石源睿 董海濤 常璐 呂運韜 賈小云 張紅梅 唐銳敏

關(guān)鍵詞：八氫番茄紅素脫氫酶；ζ-胡蘿卜素脫氫酶；類胡蘿卜素；馬鈴薯；基因表達

馬鈴薯（SolanumtuberosumL.）是僅次于水稻、小麥和玉米的世界第四大糧食作物，最早在南美洲安第斯地區(qū)被發(fā)現(xiàn)，在秘魯被馴化，是一種與社會經(jīng)濟發(fā)展密切相關(guān)的優(yōu)勢作物[1]。其與谷類作物單位面積的可食用干物質(zhì)產(chǎn)量幾乎相同，是工業(yè)和食品加工原料的重要來源[2]。其含有豐富的類胡蘿卜素，是一類高度不飽和的萜類化合物[3]，作為植物光合作用中光吸收的輔助色素，是植物光合膜的重要組成部分[4-5]。類胡蘿卜素可與多種自由基發(fā)生拮抗脂質(zhì)的過氧化反應(yīng)[6-8]，具有延緩衰老的效果；同時還能有效防止心血管、冠狀動脈粥樣硬化以及血栓性等疾病的發(fā)生[9]。此外，類胡蘿卜素進入人體被吸收后會轉(zhuǎn)化成維生素A，以達到保護視力的效果[10]。

在植物體內(nèi)，異戊烯焦磷酸（IPP）和二甲基丙烯基二磷酸（DMAPP）經(jīng)過一系列的氧化還原反應(yīng)合成β-類胡蘿卜素[11]?；閰f(xié)同作用的八氫番茄紅素脫氫酶（PDS）和ζ-胡蘿卜素脫氫酶（ZDS）是類胡蘿卜素合成途徑中的限速酶[12]。無色的八氫番茄紅素在PDS和ZDS的脫氫作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榉凵姆鸭t素，進而生成β-類胡蘿卜素[13]，共同參與調(diào)控植物生長發(fā)育過程中類胡蘿卜素的代謝途徑。目前，已有許多研究表明，PDS和ZDS基因?qū)儆谕椿?，在系統(tǒng)中可歸為一類[14]?；襞嗟萚15]、TRAVELLA等[16]研究表明，類胡蘿卜在植物體內(nèi)主要存在于葉綠體及許多花和植物的有色體中，與植物的光合作用及葉、花和果實的顏色形成密不可分。當植株內(nèi)的PDS被沉默時，其葉片會發(fā)生白化，導致其色素含量改變，從而使其光合作用受阻。吳建設(shè)等[17]、陳段芬等[18]分別對不同生長時期的觀賞性向日葵和中國水仙內(nèi)的PDS表達進行研究，證實了PDS表達量的增加與花色的加深有關(guān)。在三汁蜜柚果實成熟過程中，隨著果實顏色的加深，其汁胞、囊衣和海綿層中CmZDS的表達量呈現(xiàn)穩(wěn)定上升的趨勢[19]，在芒果中也有類似發(fā)現(xiàn)[20]。分析成熟時期番木瓜果實、葉片和花中PDS和ZDS基因的表達量發(fā)現(xiàn)，富含類胡蘿卜素的果實中的表達量要顯著高于葉片和花[21-23]。彩色馬鈴薯塊莖中富含類胡蘿卜素和花青素等次生代謝物，使其成為開發(fā)功能食品的理想資源[24]。

本研究從黃心馬鈴薯晉薯16號品種中分別克隆PDS和ZDS基因，利用生物信息學工具對這2個基因及其所編碼的蛋白序列進行分析，并對二者在不同組織內(nèi)的表達模式進行定量檢測，旨在解析馬鈴薯PDS和ZDS在類胡蘿卜素合成途徑中的調(diào)控作用，為后續(xù)馬鈴薯品種的創(chuàng)新及培育奠定一定分子基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試黃心馬鈴薯為晉薯16號（Jinshu16），脫毒苗由山西省薯類脫毒中心提供；紅心馬鈴薯紅玫瑰2號（RedRose2）和紫心馬鈴薯為希森8號（Xisen8），脫毒苗均由山東省樂陵市希森薯業(yè)有限公司提供。將3個品種4周齡的組織培養(yǎng)苗轉(zhuǎn)移至Hogellan溶液中煉苗，7d后移至基質(zhì)中生長，培養(yǎng)于（22±1）℃、14h光照/10h黑暗條件的溫室中生長，100d后收獲新鮮塊莖。轉(zhuǎn)化所用菌株為大腸桿菌（Escherichiacoli）DH5α，由山西農(nóng)業(yè)大學生命科學學院分子生物學實驗室保存?？寺≥d體是PMD19-TVector。

