邢寶瑞 趙海平 李光玉 孫紅梅 馬澤芳譚展清 胡肖 李晨瑩 吳建華 劉振*

（1 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，青島 266109）（2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長春 130022）（3 山東省安丘市人民醫(yī)院神經(jīng)外二科，濰坊 262100）

動物骨骼一生都處于持續(xù)的重塑狀態(tài)，在內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)控下，健康動物保持著成骨和破骨的動態(tài)平衡，這對維持正常的骨骼結(jié)構(gòu)和功能非常重要 (Kimet al., 2018)。研究表明，成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞是參與骨形成與重塑過程的主要功能細(xì)胞 (Remmerset al., 2021)，骨保護素 (Osteoprotegerin, OPG) 由成骨細(xì)胞分泌，其功能可明顯抑制破骨細(xì)胞的形成，通過抑制骨吸收來打破骨骼的動態(tài)平衡，促進(jìn)成骨 (Udagawaet al., 2021; Yaoet al., 2021)。

在人類醫(yī)學(xué)研究中，雌激素水平的降低是導(dǎo)致女性絕經(jīng)后骨質(zhì)流失的原因所在 (Lincoln and Tyler, 1994)；甲狀旁腺素1-34 (Parathyroid hormone 1-34, PTH 1-34) 具有明顯促進(jìn)成骨的作用(Bielliet al., 2021)。然而，在鹿茸的生長發(fā)育研究中，梅花鹿外周血雌二醇 (Estradiol, E2) 處于極低水平 (Bubeniket al., 2002；趙海平等，2018)，這與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松發(fā)生的致病機理極為相似 (Lincoln and Tyler, 1994)，為激素調(diào)控鹿茸成骨機制研究提供了借鑒。蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明，OPG 在鹿茸不同區(qū)段 (間充質(zhì)層、前軟骨層、過渡區(qū)、軟骨層) 的表達(dá)量差異顯著 (Yaoet al., 2018; Guoet al.,2021)，并且PTH 1-34 和E2水平與鹿茸成骨周期呈正相關(guān) (Gaspar-Lópezet al., 2010; Taoet al.,2015)。為探討甾體類激素對鹿茸間充質(zhì)干細(xì)胞(Antler mesenchymal stem cells, RMCs) 的分子調(diào)控機制，本研究以梅花鹿為研究對象，分離提取RMCs，在體外誘導(dǎo)模擬成骨，對比分析不同甾體類激素對RMCs增殖、成骨和相關(guān)基因表達(dá)的相關(guān)規(guī)律，為鹿茸成骨機制研究提供借鑒與參考。

1 研究方法

1.1 樣品采集與分組

采集4歲雄性梅花鹿15 ～ 20 d二杠茸，按照孫紅梅等 (2007) 方法培養(yǎng)RMCs 用于后續(xù)實驗?？瞻着囵B(yǎng)組 (DMEM + 10% FBS)、對照誘導(dǎo)組(DMEM + 10% FBS + 成骨誘導(dǎo)液)、PTH 1-34實驗組 (DMEM + 10% FBS+成骨誘導(dǎo)液 + 100 pmol/L /10 nmol/L / 1 μmol/L PTH 1-34) 和E2實驗組(DMEM + 10% FBS + 成骨誘導(dǎo)液 + 10 pmol/L /30 pmol/L / 60 pmol/L E2)。每500 mL成骨誘導(dǎo)液含β-甘油磷酸鈉 (Solarbio G9140) 1.5306 g、抗壞血酸 (Solarbio A8100) 0.0250 g、地塞米松 (Solarbio D8040) 1.9623 μg (地塞米松使用無水乙醇溶解，其他藥物使用DMEM溶解)。

1.2 鹿茸間充質(zhì)干細(xì)胞 (RMCs) 培養(yǎng)和誘導(dǎo)

RMCs 于培養(yǎng)液 (DMEM + 10% FBS + 1%雙抗) 中37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，所有試劑均購自Gibico 公司，細(xì)胞凍存液購自新賽美試劑公司。取第3 代RMCs，待細(xì)胞生長至培養(yǎng)瓶的80%，更換成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d，每3 d換液1次。

1.3 茜素紅染色

為評估甾體類激素對RMCs成骨的影響，將第3 代RMCs 成骨誘導(dǎo)21 d，PBS 清洗5 min × 3 次；4%多聚甲醛固定15 min，PBS 清洗5 min × 3 次；去除PBS漂洗液，6孔板每孔加入2 mL茜素紅S染色工作液 (源葉生物)，避光孵育40 min；去除染色液，PBS沖洗2遍終止反應(yīng)，鏡檢、觀察。

