任家玄 李艷梅 馬維峰 吳宙 毛娟

摘要：【目的】通過鑒定和分析蘋果14-3-3 基因家族，并在蘋果愈傷組織中過表達MdGRF13，研究逆境脅迫下其對蘋果愈傷組織生長的影響，為探究該家族基因功能提供理論參考?！痉椒ā坷蒙镄畔W方法對蘋果14-3-3 基因家族進行鑒定和表達分析，構建MdGRF13 過表達載體并轉(zhuǎn)化蘋果愈傷組織?！窘Y果】共鑒定出36 個蘋果14-3-3 基因家族成員。系統(tǒng)進化分析將該家族成員分為ε 類和非ε 類，每個亞族基因結構相似，且高度保守。共線性分析發(fā)現(xiàn)片段重復是該基因家族擴張的主要原因?；蚪M織特異性表達分析顯示，蘋果14-3-3 家族基因在莖中多數(shù)上調(diào)表達。亞細胞定位表明MdGRF13 蛋白定位在細胞核、細胞質(zhì)和細胞膜上。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，在PEG和NaCl 處理下分別有14 和13 個基因在不同時間點上調(diào)表達。過表達型（OE）愈傷組織在PEG和NaCl處理下長勢優(yōu)于野生型（WT）?！窘Y論】鑒定出36 個蘋果14-3-3 基因家族成員，且各亞族成員結構高度保守。過表達MdGRF13 增強了蘋果愈傷組織的抗旱性和耐鹽性。

關鍵詞：蘋果；14-3-3 基因家族；表達分析；亞細胞定位；愈傷組織

中圖分類號：S661.1 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）03-0405-17

植物在生長發(fā)育過程中會受到高鹽、干旱、低溫和重金屬離子毒害等環(huán)境變化引起的非生物脅迫，造成植物生長緩慢或死亡[1-2]。為了適應這些非生物脅迫，植物自身進化出多種保護系統(tǒng)來抵御逆境脅迫所造成的損傷[3]。14-3-3 作為應激誘導蛋白通過參與真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控和信號轉(zhuǎn)導來增強植物對逆境的耐受性，它通過激素信號途徑和離子通道來調(diào)控多種靶標的活性，在非生物脅迫中起關鍵作用[4-6]。14-3-3 蛋白也具有調(diào)節(jié)植物生長和發(fā)育的功能，其與鈣調(diào)蛋白激酶CDPK（calcium- dependentprotein kinase）共同作用調(diào)控植物新陳代謝、激素合成和開花等多種生物學途徑[7-8]。

目前14-3-3 蛋白已在甜瓜（Cucumis melo）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、番茄（Solanum lycopersicum）、大豆（Glycine max）、苜蓿（Medicago truncatula）、楊樹（Populus trichocarpa）、水稻（Oryza sativa）、花生（Arachis hypogaea）、棉花（Gossypium hirsutum）和杧果（Mangifera indica）中完成了鑒定[9-17]。研究發(fā)現(xiàn)，根據(jù)系統(tǒng)進化和內(nèi)含子數(shù)量，14-3-3 基因家族劃分為ε 類和非ε 類，非ε 類含有4 個外顯子和3 個內(nèi)含子，而ε 類一般包含6～7 個外顯子和4～6 個內(nèi)含子[8，16-17]。14-3-3 基因在小麥、葡萄和香蕉生殖器官中高表達來調(diào)節(jié)植物淀粉合成、果實發(fā)育和漿果成熟等過程[18-20]。研究發(fā)現(xiàn)，4 個Md14-3-3 蛋白與花整合因子MdTFL1 和MdFT相互作用參與植物開花調(diào)控[21]，而過表達毛竹PvGF14b、PvGF14c 和PvGF14e 能夠延緩擬南芥的開花時間[22]。在番茄根系中，14-3-3 蛋白通過調(diào)控脫落酸（abscisic acid，ABA）信號通路來維持植物細胞滲透平衡和氣孔開度，進而響應干旱或鹽堿逆境脅迫[9]。前人研究發(fā)現(xiàn)，小麥TaGF14b 在煙草中過表達增強了植物對非生物脅迫的耐受性[23]。此外，Xia 等[15]通過qPCR 發(fā)現(xiàn)杧果植株在干旱處理12 h 后Mi14-3-3-A1 的表達呈現(xiàn)下降趨勢。水稻OsCPK21 與OsGF14e 磷酸化作用來調(diào)控ABA信號轉(zhuǎn)導和耐鹽性，而擬南芥14-3-3 蛋白質(zhì)充當鹽過度敏感（SOS）信號通路分子開關，響應鹽脅迫[24- 25]。棉花葉片中的5 個基因（Gh-GRF3、GhGRF4、GhGRF5、GhGRF7 和GhGRF16）在鹽脅迫下下調(diào)表達[26]。同時，過表達MdGRF11 可提高轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷組織和擬南芥對干旱和鹽脅迫的耐受性[27]。以上研究表明14-3-3 家族蛋白在植物生長、發(fā)育和脅迫反應中具有重要作用。

