陰性對(duì)照Fig. 7 Partial PCR test results for diarrheagenic E. coil . A: pic gene; B: lt gene; C: sth gene; D: aggR gene; E: bfpB gene; F: invE gene. M: DL 1000 marker, 1 - 4: partial E.coil isolates, P: positive control, N: negative control

3 討論

大腸桿菌病為三類疫病，可在人和動(dòng)物中流行，對(duì)其健康造成危害 (Guoet al., 2015)。本研究對(duì)大熊貓國家公園廣元片區(qū)3個(gè)保護(hù)區(qū)內(nèi)大熊貓等野生動(dòng)物的糞便及其環(huán)境中的水和土壤進(jìn)行大腸桿菌流行情況調(diào)查顯示，大腸桿菌在糞便、土壤、水中均廣泛分布，其中動(dòng)物糞便中最高，為53.23%，土壤和水中的分離率為18.57% 和14.29%。在地理分布上，大腸桿菌在3 個(gè)保護(hù)區(qū)均廣泛分布，而毛寨自然保護(hù)區(qū)土壤中大腸桿菌分布顯著高于其他兩個(gè)自然保護(hù)區(qū)。大腸桿菌的流行性存在一定的區(qū)域分布特征，該研究結(jié)果說明與其他兩個(gè)自然保護(hù)區(qū)相比，毛寨自然保護(hù)區(qū)野生動(dòng)物更有可能發(fā)生大腸桿菌病。在本研究并未發(fā)現(xiàn)致瀉性大腸桿菌的分布，說明該區(qū)不是致病性大腸桿菌的自然疫病地，但是應(yīng)注意人和家養(yǎng)動(dòng)物進(jìn)入保護(hù)區(qū)導(dǎo)致這些致病菌在該區(qū)域擴(kuò)散，造成這些疾病在該區(qū)域野生動(dòng)物間傳播。

野生動(dòng)物源大腸桿菌攜帶了大量的耐藥基因。野生東北虎源大腸桿菌攜帶了9種耐藥基因，其中mdf(A) 檢出率為94.12%，sitABCD檢出率為23.53% (閆爽，2022)。候鳥源大腸桿菌攜帶四環(huán)素類耐藥基因tet(A)、tet(B)、tet(M)；磺胺類耐藥基因sul1、sul2；氯霉素類耐藥基因floR、cmlA等(袁月，2022)。本研究分離到的大腸桿菌攜帶有大量的耐藥基因，8類常見抗生素的53種不同的耐藥基因均被檢測(cè)到，其中攜帶率最高的是多重耐藥類耐藥基因，該類基因可介導(dǎo)細(xì)菌對(duì)多種抗生素產(chǎn)生耐藥性。由此說明，不同區(qū)域來源的大腸桿菌攜帶的耐藥基因數(shù)量和種類都存在差異。耐藥基因調(diào)控了細(xì)菌的耐藥表現(xiàn)。

已有文獻(xiàn)報(bào)道野生動(dòng)物源大腸桿菌具有抗生素耐藥性。黑龍江省扎龍國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)圈養(yǎng)丹頂鶴源大腸桿菌對(duì)AMP、CEF 的耐藥率分別為57.5%、47.5% (魏正凱，2012)。野生東北虎和野生華北豹源大腸桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥率達(dá)100%，對(duì)四環(huán)素類抗生素耐藥率為20% (閆爽，2022)。黃旭程等 (2017) 對(duì)唐家河保護(hù)區(qū)扭角羚體內(nèi)分離的大腸桿菌進(jìn)行耐藥性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，分離菌株對(duì)所檢測(cè)的11 種抗生素均敏感。而本研究發(fā)現(xiàn)廣元片區(qū) (包括唐家河保護(hù)區(qū)) 分離到的大腸桿菌對(duì)阿莫西林、鏈霉素、氨芐西林有不同程度的耐藥性。由此說明該地區(qū)大腸桿菌耐藥性有日益上升的趨勢(shì)。廣元片區(qū)的大腸桿菌耐藥性可能與當(dāng)?shù)厣B(yǎng)式放牧有關(guān)。這提示當(dāng)?shù)貙?duì)野生動(dòng)物疫病防控應(yīng)采取圍欄的形式建立專門的放牧區(qū)與生態(tài)保護(hù)區(qū)，避免家養(yǎng)動(dòng)物進(jìn)入野生動(dòng)物棲息地，造成野生動(dòng)物攜帶耐藥性增加，威脅公共安全。

大腸桿菌的致病性往往與毒力因子密不可分，可能是由多種毒力因子共同決定的。毒力基因的檢出率與致病性有一定的聯(lián)系，一般來講，毒力基因攜帶越多，致病性越強(qiáng)，同時(shí)多種毒力因子的共同參與會(huì)增加致病的風(fēng)險(xiǎn)。本研究在3個(gè)自然保護(hù)區(qū)分離的大腸桿菌至少攜帶1種毒力基因，最高攜帶6種。黏附素是細(xì)菌表面一類具有黏附作用的結(jié)構(gòu)蛋白統(tǒng)稱，可分為菌毛黏附素和非菌毛黏附素，常見有I 型菌毛和P 型菌毛，fimH屬于I 型菌毛，papA 蛋白是P 型菌毛的主要成分，約占其質(zhì)量的99% (陸承平，2012)。菌毛對(duì)致病性大腸桿菌侵入機(jī)體，并在體內(nèi)定居、增值、釋放毒力因子起重要作用。而毒力基因papA在本研究中的攜帶率很低 (1.16%)，但fimC攜帶率相對(duì)較高(19.77%)。耶爾森毒力島基因irp2、外膜蛋白毒力基因ompA、侵襲素毒力基因ibeB、血凝素毒力基因tsh的攜帶率均較高 (＞ 50%)，前人研究表明這些毒力基因會(huì)對(duì)機(jī)體造成不同的損傷 (陸承平，2012；張忠等，2014；趙彤等，2019)，說明在野外環(huán)境 (野生動(dòng)物體內(nèi)及生境) 中的大腸桿菌具有一定的毒力，雖然暫未發(fā)現(xiàn)對(duì)野生動(dòng)物造成流行性疫病，但存在潛在威脅，因此進(jìn)一步的研究及持續(xù)的監(jiān)測(cè)是必要的。

綜上，大腸桿菌在大熊貓國家公園廣元片區(qū)的動(dòng)物糞便、土壤、水中廣泛分布，其中動(dòng)物糞便中分離率最高；在地理分布上，大腸桿菌在廣元片區(qū)的3個(gè)保護(hù)區(qū)均廣泛分布，但毛寨自然保護(hù)區(qū)土壤中大腸桿菌分布顯著高于其他兩個(gè)自然保護(hù)區(qū)；該區(qū)域大腸桿菌整體耐藥率較低，但有日益增加的趨勢(shì)；攜帶有不同數(shù)量的毒力基因，雖都不是致瀉性大腸桿菌，但對(duì)保護(hù)區(qū)內(nèi)野生動(dòng)物存在潛在威脅，應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)測(cè)。