1.2 總RNA的提取及cDNA的合成

取每個品種種植100d的馬鈴薯根、莖、葉和塊莖各0.1g，用液氮快速冷凍后進行研磨。每個樣品進行3個生物學重復。使用RNA提取試劑盒（華越洋，北京）對不同品種的馬鈴薯各組織總RNA進行提取。后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳對所提取RNA的完整性和質(zhì)量進行檢測，并根據(jù)TaKara反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書（TaKara，大連）對所提取的RNA反轉(zhuǎn)錄。

1.3 馬鈴薯StPDS和StZDS基因克隆

根據(jù)NCBI網(wǎng)站中查到的馬鈴薯StPDS和StZDS預測序列（XM_015306724.1，XM_015308927.1）設(shè)計克隆引物（表1）。

以上述反轉(zhuǎn)錄所得到的cDNA為模板分別對StPDS和StZDS進行PCR克隆（邁維生物，武漢），反應(yīng)程序為：94℃預變性2min；94℃下變性30s，48℃（StPDS）/43.6℃（StZDS）退火30s，72℃延伸1min，35個循環(huán)；72℃終延伸2min。擴增產(chǎn)物通過凝膠回收試劑盒（AxygenScientificInc.，Unioncity，USA）將目的片段回收，并與PMD19-T相連，獲得重組質(zhì)粒PMD19-T-StPDS和PMD19-T-StZDS。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，并將其涂布于含有氨芐霉素的LB平板培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)15～17h，挑取單克隆進行菌落PCR，將陽性克隆所提取的質(zhì)粒（優(yōu)逸蘭迪，蘇州）送上海生工生物公司測序，陽性克隆的菌液和所提質(zhì)粒凍于-80℃保存。

1.4 馬鈴薯StPDS和StZDS基因的生物信息學分析

生物信息學分析軟件如表2所示，分別對StPDS和StZDS轉(zhuǎn)錄起始位點上游1000bp的基因啟動子區(qū)順式作用元件進行預測，并對其編碼蛋白的親疏水性、理化性質(zhì)、跨膜結(jié)構(gòu)、信號肽、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)及互作蛋白進行分析。利用馬鈴薯StPDS和StZDS的蛋白序列，通過BlastP在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索其他植物PDS和ZDS的蛋白序列，使用MEGA7.0軟件，構(gòu)建Neiber-Joing（NJ）系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap分析重復數(shù)為1000。

1.5 馬鈴薯塊莖中類胡蘿卜素含量的測定

取適量的馬鈴薯塊莖用液氮快速冷凍后研磨成粉狀，稱取約0.15g塊莖樣品置于50mL離心管中，加入15mL丙酮，于4℃黑暗處放置1～2h，直至粉末為灰白色，4000r/min離心10min，吸取上清液測定其在454nm處的吸光值。

1.6 馬鈴薯StPDS和StZDS基因的表達模式分析

根據(jù)馬鈴薯StPDS和StZDS基因序列設(shè)計特異性定量引物（表1），以晉薯16號、紅玫瑰2號和希森8號的根、莖、葉和薯塊的cDNA為模板，EF-1α為內(nèi)參，根據(jù)實時熒光定量PCR試劑盒說明書（Takara，大連），通過BIO-RADCFX96熒光定量儀對馬鈴薯StPDS和StZDS基因進行不同品種不同組織的表達模式分析。每個樣品進行3個重復。根據(jù)2-ΔΔCt法分析計算結(jié)果，并使用SPSSStatisticsv22對試驗數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯StPDS和StZDS基因克隆

提取晉薯16號塊莖中RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，對其進行檢測后反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以StPDSPF/PR和StZDS-PF/PR為克隆引物，PCR擴增產(chǎn)物如圖1-A所示，在2條泳道上各得到了1條特異性條帶，將這2條目的片段割膠回收、連接PMD19-T載體、轉(zhuǎn)化大腸桿菌后進行菌落PCR，檢測到目的片段（圖1-B、C）。進一步測序結(jié)果表明，StPDS和StZDS的cDNA長度分別為1752、1767bp，與NCBI網(wǎng)站中預測的馬鈴薯PDS和ZDS基因進行比對，一致度分別為99.40%和99.35%（圖1-D、E）。

2.2 馬鈴薯StPDS和StZDS的生物信息學分析

2.2.1 馬鈴薯StPDS和StZDS理化性質(zhì)分析 如圖2、3所示，StPDS基因編碼583個氨基酸，蛋白的分子質(zhì)量為64.97ku，理論等電點為6.41；StZDS基因編碼588個氨基酸，分子質(zhì)量約為64.73ku，理論等電點為8.51，二者均為無跨膜結(jié)構(gòu)的親水不穩(wěn)定蛋白。

