李剛，胡立新，徐昕，熊敏

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是以關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥為主要特征的常見全身性免疫疾病[1]，臨床表現(xiàn)為滑膜細胞腫瘤樣增生、血管異常過多、炎癥細胞刺激關(guān)節(jié)軟骨與周圍組織[2]，具有持續(xù)病變、易反復(fù)發(fā)作、致殘率高的特點，是臨床上難治疾病之一[3-4]。miR-146a 在維持正常細胞免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，miR-146a 缺失會造成細胞免疫失衡，致使炎癥細胞過多釋放，損傷關(guān)節(jié)組織。研究表明，通過miR-146a 抑制TRAF6 表達，從而阻斷關(guān)節(jié)損傷并減少炎癥細胞釋放，抑制破骨細胞的生成和骨吸收活性，以減少關(guān)節(jié)破壞[5]。有研究表明，RhoA/ROCK 通路能夠改變軟骨細胞，從而影響軟骨細胞的形態(tài)及功能[6]。本文探究基于RhoA/ROCK 通路的miR-146a 過表達對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠的干預(yù)效果。

1 材料與方法

1.1 研究對象及實驗材料

選取40只SD 健康雄性大鼠，由吉林大學(xué)動物實驗中心提供，年齡8～11 個月，平均（9.5±1.2）個月，體重218～245 g，平均（231.5±11.1）g。大鼠在相對濕度30%～36%、溫度（23.5±1.3）℃的環(huán)境中喂養(yǎng)1 周，每日光照12 h。本研究已通過湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院倫理委員會批準［（2022）倫審第（10）號］。

兔抗大鼠白細胞介素-8（interleukin 8, IL-8）、白細胞介素-17（interleukin 17, IL-17）抗體（Sigma 公司）；兔抗小鼠hs-CRP 抗體（Dako 公司）；小鼠抗大鼠GSH-Px 抗體（Invitrogen 公司）；RhoA、ROCK1、ROCK2 抗體（Abcam 公司）；兔抗腺苷酸活化蛋白激酶（adenylate activated protein kinase, AMPK）、磷酸化AMPK（phosphorylated AMPK, p-AMPK） 抗 體（Millipore 公司）；兔抗大鼠克隆叉頭蛋白O3a（FoxO3a）、磷酸化FoxO3a（phosphorylated FoxO3a,p-FoxO3a）抗體（Cell Signaling公司）。

1.2 方法

1.2.1 建模及分組

隨機選取10 只納入正常組，不做任何處理。余下30只大鼠建立類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型：參照陳璐璐等[7]研究中建模方法，并適當(dāng)改動，使用Ⅱ型膠原蛋白進行造模。0.1 mol/L 冰醋酸將Ⅱ型膠原溶解之后，配制成質(zhì)量濃度2 g/L 的溶液，4 ℃冰箱中放置12 h，之后加等體積弗氏完全佐劑，將二者進行冰浴混合、乳化，制成乳劑，使每1 mL 乳劑包含1 mgⅡ型膠原。將1 mL 乳劑在大鼠的右后足趾部位、尾根部位及背部皮內(nèi)進行多點注射。1 周過后加強免疫1 次，注射0.5 mL，建立膠原誘導(dǎo)后大鼠實驗性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎動物模型。造模后2 周，將造模成功的大鼠分為3 組，其中沉默miR-146a組尾部靜脈注射30 mg/kg 有抑制劑轉(zhuǎn)染miR-146a，過表達miR-146a 組尾部靜脈注射30 mg/kg 無抑制劑轉(zhuǎn)染miR-146a。正常組、模型組大鼠尾部靜脈注射等量生理鹽水。各組大鼠實驗室常規(guī)飲食飲水，密切關(guān)注，定期清洗、消毒。實驗過程中對動物的處置嚴格遵守國家科技部所規(guī)定的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)意見》。

1.2.2 關(guān)節(jié)炎指數(shù)（arthritis index, AI）評分

分別在研究3周、6周、9周、12周對各組大鼠進行AI評分[8]。評分標準：無關(guān)節(jié)炎為0分；出現(xiàn)輕度發(fā)紅或者腫脹癥狀為1分；關(guān)節(jié)出現(xiàn)中度腫脹為2分；關(guān)節(jié)嚴重及全部腫脹為3 分；足爪出現(xiàn)嚴重變形為4 分。每只大鼠4只足爪的評分相加作為最后的AI評分。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測RhoA、ROCK1、ROCK2 及AMPK、FoxO3a蛋白表達

