陳秋雨，任慧娟，王穎君，賈高鵬，韓艷秋，

1 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院血液科，呼和浩特 010050；2 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科；3 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)中心

EB病毒（EBV）是一種直接參與淋巴和上皮腫瘤發(fā)生的DNA皰疹病毒，又稱人皰疹病毒4型，世界上超過90%的人群普遍易感。EBV感染人體后可快速整合到宿主基因組中，以促進腫瘤發(fā)展［1］。早在1997年，EBV就被國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）列為Ⅰ類致癌物，每年可致20萬癌癥患者感染。EBV主要與上皮和淋巴源惡性腫瘤有關(guān)，包括鼻咽癌（NPC）、胃癌（GC）、肺淋巴上皮瘤樣癌（LELC）、乳腺癌、扁桃體癌、肝癌、惡性唾液腺腫瘤和甲狀腺癌、霍奇金淋巴瘤（HL）、非霍奇金淋巴瘤（NHL）等［2］。EBV主要通過唾液傳播，并可持續(xù)潛伏于人類的B細(xì)胞中，故與受感染的人接吻，公用個人物品（如牙刷、餐具或分享食物和飲料）均可致EBV感染。此外，EBV還可感染T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、漿細(xì)胞、鱗狀細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、上皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞等［3］，受感染的上皮細(xì)胞可在子宮頸或精液中發(fā)現(xiàn)，表明EBV有可能通過性接觸傳播。器官移植和輸血也可導(dǎo)致EBV傳播。因此，血液制品被認(rèn)為對輸血的受者具有潛在危險，特別是高危個體，包括器官移植和免疫缺陷患者。所以，在輸血前篩查EBV核酸基因分型尤其必要。近期，我們收集2023年1月—3月500例臨床用血，采用熒光PCR技術(shù)進行EBV核酸定量檢測，統(tǒng)計其感染率，并對EBV陽性標(biāo)本進行A/B、F/f、C/D分型，了解臨床用血導(dǎo)致EBV感染情況，旨在為今后的預(yù)防及治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2023年1月—3月內(nèi)蒙古呼和浩特地區(qū)感染四項篩查結(jié)果為陰性的獻血者所獻去白懸浮紅細(xì)胞血樣，血液樣品按照《醫(yī)療機構(gòu)臨床用血管理辦法》進行處理和儲存，從中隨機抽取500例，取血袋小辮作為檢測樣本。

1.2 樣本制備及DNA提取 將枸櫞酸抗凝的去白懸浮紅細(xì)胞標(biāo)本1 mL加入離心管后，再混入等量無菌生理鹽水，混勻。取另一離心管，置入1 mL人外周血淋巴細(xì)胞分離液。將稀釋后的血樣加入淋巴細(xì)胞分離液中，700 g離心20 min（離心半徑7 cm）。根據(jù)密度梯度取白色細(xì)胞層，該層為單個核細(xì)胞層，將其用移液器吸至無菌離心管中，17 000 g離心10 min（離心半徑12.5 cm）后取沉淀備用。

1.3 EBV核酸定量 采用RT-PCR法。取2 μL模板DNA加入PCR反應(yīng)緩沖液中，設(shè)立陰、陽性對照及定量標(biāo)準(zhǔn)參考品。置于熒光定量PCR儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）檢測。擴增條件參照試劑說明書。反應(yīng)程序結(jié)束后，觀察擴增分析曲線及Ct值。樣本Ct值≤26時判斷為陽性，根據(jù)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線計算核酸載量。如果增長曲線不呈S形曲線或Ct值=30，則判定樣本中的EBV DNA含量小于檢測極限，結(jié)果呈陰性。如果增長曲線呈S形曲線且Ct值<30，則判定為EBV DNA結(jié)果陽性。

