李德周，奚瑛斐，辛鑫，李紅山，3

1. 寧波市第二醫(yī)院肝病科，浙江 寧波 315010

2. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院肝病研究所，上海 201203

3. 浙江省消化系統(tǒng)腫瘤診治及研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315010

非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）是世界上常見的慢性肝病，全球患病率約為25%，我國(guó)患病率約為6%～38%[1-2]。其疾病譜廣，包括單純脂肪變性、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）和肝硬化，后者可進(jìn)展為肝細(xì)胞癌。目前，NAFLD 的主要治療措施為生活方式干預(yù)，尚缺乏安全有效的藥物[3]。NAFLD 給社會(huì)帶來了嚴(yán)重的醫(yī)療和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，積極防治具有重要意義。絞股藍(lán)總苷為中藥草質(zhì)攀援植物絞股藍(lán)的主要成分，既往研究表明，絞股藍(lán)總苷可通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝治療NAFLD[4-5]，但其具體作用機(jī)制尚未完全闡明。為進(jìn)一步探討絞股藍(lán)總苷對(duì)NAFLD 脂代謝的調(diào)節(jié)機(jī)制，本研究擬采用高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠NAFLD 模型，以奧貝膽酸為對(duì)照，應(yīng)用液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS）技術(shù)，探討絞股藍(lán)總苷對(duì)NAFLD脂質(zhì)代謝的干預(yù)作用，研究結(jié)果將進(jìn)一步揭示絞股藍(lán)總苷治療NAFLD 的作用機(jī)制，為研制作用機(jī)制清晰、效應(yīng)物質(zhì)明確的抗NAFLD 中藥成分復(fù)方制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物飼養(yǎng)及分組給藥C57BL/6 雄性小鼠32 只，16～20 g，清潔級(jí)，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物批號(hào)：SCXK（滬）2017-0003。動(dòng)物飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度24～26 ℃，濕度50%～60%，明暗各12 h，飼喂正常飼料，自由進(jìn)食進(jìn)水。自造模之日起，32 只小鼠隨機(jī)分為正常組8 只，造模組24 只。正常組予正常對(duì)照飼料（10%脂肪，3.82 kcal/g）；造模組飼以高脂飼料（60%脂肪，5.21 kcal/g）喂養(yǎng)10 周。造模11 周將造模組小鼠隨機(jī)分為模型組、絞股藍(lán)總苷組、奧貝膽酸組，每組8 只。絞股藍(lán)總苷組及奧貝膽酸組分別采用絞股藍(lán)總苷［100 mg/（kg · d）］和奧貝膽酸［10 mg/（kg · d）］灌胃4 周，藥物劑量和方法參考文獻(xiàn)[5-6]，正常組和模型組給予等體積0.9%氯化鈉溶液灌胃4 周。

1.2 飼料與藥物高脂飼料（貨號(hào)D12492i）、正常對(duì)照飼料（貨號(hào)D12450B）均購(gòu)于美國(guó)Research Diets（New Brunswick）。絞股藍(lán)總苷（中國(guó)上海榮合藥業(yè)技術(shù)發(fā)展有限公司，批號(hào)171019）；奧貝膽酸（美國(guó)，BioVision，批號(hào)3J28B18980）。

1.3 試劑與儀器甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、葡萄糖測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；小鼠超敏胰島素酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒（美國(guó)，Crystal chem）。LC-MS（美國(guó)，賽默飛世爾科技，Q Exactive hybrid quadrupole-Orbitrap mass spectrometer）。

1.4 標(biāo)本留取第14 周，禁食12 h，不禁水，稱體質(zhì)量，以3%戊巴比妥鈉（3 mL/kg）腹腔注射麻醉，下腔動(dòng)脈取血5～10 mL，靜置30 min 后離心（3000 r/min，15 min，離心半徑13.5 cm），取上清液置于-80 ℃超低溫保存。分離小鼠肝臟，在同一肝葉的相同位置切取2 小塊組織，分別予10%福爾馬林緩沖液固定及冷凍。