取關(guān)節(jié)軟骨組織，放入預(yù)冷后的細胞裂解液，采用超聲細胞破碎儀進行破碎，離心處理，取出上清液、蛋白定量后，十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate, SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳，之后結(jié)合一抗、稀釋，孵育1 d，取出后使用TBST 液沖洗，辣根過氧化酶所標記的鼠抗兔為二抗，β-actin 為內(nèi)參，60 min后清洗、顯色，檢測RhoA、ROCK1、ROCK2 及AMPK、FoxO3a蛋白表達情況。

1.2.4 酶聯(lián)免疫法檢測IL-8、IL-17、hs-CRP水平

抽取每只大鼠外周血3 mL，50 mmol/L 的碳酸鹽包被緩沖液溶解，使抗原濃度達到10～20 μg/mL，每孔加入100 μL 至96 孔酶標板，加蓋處理后在4 ℃冰箱內(nèi)存放24 h，第2 日進行3 次洗滌，然后拋干，將稀釋液（pH 為7.4，0.02 mol/L Tris-HCl 緩沖液）稀釋的0.1 mL 待測標本放入每個孔中，同時放入陽性和陰性對照標本，存放在42 ℃環(huán)境中60 min，移除液體后進行3 次洗滌并拋干，在每個孔中放入IL-8、IL-17、hs-CRP抗體0.1 mL，存放60 min，移除液體后進行3次洗滌并拋干，在每個孔中放入底物液（0.1 mol/L Na2HPO4，0.05 mol/L 的枸櫞酸），混勻后放入0.1 mL鄰苯二胺，進行20 min 遮光，再次在每個孔內(nèi)加入2 mol/L H2SO40.05 mL，終止反應(yīng)。最后使用酶標儀檢測IL-8、IL-17、hs-CRP水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，多組間比較行單因素方差分析，組間比較行LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理組織學(xué)觀察

正常組大鼠組織結(jié)構(gòu)相對完整，關(guān)節(jié)軟骨表面較為光滑，關(guān)節(jié)腔清晰可見，無炎性細胞浸潤及纖維組織增生現(xiàn)象；模型組大鼠滑膜組織細胞排列不規(guī)則，出現(xiàn)大量炎性細胞浸潤以及滑膜間質(zhì)纖維化現(xiàn)象；沉默miR-146a 組大鼠滑膜組織細胞排列參差不齊，存在大量炎性細胞浸潤；過表達miR-146a組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織受損情況以及炎性細胞浸潤情況明顯改善（圖1）。

圖1 各組大鼠關(guān)節(jié)病理組織學(xué)HE染色觀察圖（×200）

2.2 AI評分比較

模型組、沉默miR-146a 組大鼠AI 評分高于正常組，且沉默miR-146a組高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。過表達miR-146a 組大鼠AI 評分高于正常組，但低于模型組和沉默miR-146a組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分比較（±s，n=10，分）

表1 各組關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分比較（±s，n=10，分）

注：①P＜0.05，與正常組相比；②P＜0.05，與模型組相比；③P＜0.05，與沉默miR-146a組相比。

組別正常組模型組沉默miR-146a組過表達miR-146a組3周0 5.26±0.18①6.45±0.22①②6周0 6.85±0.41①7.38±0.61①②9周0 11.05±0.72①11.62±0.93①②12周0 13.72±1.05①14.17±1.12①②2.11±0.09①②③1.72±0.05①②③1.24±0.03①②③0.56±0.02①②③

2.3 RhoA/ROCK表達水平比較

模型組、沉默miR-146a 組大鼠RhoA、ROCK1 及ROCK2 表達水平高于正常組，且沉默miR-146a 組高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。過表達miR-146a 組大鼠RhoA、ROCK1 及ROCK2 表達水平高于正常組，但低于模型組和沉默miR-146a組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2和圖2。