1.4 CCK-8細(xì)胞增殖實驗

該實驗用于評估甾體類激素對RMCs的增殖作用。取第3 代RMCs，使用細(xì)胞計數(shù)儀 (BodBoge)計數(shù)，5 × 102個細(xì)胞 (100 μL 培養(yǎng)液) 接種于96 孔板，隔天更換誘導(dǎo)液，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h，每孔添加10 μL CCK-8 溶液，在37 ℃、5%CO2條件下孵育2 h，酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光度。

1.5 基因和蛋白表達(dá)檢測

利用qRT-PCR 檢測甾體類激素對基因OPG及成骨標(biāo)志物SP7、SPARC和BGN的表達(dá)。將第3 代RMCs成骨誘導(dǎo)21 d，進(jìn)行RNA 提取，酶標(biāo)儀檢測OD 值為1.8 ～ 2.1，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，-80 ℃儲存。使用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計引物 (Taoet al., 2015)，生工生物公司合成，引物信息見表1。按照順序加入6 μL ddH2O，10 μL SYBR Green，2 μL cDNA (85 ng/μL)，正反引物各1 μL，共20 μL體系于96 孔板中，上機進(jìn)行定量，反應(yīng)程序為預(yù)變性3 min，變性30 s，退火30 s，延伸30 s，后延伸7 min，35個循環(huán)。

表1 引物信息Table 1 Primer information

經(jīng)過qRT-PCR 對OPG 表達(dá)的篩選，選擇對照誘導(dǎo)組、添加10 nmol/L PTH 1-34 組和10 pmol/L E2組進(jìn)行免疫印跡 (Western Blot) 驗證。將RMCs誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d，細(xì)胞計數(shù)，按每1×106個細(xì)胞加入100 μL 細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，12 000 r/min 離心5 min，取上清，測定蛋白濃度，蛋白濃度歸一化處理后，加入蛋白上樣緩沖液，95 ℃金屬浴10 min，配膠后總蛋白上樣量15 μg，SDS-PAGE電泳分離總蛋白，隨后轉(zhuǎn)移至0.22 μm PVDF 膜上，封閉后按1∶1 000 比例稀釋一抗，孵育過夜，搖床孵育二抗1 h，顯影劑曝光并采集圖像。使用Image J軟件分析目的條帶并進(jìn)行定量分析。

1.6 統(tǒng)計分析

細(xì)胞增殖實驗采用酶標(biāo)儀進(jìn)行光密度統(tǒng)計，Western Blot 采用Image J 軟件進(jìn)行光密度統(tǒng)計，qRT-PCR 等原始數(shù)據(jù)使用Excel 進(jìn)行預(yù)處理，實驗所得數(shù)據(jù)均采用Graphpad prism 8.0 軟件進(jìn)行One-way ANOVA 分析和作圖。ns: 無顯著差異，*P＜ 0.05，**P＜ 0.01，***P＜ 0.001。

2 結(jié)果

2.1 甾體類激素對細(xì)胞增殖的影響

RMCs 細(xì)胞增殖實驗結(jié)果顯示，添加各濃度PTH 1-34，成骨誘導(dǎo)24 h和96 h，細(xì)胞增殖速度較對照誘導(dǎo)組均無顯著性差異 (P= 0.250) (圖1a)；添加100 pmol/L PTH 1-34，誘導(dǎo)48 h，可極顯著提高RMCs 的增殖速度 (P= 0.019)；添加1 μmol/L PTH 1-34，誘導(dǎo)至72 h，可顯著提高RMCs的增殖速度 (P= 0.041)。添加各濃度E2，成骨誘導(dǎo)24 h和48 h，細(xì)胞增殖速度較對照誘導(dǎo)組均無顯著性差異(P= 0.130)；添加10 pmol/L E2，誘導(dǎo)至72 h 和96 h， RMCs 增殖速度被顯著抑制 (P= 0.014）；添加30 pmol/L E2組和60 pmol/L E2組，較對照誘導(dǎo)組無顯著差異 (圖1b)。

2.2 不同濃度甾體類激素對OPG mRNA 表達(dá)的影響

添加100 pmol/L PTH 1-34 組較對照誘導(dǎo)組OPG 的mRNA 表達(dá)水平無顯著差異 (P= 0.150)，添加10 nmol/L PTH 1-34組可極顯著 (P= 0.005) 上調(diào)OPG的mRNA表達(dá)水平，添加1 μmol/L PTH 1-34組可顯著 (P= 0.022) 下調(diào)OPG的mRNA表達(dá)水平 (圖2a)。較對照誘導(dǎo)組，添加10 pmol/L E2組可極顯著(P= 0.009) 上調(diào)OPG 的mRNA 表達(dá)，30 pmol/L E2組無顯著差異 (P= 0.150)，60 pmol/L E2組可顯著 (P= 0.023) 上調(diào)OPG 的mRNA 表達(dá)水平(圖2b)。