1.5 肝臟病理學(xué)檢測(cè)根據(jù)已發(fā)表的標(biāo)準(zhǔn)方案，對(duì)4 μm 厚的切片進(jìn)行蘇木精-伊紅染色法（HE）染色[7]。NAFLD 活動(dòng)性標(biāo)準(zhǔn)（NAS）由有經(jīng)驗(yàn)的肝臟病理學(xué)家測(cè)定。NAS 據(jù)以下評(píng)分確定：脂肪變性（0 分為＜5%；1 為5%～33%；2 為34%～66%；3 為＞66%）；小葉內(nèi)炎癥（0 分為無病變；1 分為＜2 個(gè)病變/視野；2 分為2～4 個(gè)病變/視野；3 分為＞4 個(gè)病變/視野）；氣球變性（0 分為無；1 分為少見；2 分為多見）。

1.6 肝臟TG 含量測(cè)定取200 mg 濕肝，加入3 mL乙醇-丙酮（1∶1），勻漿（10000 r/min，20 s，2 次），靜置過夜后離心（3000 r/min，20 min，4 ℃，離心半徑13.5 cm），取上清液采用試劑盒檢測(cè)。

1.7 生化指標(biāo)測(cè)定血清TC、TG、AST、ALT、LDL-C、HDL-C、空腹血糖、空腹胰島素采用試劑盒測(cè)定，均按說明書進(jìn)行操作。胰島素抵抗指數(shù)=空腹血糖×空腹胰島素/22.5。

1.8 肝臟脂質(zhì)代謝物檢測(cè)取50 mg 冷凍肝臟樣本，加入800 μL 甲醇/水（1/1，v/v），勻漿；將勻漿液轉(zhuǎn)移到玻璃進(jìn)樣瓶中，加入800 μL 氯仿，漩渦震蕩30 s；冰水浴中超聲提取10 min；4 ℃靜置30 min后，離心（2000 r/min，15 min，離心半徑13.5 cm，4 ℃）；取下層液體（氯仿層），轉(zhuǎn)移至高回收率進(jìn)樣瓶，真空揮干；揮干后的脂質(zhì)殘?jiān)?00 μL 異丙醇/甲醇（1/1，v/v）復(fù)溶（渦旋震蕩30 s，超聲3 min），離心（12000 r/min，15 min，離心半徑16 cm，4 ℃），取200 μL 上清液用于LC-MS 分析。色譜條件：柱溫為45 ℃，流速為0.4 mL/min，進(jìn)樣量為5 μL。流動(dòng)相為：（A）乙腈-水（6∶4，v/v），含10 mmol/L 甲酸銨和0.1%甲酸；（B）乙腈-異丙醇溶液（1∶9，v/v），含10 mmol/L 甲酸銨和0.1%甲酸。線性梯度為：0～4 min，5%B；4～25 min，5%～95%B；25～35 min，95%B。質(zhì)譜條件，電噴霧電離（ESI）正離子模式：加熱器溫度300 ℃；護(hù)套氣體流量45 arb；輔氣流量15 arb；尾氣流量1 arb；噴霧電壓3.0 kV；毛細(xì)管溫度350 ℃；S-Lens 射頻電平50%；掃描范圍135～2000 m/z。ESI 負(fù)離子模式：加熱器溫度300 ℃，護(hù)套氣體流量45 arb；輔氣流量15 arb；尾氣流量1 arb；噴霧電壓2.5 kV；毛細(xì)管溫度350 ℃；S-Lens射頻電平60%；掃描范圍：135～2000 m/z。獲得的原始數(shù)據(jù)采用Progenesis QI 軟件（美國(guó)，沃特斯公司）進(jìn)行預(yù)處理。將標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 14.1 軟件（瑞典，Umetrics）進(jìn)行多元分析，包括主成分分析（PCA）、偏最小二乘判別分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）。根據(jù)OPLS-DA 的變量權(quán)重值（VIP）和P值（t檢驗(yàn)），確定各組之間的差異脂質(zhì)（VIP＞1 并且P＜0.05）。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。服從正態(tài)分布與方差齊性的2組比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。脂質(zhì)數(shù)據(jù)運(yùn)用SIMCA 14.1 軟件進(jìn)行多元分析，包括PCA、PLS-DA、OPLS-DA 分析，以VIP＞1 并且P＜0.05 確定各組的差異脂質(zhì)。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠HE 染色、NAS 積分、肝組織TG 含量改變見圖1。正常組小鼠肝細(xì)胞形態(tài)正常，未見脂肪變性；模型組小鼠肝細(xì)胞體積增大，呈彌漫性脂肪變性，伴炎細(xì)胞浸潤(rùn)和氣球樣變；絞股藍(lán)總苷組及奧貝膽酸組肝細(xì)胞上述表現(xiàn)減輕。此外，檢測(cè)了各組NAS 積分、肝組織TG 含量。與正常組比較，模型組NAS 積分、肝組織TG 含量均升高（P＜0.05）；與模型組比較，絞股藍(lán)總苷組與奧貝膽酸組NAS 積分、肝組織TG 含量均降低（P＜0.05）。