表2 RhoA/ROCK表達水平比較（±s，n=10）

表2 RhoA/ROCK表達水平比較（±s，n=10）

注：①P＜0.05，與正常組相比；②P＜0.05，與模型組相比；③P＜0.05，與沉默miR-146a組相比。

ROCK2 0.61±0.11 1.24±0.14①1.35±0.11①②0.76±0.07①②③組別正常組模型組沉默miR-146a組過表達miR-146a組RhoA 0.98±0.07 2.43±0.13①2.57±0.15①②1.23±0.12①②③ROCK1 0.76±0.09 1.61±0.07①1.85±0.12①②0.93±0.10①②③

圖2 RhoA、ROCK1及ROCK2表達圖

2.4 IL-8、IL-17、hs-CRP水平比較

模型組、沉默miR-146a組大鼠IL-8、IL-17、hs-CRP水平高于正常組，且沉默miR-146a組大鼠高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。過表達miR-146a組大鼠IL-8、IL-17、hs-CRP水平均低于模型組、沉默miR-146a組，但高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠IL-8、IL-17、hs-CRP水平比較（±s，n=10）

表3 各組大鼠IL-8、IL-17、hs-CRP水平比較（±s，n=10）

注：①P＜0.05，與正常組相比；②P＜0.05，與模型組相比；③P＜0.05，與沉默miR-146a組相比。

組別正常組模型組沉默miR-146a組過表達miR-146a組IL-8（pg/mL）23.85±3.14 45.91±3.72①55.38±4.25①②IL-17（ng/L）7.62±1.24 25.13±2.92①40.14±3.57①②hs-CRP（ng/mL）3.75±0.86 14.75±1.61①21.29±2.63①②7.03±1.05①②③31.19±3.16①②③12.27±1.72①②③

2.5 AMPK、FoxO3a蛋白表達情況

模型組、沉默miR-146a組大鼠AMPK、p-AMPK、FoxO3a、p-FoxO3a表達低于正常組，且沉默miR-146a組大鼠均低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；過表達miR-146a 組大鼠AMPK、p-AMPK、FoxO3a、p-FoxO3a表達均低于模型組、沉默miR-146a組，但高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表4、圖3。

表4 各組大鼠AMPK、FoxO3a蛋白表達情況（±s，n=10）

表4 各組大鼠AMPK、FoxO3a蛋白表達情況（±s，n=10）

注：①P＜0.05，與正常組相比；②P＜0.05，與模型組相比；③P＜0.05，與沉默miR-146a組相比。

組別正常組模型組沉默miR-146a組過表達miR-146a組AMPK 1.19±0.07 0.63±0.05①0.47±0.04①②p-AMPK 0.98±0.06 0.52±0.03①0.46±0.04①②FoxO3a 1.12±0.03 0.54±0.04①0.65±0.05①②p-FoxO3a 0.92±0.05 0.41±0.03①0.56±0.02①②0.72±0.04①②③0.78±0.06①②③0.72±0.05①②③0.81±0.04①②③

圖3 AMPK、FoxO3a蛋白表達圖

3 討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種病因未明確的全身性疾病。研究表明，關(guān)節(jié)滑膜炎性病變和骨質(zhì)的損傷嚴重影響類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展[9-10]。RhoA/ROCK通路在臨床上被稱為肌動蛋白細胞骨架調(diào)節(jié)器，同時也是細胞形態(tài)異質(zhì)性的調(diào)節(jié)器[11]。有研究顯示，RhoA/ROCK 通路能夠調(diào)節(jié)細胞膜整合素表達，控制外界信號信號向細胞內(nèi)傳導(dǎo)[12]。由于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎機制復(fù)雜，目前在我國尚無特效治療方法[13]。miR-146a 作為最先發(fā)現(xiàn)的具有免疫調(diào)節(jié)作用的miRNA，主要位于5 號染色體上，是基因表達的重要調(diào)節(jié)劑，能夠在轉(zhuǎn)錄之后水平上對靶mRNA 進行干預(yù)調(diào)控。研究顯示，miR-146a 在炎癥反應(yīng)中具有重要作用，能夠調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的嚴重程度，同時在適應(yīng)性免疫疾病中發(fā)揮重要作用，是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的負性調(diào)控分子[14-15]。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎為慢性進展性疾病，在疾病的發(fā)展過程中，受累關(guān)節(jié)的病理變化及關(guān)節(jié)微環(huán)境也在不同變化，關(guān)節(jié)成纖維樣滑膜細胞增殖及凋亡特性有可能出現(xiàn)相應(yīng)改變[16]。AI 評分能夠反映類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病理基本變化，是觀察大鼠關(guān)節(jié)炎變化的重要評分。本研究顯示，相比正常組，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠AI 評分升高，說明AI 評分與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠病情的發(fā)生與發(fā)展存在關(guān)聯(lián)?；赗hoA/ROCK 通路miR-146a 過表達的大鼠AI 評分明顯降低，說明基于RhoA/ROCK 通路miR-146a 過表達能夠有效控制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠病情進展。