1.4 EBV基因分型檢測 采用RT-PCR法。取血袋小辮枸櫞酸抗凝全血1 mL，采用天根試劑盒按照說明書提取DNA，將提取的核酸保存到－80 ℃冰箱備用。EBV分型所用引物序列：A/B分型正向引物：5′-AGAAGGGGAGCGTGTGTTGT-3′，反向引物：5′-GGCTCGTTTTTGACGTCGGC-3′；F/f分型正向引物：5′-TCCCACCTGTTACCACATTC-3′，反向引物：5′-GGCAATGGGACGTCTTGTAA-3′；C/D分型正向引物：5′-ACCTGCTACTCTTCGGAAAC-3′，反向引物：5′-TCTGTCACAACCTCACTGTC-3′。PCR反應(yīng)體系：Taq Plantinum PCR MasterMix 12.5 μL，引物各1 μL，模板DNA 2 μL，加入雙蒸水將總體積補足至25 μL。擴增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共擴增45個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。將A/B、F/f分型和C/D分型的PCR產(chǎn)物與BamHI配成反應(yīng)體系，30 ℃下孵育1 h，取5 μL PCR擴增產(chǎn)物于加入3%的瓊脂糖凝膠（已加入染液）中電泳，凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 臨床用血的EBV檢出情況 500例血液制品樣本中有44例檢測到有EB病毒DNA拷貝，陽性率為8.8%（44/500）。

2.2 EBV陽性的血制品分型結(jié)果 EBV可分為A、B兩型，條帶為153 bp者為A型（Type A），其檢出率為36.36%（16/44），條帶為246 bp為B型（Type B），其檢出率為63.64%（28/44），而同時出現(xiàn)153 bp和246 bp條帶者為A型和B型混合感染（Type A+Type B），本實驗中無兩型混合感染。EBV陽性的血制品F型檢出率為79.55%（35/44），f型的檢出率為20.45%（9/44），無兩型混合感染。EBV陽性的血制品C型檢出率為70.45%（31/44），D型檢出率為29.55%（13/44），無兩型混合感染。

3 討論

多數(shù)關(guān)于包括EBV在內(nèi)的病毒感染流行病學(xué)研究基于血清學(xué)檢測，而不是基于EBV病毒血清檢測。測量血循環(huán)中病毒載量能更好地反映感染狀況。最近SMATTI等［4］對來自卡塔爾不同民族的673名健康獻血者的全血進行EBV DNA檢測，結(jié)果表明其病毒血癥率高達52.6%，病毒載量在0.915~2 585.5拷貝/mL。對不同國家獻血者EBV DNA進行檢測，其中日本是39.5%，美國是72%，葡萄牙是37.2%，中國是51.4%［5-6］。而本研究中，通過對呼和浩特地區(qū)500例去白懸浮紅細(xì)胞進行EBV DNA檢測，統(tǒng)計得出病毒血癥率為8.8%，大部分陽性標(biāo)本的病毒載量處于500～1 000拷貝/mL?？梢娙^去白后的懸浮紅細(xì)胞所含EBV核酸的可能性較大，如果將所獻全血直接輸注到受血者身體中，則感染EBV的可能性大，即使經(jīng)過去除白細(xì)胞的處理也不能全部將EBV核酸清除，仍有病毒感染風(fēng)險。

事實上，臨床用血中心通過去白的操作從各種血液制品中去除白細(xì)胞，減少EBV核酸的數(shù)量，防止EBV陽性供體通過輸血傳播病毒，并保證血液制品的安全性。然而去白的過程雖然減少了血制品的病毒載量，但并沒有消除通過血液制品傳播EBV的風(fēng)險，因為病毒仍可在白細(xì)胞減少的血液中檢測到。因此，血液制品被認(rèn)為對輸血者仍有潛在危險，尤其是器官移植和免疫功能低下者［7］。本實驗中對已經(jīng)去白細(xì)胞處理的懸浮紅細(xì)胞標(biāo)本進行檢測，仍可檢出有EBV核酸存在，如果該血制品被輸注到受血者體內(nèi)，則被感染EBV的可能性增大。