蘋果（Malus×domestica Borkh.）是中國廣泛種植的經(jīng)濟水果之一，而干旱和鹽堿等非生物脅迫仍是限制我國蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素。筆者在本研究中利用擬南芥和水稻蛋白序列在蘋果基因組中進行同源比對，鑒定出36 個蘋果14-3-3 基因家族成員，對其理化性質(zhì)、系統(tǒng)進化關系及保守基序進行分析，并探究該家族基因在植物組織和逆境脅迫下的表達情況，以及分析過表達MdGRF13 愈傷組織在PEG和NaCl 脅迫下的影響，為該家族基因響應逆境功能研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與處理

試驗于2021 年在甘肅農(nóng)業(yè)大學園藝學院果樹生理與生物技術實驗室進行。選擇繼代培養(yǎng)30 d生長良好且一致的蘋果品種嘎拉實生苗外植體擴繁的試管苗，轉(zhuǎn)接到含有15% PEG、100 μmol · L- 1ABA和200 mmol·L-1 NaCl [28]的MS液體培養(yǎng)基（降低濃度誤差）進行處理，以等體積MS 培養(yǎng)基處理為對照，對照與各處理同步時長均為2、12 和24 h，pH 值為5.8～6.0，采用紙橋法進行固定。每組處理設置3 個生物學重復，每個重復5 株試管苗。使用qRT-PCR 對10 年生嘎拉實生苗（甘肅農(nóng)業(yè)大學日光溫室）進行組織特異性數(shù)據(jù)分析。另外，使用本實驗保存的蘋果王林愈傷組織進行MdGRF13 的過表達分析。

1.2 蘋果14-3-3 家族基因的鑒定

用擬南芥（https：//www.arabidopsis.org/）和水稻（http：//rice.plantbiology.msu.edu/index.sh-tml）14-3-3家族的蛋白序列在蘋果數(shù)據(jù)庫GDR（https：//www.rosaceae.org/）中利用Blast 工具進行比對，然后用SMART（http：//smart.emblheidelberg.de/） 和Pfam（http：//pfam.sanger.ac.uk/search）在線網(wǎng)站進行保守結構域的檢索，去除不含保守結構域的蘋果序列，根據(jù)蘋果14-3-3 家族基因在染色上的位置進行命名。

1.3 蘋果14-3-3 家族蛋白理化性質(zhì)及二級結構分析

對蘋果14-3-3 家族蛋白的理論等電點（pI）、分子質(zhì)量和不穩(wěn)定性指數(shù)等基本信息使用ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam/）工具進行分析。

根據(jù)二級結構在線工具SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi- bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）對蘋果14-3-3 家族蛋白進行α 螺旋、β 轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無規(guī)則卷曲比例的預測。

1.4 蘋果14-3-3 家族蛋白系統(tǒng)進化分析

下載大豆、番茄和二穗短炳草（NCBI）14-3-3 家族蛋白序列，與擬南芥、水稻以及蘋果蛋白序列用MEGA 7.0 軟件比對并構建系統(tǒng)進化樹，校驗參數(shù)默認值為1000。

1.5 蘋果14-3-3 家族蛋白結構和保守基序分析

采用GSDS（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）對蘋果14-3-3 家族基因成員進行基因結構分析；利用在線網(wǎng)站MEME（http：//meme-suite.org/）對其蛋白保守基序預測。

1.6 蘋果14-3-3 家族基因共線性和蛋白互作網(wǎng)絡分析

利用軟件TBtools 1.6 對蘋果14-3-3 家族基因進行共線性分析，繪制關系圖。通過Phytozome v12.1：Home （https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）下載擬南芥和水稻的CDS序列及基因注釋文件，在GDR（https：//www.rosaceae.org/）中下載蘋果的基因組數(shù)據(jù)，使用TBtools 1.6 軟件繪制蘋果、水稻和擬南芥之間的關聯(lián)性圖。對36 個蘋果14-3-3 家族蛋白通過String 蛋白互作數(shù)據(jù)庫（http：//string-db.org/）進行蛋白互作網(wǎng)絡分析和參數(shù)默認。

1.7 實時熒光定量qRT-PCR分析

36 個蘋果14-3-3 家族基因qRT-PCR 引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司在線設計，提取RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Prime Script RT reagentKit，Perfect Real Time，TaKaRa）合成cDNA；用實時熒光定量PCR 儀（LightCycler? 96 Real- TimePCR System，Roche，瑞士）和試劑盒（SYBR GreenⅠ，TaKaRa）進行該家族基因在不同組織、PEG、ABA及NaCl 處理下表達量的分析。反應體系為20 μL，分別加入6 μL ddH2O、2 μL cDNA、上下游引物各1 μL和10 μL SYBR。用SPSS 22.0 和Excel 2010 進行數(shù)據(jù)處理及作圖。