圖1 各組小鼠HE 染色、NAS 積分、肝組織TG 含量改變

2.2 各組小鼠生化指標(biāo)改變見圖2。與正常組比較，模型組血清ALT、AST、TC、TG、LDL-C、空腹血糖、空腹胰島素、胰島素抵抗指數(shù)均上升（P＜0.05）；與模型組比較，血清AST、ALT、TC、空腹血糖、空腹胰島素、胰島素抵抗指數(shù)在絞股藍(lán)總苷組與奧貝膽酸組均下降（P＜0.05）；血清TG 在絞股藍(lán)總苷組下降（P＜0.05），在奧貝膽酸組無明顯差異；血清LDL-C 在奧貝膽酸組下降（P＜0.05），在絞股藍(lán)總苷組無明顯差異。血清HDL-C 在各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 各組小鼠生化指標(biāo)改變

2.3 絞股藍(lán)總苷對(duì)NAFLD 小鼠肝臟脂質(zhì)代謝物的影響

2.3.1 多元統(tǒng)計(jì)分析一般認(rèn)為PCA 模型R2X＞0.5說明該模型效果較好，根據(jù)PCA 結(jié)果（見表1、圖3a～c），3 個(gè)PCA 模型R2X 均大于0.5，提示該模型解釋能力尚可。PCA 是一種無監(jiān)督的降維分析法，需進(jìn)行有監(jiān)督的PLS-DA、OPLS-DA 分析。R2 和Q2 越接近1，表明模型越穩(wěn)定可靠，Q2＞0.5 表明模型預(yù)測(cè)能力較好。根據(jù)PLS-DA 結(jié)果（見表1、圖3d～f），模型組VS 正常組及模型組VS 奧貝膽酸組PLS-DA 模型解釋能力及預(yù)測(cè)能力較好，模型組VS絞股藍(lán)總苷組PLS-DA 模型解釋能力及預(yù)測(cè)能力一般。根據(jù)OPLS-DA 結(jié)果（見表1、圖3 g～i），3 個(gè)OPLS-DA 模型解釋能力與預(yù)測(cè)能力均較好。置換檢驗(yàn)結(jié)果表明OPLS 模型未發(fā)生過度擬合，結(jié)果可靠（見圖4）。

圖3 各組PCA、PLS-DA、OPLS-DA 結(jié)果

圖4 各組置換檢驗(yàn)結(jié)果

2.3.2 肝臟脂質(zhì)代謝物變化見圖5。研究以O(shè)PLS-DA 模型的VIP＞1 聯(lián)合t檢驗(yàn)P＜0.05 篩選差異脂質(zhì)。模型組與正常組相比時(shí)，篩選出甘油酯類（GL）、甘油磷脂類（GP）、鞘脂類（SP）、脂肪酸類共67 種脂質(zhì)，包括1 種鞘氨醇（So）、2 種鞘磷脂（SM）、6 種磷脂酰絲氨酸（PS）、1 種磷脂酰肌醇（PI）、1 種磷脂酰乙醇（PEt）、5 種磷脂酰乙醇胺（PE）、26 種磷脂酰膽堿（PC）、5 種磷脂酸（PA）、4 種溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）、11 種溶血磷脂酰膽堿（LPC）、4 種單半乳糖二酰甘油（MGDG）和1 種脂肪酸（FA），其中39 種上調(diào)，28 種下調(diào)（見圖5a）。絞股藍(lán)總苷組與模型組對(duì)比時(shí)，篩選出GL、GP、SP、脂肪酸類共79 種脂質(zhì)，包括1 種So，2 種SM，4 種PS，1 種磷脂酰甲醇（PMe），2 種PG，6 種PEt，13 種PE，21 種PC，3 種PA，4 種LPE，8 種LPC，6 種甘油二酯（DG），1 種TG，1 種代異鼠李糖甘油二酯（SQDG），4 種MGDG，2 種FA，其中60 種上調(diào)，19 種下調(diào)（見圖5b）。奧貝膽酸組與模型組對(duì)比時(shí)，篩選出GL、GP、SP 類共55 種脂質(zhì)，1 種So，5 種PS，1 種PEt，7 種PE，21 種PC，3 種PA，3 種LPE，7 種LPC，3 種DG，4 種MGDG，其中22 種脂質(zhì)上調(diào)，33 種脂質(zhì)下調(diào)（見圖5c）。