2.2.2 馬鈴薯StPDS和StZDS蛋白結(jié)構(gòu)分析和信號肽預測 如圖4所示，在馬鈴薯StPDS的二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋和無規(guī)則卷曲所占比例較高，分別為38.25%和41.34%；β-片層和β-轉(zhuǎn)角所占比例較少，分別為16.64%和3.77%；其三級結(jié)構(gòu)預測表明，其蛋白質(zhì)可能具有5個較為保守的結(jié)構(gòu)域。而StZDS二級結(jié)構(gòu)由40.99%的α-螺旋、16.5%的β-片層、3.57%的β-轉(zhuǎn)角和38.95%的無規(guī)則卷曲構(gòu)成；其三級結(jié)構(gòu)預測表明，其蛋白質(zhì)可能具有5個較為保守的結(jié)構(gòu)域。此外，2個蛋白均無信號肽，為非分泌蛋白，這一結(jié)果也與其在細胞內(nèi)發(fā)揮的功能相適應(yīng)。

2.2.3 馬鈴薯StPDS和StZDS的啟動子元件預測 利用Menu網(wǎng)站對StPDS及StZDS的啟動子（取轉(zhuǎn)錄起始位點上游2000bp）進行預測，結(jié)果如圖5所示，二者均具有較多的光響應(yīng)元件（如TCCCmotif、TCT-motif、Box4、G-box等）和逆境有關(guān)的調(diào)控元件（如響應(yīng)低溫脅迫（LTR）和干旱脅迫（MBS））。其中，StPDS還具有抗氧化反應(yīng)的調(diào)控元件（ARE）；對StPDS及StZDS的啟動子元件預測的結(jié)果進行分析，推測馬鈴薯PDS及ZDS基因的表達可能受到光調(diào)節(jié)及激素和逆境的誘導與調(diào)節(jié)。

2.2.4 馬鈴薯StPDS和StZDS的系統(tǒng)進化分析在NCBI數(shù)據(jù)庫中分別下載二穗短柄草（Brachypo?diumdistachyon）（XP_003558653.1）、玉米（Zeamays）（NP_001338939.1）、木薯（Manihotesculenta）（XP_021613095.1）、擬南芥（Arabidopsisthaliana）（NP_193157.1）、向日葵（Helianthusannuus）（XP_022013639.1）、煙草（Nicotianatabacum）（XP_019244024.1）、辣椒（Capsicumannuum）（XP_016562403.2）、野生番茄（Solanumpennellii）（XP_027771295.1）、番茄（Solanumlycopersicum）（NP_001234095.1）共9個物種PDS的同源序列，以及番木瓜（CaricapapayaLinn）（XP_021891252.1）、小球藻（Chlorellavariabilis）（XP_005843062.1）、木薯（XP_043815084.1）、擬南芥（NP_001319473.1）、玉米（NP_001105609.2）、向日葵（XP_022010060.1）、煙草（NP_001312062.1）、辣椒（NP_001311497.1）、番茄（NP_001234383.2）共9個物種的ZDS蛋白質(zhì)氨基酸序列。利用MEGA-X對上述序列進行進化樹分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖6），馬鈴薯PDS及ZDS均與同為茄科植物的番茄和野生番茄的同源關(guān)系最近，推測它們可能在馬鈴薯內(nèi)發(fā)揮著與番茄PDS、ZDS相近的功能。

2.3 馬鈴薯StPDS蛋白互作預測

使用String軟件（https：//cn.string-db.org/）對馬鈴薯StPDS（Phytoenedehydrogenase）互作蛋白進行預測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖7），StPDS與StZDS（Zeta-Carotenedesaturase）、StLYCe（Lycopeneepsiloncyclase）等酶蛋白存在互作關(guān)系。

2.4 馬鈴薯塊莖中類胡蘿卜素含量測定及StPDS和StZDS表達模式分析

對3個不同品種馬鈴薯葉片及塊莖中類胡蘿卜素的含量進行檢測并分析，結(jié)果如圖8所示，類胡蘿卜素在紅玫瑰2號葉片和塊莖中含量較高，顯著高于晉薯16號。

進一步利用qRT-PCR對3種不同顏色馬鈴薯的葉片及薯塊中StPDS和StZDS基因的表達量進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這2個基因均在紅心馬鈴薯紅玫瑰2號中表達量最高，顯著高于另外2個品種（P<0.05）；且在葉片中的表達量也遠遠高于塊莖。同一組織中，類胡蘿卜素含量和2個基因表達量的變化趨勢一致，均表現(xiàn)為紅玫瑰2號最高，希森8號次之，晉薯16號最低，說明StPDS和StZDS可能正向調(diào)控類胡蘿卜素的積累；而在同一品種中，如紅玫瑰2號，塊莖中類胡蘿卜素含量高于葉片，但是2個基因的表達量卻表現(xiàn)為葉片高于塊莖，這一現(xiàn)象說明StPDS和StZDS可能參與葉片的某些生理活動。