圖2 不同濃度甾體類激素對OPG mRNA 表達(dá)水平的影響. A:PTH 1-34組；b: E2組. Control：對照誘導(dǎo)組Fig. 2 Effect of steroid hormones on the expression level of OPG mRNA. a: PTH 1-34 group; b: E2 group

2.3 不同濃度甾體類激素對OPG蛋白表達(dá)的影響

添加10 nmol/L PTH 1-34 組可顯著 (P= 0.036)上調(diào)OPG 蛋白的表達(dá)水平；添加10 pmol/L E2組可極顯著 (P= 0.009) 下調(diào)OPG蛋白的表達(dá)水平 (圖3)。

圖3 甾體類激素對OPG蛋白表達(dá)水平的影響.Control：對照誘導(dǎo)組Fig. 3 Effect of steroid hormones on the expression level of OPG protein

2.4 甾體類激素對鹿茸RMCs成骨的影響

成骨誘導(dǎo)至第21 天，茜素紅染色結(jié)果顯示，對照誘導(dǎo)組 (圖4b) RMCs 被成功誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞并出現(xiàn)紅染的鈣結(jié)節(jié)；添加10 nmol/L PTH 1-34 組(圖4c) 出現(xiàn)更多數(shù)量的鈣結(jié)節(jié)；其他組別均未出現(xiàn)鈣結(jié)節(jié)。

圖4 甾體類激素對RMCs成骨的影響. a：空白培養(yǎng)組；b：對照誘導(dǎo)組；c：10 nmol/L PTH 1-34 實驗組；d：10 pmol/L E2 實驗組. 比例尺：200 μmFig. 4 Effect of steroid hormones on osteogensis of RMCs. a:DMEM + 10% FBS; b: DMEM + 10% FBS + osteogenic induction solution; c: DMEM + 10% FBS + osteogenic induction solution + 10 nmol/L PTH 1-34; d: DMEM + 10% FBS + osteogenic induction solution + 10 pmol/L E2. Scale bar: 200 μm

2.5 甾體類激素影響RMCs成骨的可能機制

結(jié)果顯示，添加10 nmol/L PTH 1-34 組與對照誘導(dǎo)組比較，可極顯著 (P= 0.001) 上調(diào)成骨轉(zhuǎn)錄因子SP7和BGN的mRNA 表達(dá)水平，極顯著下調(diào)SPARC的mRNA 表達(dá)水平；添加10 pmol/L E2組與對照誘導(dǎo)組比較，極顯著 (P= 0.007) 下調(diào)SP7、上調(diào)SPARC和BGN的mRNA表達(dá)水平 (圖5)。

圖5 甾體類激素對成骨標(biāo)志物mRNA 表達(dá)的影響. a：DMEM +10% FBS + 成骨誘導(dǎo)液 + 10 nmol/L PTH 1-34；b：DMEM + 10%FBS + 成骨誘導(dǎo)液 + 10 pmol/L E2；Control: 對照誘導(dǎo)組Fig. 5 Effect of steroid hormones on mRNA expression of osteogenic markers. a: DMEM + 10% FBS + osteogenic induction solution +10 nmol/L PTH 1-34; b: DMEM + 10% FBS + osteogenic induction solution + 10 pmol/L E2, Control: Control induction group

3 討論

3.1 甾體類激素對細(xì)胞增殖的影響

細(xì)胞的增殖分化是生物體生長發(fā)育的基礎(chǔ)，同時受到激素及眾多細(xì)胞因子的影響 (Yamaguchiet al., 2008)。已有研究表明，鹿茸的快速生長是基于鹿茸頂端RMCs 的增殖分化作用 (Liet al.,2014; Wanget al., 2019)。細(xì)胞增殖實驗結(jié)果表明，E2在成骨誘導(dǎo)96 h 后顯著抑制了RMCs 的增殖作用。在雌性馴鹿和雄性梅花鹿外周血E2與鹿茸生長相關(guān)性分析中，鹿茸骨化期外周血E2水平較其他時期均顯著升高 (Pereiraet al., 2005; Bielliet al., 2021)。由此推測，E2可能在鹿茸骨化期通過抑制細(xì)胞增殖，加速了鹿茸的骨化。本研究選擇PTH 的主要活性成分PTH 1-34，對RMCs 體外誘導(dǎo)分化，發(fā)現(xiàn)添加外源性PTH 1-34 對RMCs 增殖并無顯著差異。但在甲狀旁腺素相關(guān)蛋白 (Parathyroid hormone-related ptotein, PTHrP) 的研究中，PTHrP 能顯著提高鹿茸軟骨細(xì)胞的增殖活性 (Guoet al., 2013)。由于兩者來源并不相同，僅有部分核苷酸序列相同，功能并不完全相似，因此PTH和PTHrP 對鹿茸的生長發(fā)育作用更有待明確和深入研究。