圖5 各比對(duì)組熱圖

2.3.3 各組共同差異脂質(zhì)見表2。為了排除絞股藍(lán)總苷組與模型組同向變化以及缺乏比對(duì)的脂質(zhì)，本研究篩選了絞股藍(lán)總苷組與模型組對(duì)比時(shí)以及模型組與正常組對(duì)比時(shí)的共同差異脂質(zhì)。其中6 種脂質(zhì)同向變化，17 種脂質(zhì)反向變化。FA（18∶2）、LPC（16∶1）、MGDG（38∶5）、PA（24∶2/20∶4）、PC（36∶4，18∶1/18∶2）、PE（16∶0/18∶2）、PS（39∶2）水平在模型組中下降，在絞股藍(lán)總苷組中升高；LPC（18∶1，20∶3，20∶4）、LPE（22∶6）、PA（26∶4/20∶4）、PC（38∶5，38∶3，16∶0/20∶3）、SM（d18∶1/18∶3）水平在模型組中上升，在絞股藍(lán)總苷組中表達(dá)下降。同時(shí)，14 種脂質(zhì)在奧貝膽酸組與模型組對(duì)比時(shí)也發(fā)生顯著變化，其變化趨勢(shì)與絞股藍(lán)總苷組相同。

表2 各組共同差異脂質(zhì)

3 討論

NAFLD 是一種復(fù)雜的代謝性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，但肝臟脂質(zhì)代謝異常已被證實(shí)與NAFLD 發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[8]。脂質(zhì)組學(xué)是代謝組學(xué)的一個(gè)分支，被廣泛應(yīng)用于NAFLD 的藥效學(xué)評(píng)價(jià)以及作用機(jī)制的研究。本研究應(yīng)用LC-MS 技術(shù)進(jìn)行脂質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)NAFLD 小鼠經(jīng)絞股藍(lán)總苷干預(yù)后17 種脂質(zhì)發(fā)生逆轉(zhuǎn)，絞股藍(lán)總苷主要影響NAFLD 小鼠脂肪酸類、GP、SP、GL 的代謝。

脂肪酸與NAFLD 發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)、氧化、輸出過程中任意一條途徑受損均可引起或加重NAFLD[9]。同時(shí)，先前研究表明絞股藍(lán)總苷治療可提高NAFLD 小鼠肝組織小異二聚體伴侶（SHP）水平，下調(diào)靶基因固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白的表達(dá)，降低脂肪酸合成相關(guān)酶的水平，抑制肝脂合成。此外，絞股藍(lán)總苷還上調(diào)了肝組織中過氧化物酶體增殖物激活受體α 和肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶表達(dá)，增強(qiáng)脂肪酸氧化，促進(jìn)脂質(zhì)的分解[5]。本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)絞股藍(lán)總苷干預(yù)后，NAFLD 小鼠1 種FA 水平升高，這可能是絞股藍(lán)總苷減少FA（18∶2）的氧化或者增加其合成。