EBV感染宿主可通過唾液傳播，少數(shù)經(jīng)輸血和器官移植途徑進入體內(nèi)。EBV基因組由線性雙鏈DNA組成，基因組大小為168~184 kbp，編碼約85個基因［8］。EB病毒感染后的B淋巴細(xì)胞表達6種核蛋白（EBNA1、EBNA2、EBNA3A、EBNA3B、EBNA3C、EBNA2LP），3種膜蛋白（LMP1、LMP2A、LMP2B）及兩種小的非聚腺苷?；腞NA（ENER1、EBER2）［9］。EBV可分為A型和B型，這兩種基因型基于EBNA-2基因的差異區(qū)分［10］。

EBV類型在世界范圍內(nèi)出現(xiàn)，但地理分布不同。如A型在來自歐洲、美洲、中國和南亞的人群中普遍存在，而B型在非洲和巴布亞新幾內(nèi)亞人群中更常見［11］。免疫受損患者更容易獲得這兩種類型。最近對卡塔爾健康獻血者進行的一項研究中報告了A型（72.5%）與B型（3.5%）相比占優(yōu)勢，并且在4%的樣本中檢測到兩種基因型的混合感染［4］。CORREA等［12］對阿根廷的EBV無癥狀攜帶者進行研究發(fā)現(xiàn)，A型EBV感染占75.9%，B型占14.6%，并且兩種類型的共感染占6.5%。不同的EBV類型在轉(zhuǎn)化能力上不同，體外實驗顯示A型比B型更容易轉(zhuǎn)化B淋巴細(xì)胞，可能與B型EBV感染的淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞系中較低水平的 LMP1表達有關(guān)，且當(dāng)重組B型病毒獲得A型EBNA-2A基因時，它獲得了A型病毒的轉(zhuǎn)化能力。在EBV感染人源化小鼠后，A型與B型產(chǎn)生淋巴瘤的比率相似，但感染B型EBV毒株的B細(xì)胞具有更多的裂解蛋白表達和EBV轉(zhuǎn)化的淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞系［13］。在MONTEIRO等［14］進行的一項回顧性研究中，B型EBV感染的臨床病程比A型EBV更長，平均發(fā)熱持續(xù)時間為17.6 d（1~90 d），而A型EBV的平均發(fā)熱時間為14.8 d（1~30 d）。與感染B型EBV 或同時感染A型和B型EBV的患者相比，年齡在14歲及以上的A型EBV感染患者的肝酶平均水平更高。本研究中，在500名呼和浩特地區(qū)的臨床用血中檢測到EBV的標(biāo)本中，測得A型感染率為36.36%（16/44），B型感染率為63.64%（28/44）。通過與其他國家比較可知，無論有無癥狀的被調(diào)查者均以A型為主，本實驗結(jié)果以B型感染為主，與其他國家的報告有所差別。44例EBV DNA陽性的去白懸浮紅細(xì)胞標(biāo)本中以BCF型EBV感染為主；張小團［15］對湖南部份地區(qū)疑似EBV感染兒童的咽拭子進行檢測，結(jié)果以ACF型為主。

本研究中，健康人群仍以F型為主要流行類型。與基因型F的情況一樣，中國和非洲的鼻咽癌患者EBV感染以C基因型為主，檢出率幾乎為100%，美國和韓國的鼻咽癌患者血液中僅發(fā)現(xiàn)EBV基因型D，而在斯洛文尼亞鼻咽癌患者中EBV基因型C和基因型D均可檢出［16］。研究表明，ADF型是乳腺癌患者最普遍的EBV基因型組合［17］。本研究中呼和浩特地區(qū)臨床用血所感染的EBV以BCF型為主，與報道結(jié)果有所差異，提示EBV基因變異與疾病相關(guān)。

綜上所述，感染四項陰性獻血者輸血時有EBV感染的可能，EBV陽性樣本中，多以B、C、F型為主。