3 結(jié)論與討論

類胡蘿卜素是存在于許多花、果實、葉片中的天然色素。PDS和ZDS在植物體類胡蘿卜素合成通路上發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，有研究表明，這2種脫氫酶是類胡蘿卜素合成通路上的重要分支點[25-27]，其表達受到抑制時會影響植物體內(nèi)八氫番茄紅素的積累，進而影響花、葉片和果實中類胡蘿卜素含量，不僅會造成植物體種皮、果肉顏色的變化，而且還會影響植物營養(yǎng)物質(zhì)的含量，目前已從草莓[28]、番木瓜[22-23]、水仙[20]、穿心蓮[29]、甜瓜[30]等物種體內(nèi)分離得到PDS或ZDS基因。

本研究成功克隆到馬鈴薯的PDS和ZDS，其片段大小分別為1752、1767bp，分別編碼583、588個氨基酸。利用生物信息學軟件對StPDS和StZDS進行理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)二者均為無跨膜結(jié)構(gòu)域的親水性蛋白，表明二者均不是膜蛋白，這與其在植物體內(nèi)發(fā)揮的功能相適應(yīng)。在NCBI上搜索不同物種的PDS和ZDS序列并構(gòu)建發(fā)育進化樹，結(jié)果顯示，馬鈴薯StPDS和StZDS的氨基酸序列與番茄的PDS和ZDS親緣關(guān)系最近，表明馬鈴薯的PDS和ZDS可能與番茄SlPDS和SlZDS具有相似的功能和作用機制。利用String數(shù)據(jù)庫對馬鈴薯PDS進行互作蛋白預測分析，發(fā)現(xiàn)StPDS蛋白與StZDS、StLYCe等酶蛋白相互作用，這一結(jié)果與KATO等[27]的研究結(jié)果一致，LCYe可以調(diào)控紅色的番茄紅素轉(zhuǎn)變?yōu)槌壬摩?胡蘿卜素[21]，推測這些蛋白可能協(xié)同作用，共同正調(diào)控植物類胡蘿卜素的合成。

類胡蘿卜素可以吸收光作為碳同化的能源，有研究表明，PDS基因在被沉默后，植物葉片會發(fā)生白化，其光合作用受阻[16，31]。本研究對不同品種馬鈴薯的葉和塊莖內(nèi)StPDS和StZDS的基因表達量進行檢測，結(jié)果顯示，這2個基因均在葉片中的表達量最高，這與前人的研究結(jié)果相一致[17，28]。對馬鈴薯塊莖類胡蘿卜素含量測定發(fā)現(xiàn)，不同顏色薯塊中類胡蘿卜素的含量有所差異，其中紅心馬鈴薯紅玫瑰2號塊莖中類胡蘿卜素的含量最高，且紅玫瑰2號中2個基因的表達量均顯著高于其他2個品種，這與其塊莖中類胡蘿卜素含量的變化趨勢相一致。對果色差異較大的3個芒果品種進行基因表達分析后也得出類似的結(jié)果，芒果PDS和ZDS基因表達量在紅色芒果果皮中最高，在青色芒果果皮中最低[20]。

本研究通過克隆獲得StPDS和StZDS的cDNA全長序列，并進行生物信息學分析及表達差異分析，結(jié)果表明，在同一組織中，紅玫瑰2號類胡蘿卜素的含量及StPDS和StZDS基因的表達量顯著高于希森8號和晉薯16號，推測其可能正向調(diào)控馬鈴薯塊莖中類胡蘿卜素的積累，從而使薯塊的顏色呈現(xiàn)紅色；對不同品種的馬鈴薯類胡蘿卜素及2個基因的表達量分析發(fā)現(xiàn)，StPDS和StZDS基因在葉片中的表達量遠遠高于塊莖，這一結(jié)果與類胡蘿卜素含量所呈現(xiàn)的趨勢恰好相反。結(jié)合前人的研究，推斷StPDS和StZDS可能參與葉片的光合作用。這些結(jié)果為進一步研究PDS和ZDS在馬鈴薯生長發(fā)育過程調(diào)控機制奠定了一定的基礎(chǔ)，同時為改善馬鈴薯的外觀品質(zhì)提供了一定的參考依據(jù)。