GP 是生物細(xì)胞膜的重要組成部分，在NAFLD的進(jìn)展中起著重要作用。PC 與PE 是哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜中最為豐富的磷脂[10]。在肝細(xì)胞中，高達(dá)30%的PC 由PE 經(jīng)磷脂酰乙醇胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶（PEMT）催化生成，同時(shí)PC 可通過PS 合成酶合成PS，PS 通過PS 脫羧酶合成PE[11]。在NAFLD 中，隨著疾病進(jìn)展，細(xì)胞內(nèi)脂肪積累，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，PE 水平下降[12]。本實(shí)驗(yàn)中，NAFLD 小鼠1 種PE 經(jīng)絞股藍(lán)總苷干預(yù)后水平升高。這可能由于絞股藍(lán)總苷減輕NAFLD 脂肪變性，改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，使PE 增加。此外，PC 是一種親水性脂質(zhì)，將TG（中性脂質(zhì)）包裝成極低密度脂蛋白膽固醇（VLDL）從肝臟輸出，PC 合成減少會(huì)影響VLDL 的合成與分泌，進(jìn)而導(dǎo)致肝內(nèi)脂質(zhì)堆積[13]。經(jīng)絞股藍(lán)總苷干預(yù)后，NAFLD 小鼠2 種PC、1 種PS 水平升高，3 種PC 水平降低。在肝臟內(nèi)，PC 與PE 的比例反映了PEMT 的活性。筆者猜測(cè)絞股藍(lán)總苷改善了PEMT 的功能，促進(jìn)PE 向PC轉(zhuǎn)換，PC 升高促進(jìn)PC 向PS 轉(zhuǎn)換，同時(shí)增加VLDL輸出，減輕肝內(nèi)TG 堆積。同時(shí)，筆者還發(fā)現(xiàn)2 種PA 經(jīng)絞股藍(lán)總苷干預(yù)后發(fā)生了顯著變化。先前研究顯示，PA 可通過調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物雷帕霉素復(fù)合體的靶點(diǎn)來損害胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[13]。此外，PA（di16∶0）可下調(diào)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[14]。這些發(fā)現(xiàn)表明，一些PA 可引起肝臟胰島素抵抗，并加重NAFLD。本實(shí)驗(yàn)中，絞股藍(lán)總苷可能通過調(diào)節(jié)PA，減輕胰島素抵抗，進(jìn)而減輕NAFLD。

SM 是SP 中含量最豐富的脂質(zhì)。與野生型對(duì)照相比，SGMS2 基因（SM 合成酶基因）缺乏的小鼠飼以高脂飲食后，降低了SM 水平和體質(zhì)量，并提高了胰島素敏感性[15]。許多參與SM 合成的酶可能是治療代謝紊亂潛在的治療靶點(diǎn)[14]。本實(shí)驗(yàn)中，絞股藍(lán)總苷逆轉(zhuǎn)了NAFLD 小鼠SM（d18∶1/18∶3）水平。絞股藍(lán)總苷可能通過影響相關(guān)酶的活性，降低了SM 水平，進(jìn)而改善NAFLD。

除GP、SP 外，GL 在NAFLD 的發(fā)展中也起著重要作用。甘油脂代謝中的甘油脂/游離脂肪酸循環(huán)在面對(duì)高脂血癥時(shí)通過脂解和β 氧化來分解脂類，從而防止肝臟脂肪變性。NAFLD 的特點(diǎn)是肝細(xì)胞中TG的過度沉積。臨床研究表明，NAFLD 患者的TG 水平顯著高于正常人，且升高水平與胰島素抵抗正相關(guān)[16]。盡管本研究4 組動(dòng)物的TG 種類差異不大，但模型組肝臟TG 含量顯著升高，絞股藍(lán)總苷組與奧貝膽酸組顯著降低。在本研究中，絞股藍(lán)總苷干預(yù)后NAFLD小鼠MGDG（38∶5）顯著升高。然而，不同種類的MGDG 如何影響脂代謝或涉及的作用機(jī)制知之甚少。本實(shí)驗(yàn)中絞股藍(lán)總苷對(duì)NAFLD 小鼠相關(guān)脂質(zhì)調(diào)節(jié)作用的機(jī)制也不清楚，需今后開展相關(guān)研究進(jìn)一步論證。

奧貝膽酸是法尼醇X 受體（FXR）激動(dòng)劑，越來越多的證據(jù)提示NAFLD 的發(fā)生與FXR 功能異常密切相關(guān)，F(xiàn)XR 為NAFLD 的重要治療靶點(diǎn)[17]，有研究發(fā)現(xiàn)，奧貝膽酸能明顯改善NAFLD 患者的病理學(xué)特征，顯示出治療NAFLD 的潛在價(jià)值[18]。本研究結(jié)果顯示，絞股藍(lán)總苷和奧貝膽酸均能有效改善NAFLD小鼠的肝組織病理變化，降低肝臟TG 含量和血清ALT、AST 活性，能有效改善NAFLD。絞股藍(lán)總苷治療NAFLD 的效果與奧貝膽酸相當(dāng)，提示絞股藍(lán)總苷是一個(gè)有效治療NAFLD 的候選藥物，值得今后進(jìn)一步深入研究。