RhoA蛋白作為小G蛋白超家族的亞家族的主要成員，也是谷丙轉(zhuǎn)氨酶之一，能夠影響細胞有絲分裂及細胞骨架調(diào)節(jié)等多種生物的生理過程[17]。ROCK分成ROCK1 與ROCK2 兩個亞型，是目前研究較為清晰的效應(yīng)分子[18]。通過研究RhoA/ROCK 通路有助于觀察軟骨細胞的生長發(fā)育與退行性病變。本研究結(jié)果顯示，相比正常大鼠，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠RhoA、ROCK1及ROCK2表達水平明顯升高，說明在大鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)展中RhoA、ROCK1 及ROCK2參與病變過程，基于RhoA/ROCK通路miR-146a過表達的大鼠，RhoA、ROCK1及ROCK2表達水平出現(xiàn)下降，說明基于RhoA/ROCK通路miR-146a過表達能夠抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎出現(xiàn)病變。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的滑膜組織中有大量炎癥細胞浸潤，例如T 淋巴細胞、B 淋巴細胞、巨噬細胞等[19]。有研究顯示，IL-8、IL-17、hs-CRP 等炎性因子嚴重影響類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展，不僅能夠直接影響關(guān)節(jié)炎癥性改變，還能夠刺激多種信號，造成滑膜炎癥反應(yīng)，從而引發(fā)關(guān)節(jié)損傷[20]。本研究結(jié)果顯示，相比正常大鼠，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠IL-8、IL-17、hs-CRP 水平相對較高，說明炎癥反應(yīng)刺激著類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生，提高了關(guān)節(jié)損傷程度?；赗hoA/ROCK 通路miR-146a 過表達的大鼠，IL-8、IL-17、hs-CRP 水平較明顯下降，說明基于RhoA/ROCK通路miR-146a過表達能夠抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展，降低關(guān)節(jié)損傷程度及炎癥反應(yīng)。

AMPK 作為一種具有多種代謝途徑的中樞調(diào)節(jié)劑，在真核細胞中廣泛存在，是調(diào)節(jié)能量的一種關(guān)鍵因子[21]。FoxO3a 在維持活性氧穩(wěn)態(tài)方面具有重要作用，AMPK 激活后,可以磷酸化多條信號通路的關(guān)鍵蛋白，包括FoxO3a，與其協(xié)同作用能夠增強動物抗應(yīng)激能力及抗氧化能力[22]。本研究結(jié)果顯示，相比正常大鼠，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠AMPK、p-AMPK、FoxO3a、p-FoxO3a 表達水平相對較低，說明類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎影響著AMPK、FoxO3a蛋白表達情況，基于RhoA/ROCK通路miR-146a 過表達的大鼠，AMPK、p-AMPK、FoxO3a、p-FoxO3a表達水平出現(xiàn)上升，說明RhoA/ROCK通路miR-146a過表達能夠提升修復(fù)關(guān)節(jié)損傷作用及抗氧化能力。

4 結(jié)論

基于RhoA/ROCK 通路的miR-146a 過表達對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠進行干預(yù)，能夠控制病變，抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展，降低炎癥反應(yīng)程度及關(guān)節(jié)損傷情況，提升關(guān)節(jié)損傷修復(fù)作用及抗氧化能力，為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)損傷的治療提供新的靶點和參考依據(jù)。

【利益沖突】所有作者均聲明不存在利益沖突