3.2 PTH 1-34對OPG表達(dá)的影響

OPG 屬腫瘤壞死因子超家族成員，成骨細(xì)胞分泌的OPG 具有抑制破骨細(xì)胞分化的功能，對骨質(zhì)疏松治療具有明顯抑制骨流失的效果 (Shobacket al., 2020)。在干細(xì)胞研究中，OPG 表達(dá)的升高提示成骨細(xì)胞的成熟，隨后通過旁分泌，作用于破骨細(xì)胞前體來抑制破骨細(xì)胞分化 (Yasuda, 2021)。研究表明，鹿機體外周血PTH 水平變化與鹿茸的礦化密切相關(guān)，調(diào)節(jié)血清PTH 可明顯降低鹿茸的鈣化率 (Taoet al., 2015)。An等 (2019) 推測，PTH可能調(diào)節(jié)OPG 表達(dá)來打破骨骼的動態(tài)平衡，通過抑制破骨的方式促進(jìn)成骨。本研究表明，添加PTH 1-34 可顯著上調(diào)OPG 的表達(dá)，并通過成骨誘導(dǎo)和檢測成骨標(biāo)志基因的方法進(jìn)行了佐證，結(jié)果表明，添加PTH 1-34 明顯增加RMCs 的鈣結(jié)節(jié)產(chǎn)生，可顯著上調(diào)BGN和成骨轉(zhuǎn)錄因子SP7的mRNA 表達(dá)促進(jìn)成骨。據(jù)此推測，在鹿茸成骨過程中，PTH 1-34 可能通過促進(jìn)RMCs 分泌OPG 來抑制破骨，還可通過上調(diào)成骨轉(zhuǎn)錄因子SP7和BGN表達(dá)來促進(jìn)成骨。

3.3 E2對OPG表達(dá)的影響

E2是雌激素的主要成分，也是女性絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的主要原因之一 (Arceo-Mendoza and Camacho, 2021; Bhatnagar and Kekatpure, 2022)。細(xì)胞實驗中，外源性E2可顯著上調(diào)OPG 蛋白的表達(dá) (賈軍，2014)。在卵巢缺失的骨質(zhì)疏松小鼠模型中，飼喂以鹿角霜為主要成分的中藥方劑，可明顯改善OPG 的分泌來抑制骨流失，促進(jìn)成骨 (Liet al.,2021)。羅方成等 (1999) 研究證實鹿茸中含有微量的E2，推測觸發(fā)OPG 分泌增多的原因可能是由于E2導(dǎo)致；本研究結(jié)果表明，對RMCs添加外源性E2可顯著上調(diào)OPG mRNA 的表達(dá)。但在OPG 蛋白檢測時發(fā)現(xiàn)OPG 極顯著下調(diào)，出現(xiàn)mRNA 和蛋白表達(dá)水平相反的結(jié)果，賈軍 (2014) 在人成骨樣肉瘤細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)，E2可通過調(diào)控miR-145 的表達(dá)，靶向調(diào)節(jié)OPG mRNA 的表達(dá)進(jìn)而影響OPG 蛋白的表達(dá)，這與本研究結(jié)果相似。據(jù)此推測E2可能通過調(diào)節(jié)miRNA 進(jìn)而干預(yù)OPG的轉(zhuǎn)錄后翻譯過程，下調(diào)OPG 蛋白的表達(dá)。本研究結(jié)果表明，E2明顯抑制RMCs 鈣結(jié)節(jié)的產(chǎn)生，下調(diào)成骨轉(zhuǎn)錄因子SP7的mRNA 表達(dá)水平。在先前研究中，鹿機體外周血E2水平在生茸期極低 (高志光，1999)，尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)OPG 與鹿茸成骨周期的相關(guān)性研究。據(jù)此推測，在梅花鹿快速生茸期，E2水平的降低可能解除了對OPG 的抑制作用，OPG 通過抑制破骨細(xì)胞的分化促進(jìn)鹿茸成骨，具體調(diào)控機制還有待深入研究。

4 結(jié)論

RMCs 在成骨分化過程中，PTH 1-34 對RMCs的增殖無顯著差異，可顯著上調(diào)OPG 蛋白的表達(dá)水平來抑制破骨，通過上調(diào)成骨轉(zhuǎn)錄因子SP7和BGN的mRNA 表達(dá)來促進(jìn)成骨；E2對RMCs 增殖具有抑制作用，可極顯著下調(diào)OPG 蛋白和SP7基因的表達(dá)來抑制RMCs成骨。

致謝：感謝青島農(nóng)業(yè)大學(xué)與中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所的聯(lián)合培養(yǎng)，感謝鹿茸干細(xì)胞創(chuàng)新團隊和特種經(jīng)濟動物飼養(yǎng)團隊。