1.8 MdGRF13 基因的克隆及亞細胞定位分析

RNA 來自嘎拉蘋果試管苗葉片。蘋果MdGRF13 基因克隆引物為F：5- GAGCTCGGTACCCGGGGATCCATGGCGGCAACCACCCCC-3，R：5-GGTGTCGACTCTAGAGGATCCGGTCTCGATCTTGGATTGGTAGTC-3。按照反應程序95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火42 s，72 ℃延伸1 min，40 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min 進行PCR擴增，使用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測并回收目標條帶。連接pCAMBIA1300 載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α（天根生物科技有限公司），進行菌液PCR鑒定后，送生工生物工程（西安）股份有限公司測序。

將pCAMBIA1300-MdGRF13-GFP 表達載體質(zhì)粒和pCAMBIA1300-GFP 空載體質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101（北京博邁徳基因技術有限公司）。參照劉勇等[29]農(nóng)桿菌介導煙草葉片的侵染方法，將重懸菌液注射到本氏煙草葉片背面，培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d后，采用激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.9 MdGRF13 愈傷組織轉(zhuǎn)化、表型觀察及生理指標測定

愈傷組織侵染參照張婷婷等[30]的方法。選取生長狀態(tài)良好的蘋果王林愈傷組織進行農(nóng)桿菌侵染，并在誘導培養(yǎng)基（含有潮霉素50 mg·L-1和頭孢霉素300 mg · L-1）上篩選。使用超光速mix（MF848）試劑盒（北京聚合美生物科技有限公司）鑒定轉(zhuǎn)基因愈傷組織，鑒定所用抗性基因Hyg 引物為，F(xiàn)：5-ATGAAAAAGCCTGAACTCACCG-3，R：5-CTATTTCTTTGCCCTCGGACGA-3；繼代培養(yǎng)。

取野生型和MdGRF13 過表達系OE-4、OE-2 及OE-3 愈傷組織0.05 g，放在分別含有2% PEG、4%PEG、0.06 mol · L-1 NaCl 和0.08 mol · L-1 NaCl 的MS固體培養(yǎng)基[27，31]上處理15 d，拍照并進行鮮質(zhì)量統(tǒng)計。蘋果愈傷組織中丙二醛（MDA）含量及SOD、POD和CAT活性分別采用硫代巴比妥酸法[32]、氮藍四唑（NBT）法、愈創(chuàng)木酚法和紫外吸收法[33]測定。

2 結果與分析

2.1 蘋果14-3-3 家族基因成員的鑒定

從蘋果基因組中共鑒定得到36 個14-3-3 家族基因（表2）。蘋果14-3-3 家族基因相對分子質(zhì)量為11 221.52～113 854.16 Da；氨基酸長度介于98～1006 aa 之間；等電點（pI）為4.68～10.55；不穩(wěn)定系數(shù)MdGRF17 最小，為36.92，MdGRF8 最大，為98.48；大多數(shù)蘋果14-3-3家族蛋白的pI值小于7，其可能是酸性蛋白。對蘋果14-3-3家族36個基因編碼蛋白進行亞細胞定位預測，發(fā)現(xiàn)其主要在細胞質(zhì)中進行相關表達，其次是細胞核，其中MdGRF2、MdGRF7、MdGRF8、MdGRF12、MdGRF16、MdGRF28 和MdGRF31 完全定位在細胞核中，預測這7 個蛋白僅在細胞核中發(fā)揮相關作用。MdGRF4 和MdGRF11 在葉綠體中有一定量的表達，預測這2 個蛋白可能與植物光合作用相關。

2.2 蘋果14-3-3 家族蛋白二級結構分析

對蘋果36 個14-3-3 家族蛋白進行二級結構預測結果表明（圖1）。其蛋白二級結構以α 螺旋和無規(guī)則卷曲為主，分別占23.08%（MdGRF8）～78.57%（MdGRF13）、15.47%（MdGRF18）～64.10%（MdGRF8）。而β 轉(zhuǎn)角占0%（MdGRF13）～7.93%（MdGRF16），延伸鏈占2.04%（MdGRF13）～22.65%（MdGRF33），二者所占比例較小。

2.3 蘋果14-3-3 家族基因進化分析

將蘋果、擬南芥、水稻、大豆、二穗短柄草以及番茄的14-3-3 家族蛋白序列構建系統(tǒng)進化樹（圖2）。

結果表明，該基因家族可分為ε 類和非ε 類，又分為5個亞族。其中，Ⅰ亞族有6 個蘋果14-3-3 家族基因，Ⅱ亞族有10 個蘋果14-3-3 家族基因，Ⅲ亞族有3 個蘋果14-3-3 家族基因，Ⅳ亞族有10 個蘋果14-3-3 家族基因，Ⅴ亞族有7 個蘋果14-3-3 家族基因。蘋果跟擬南芥14-3-3 家族基因有較高的同源性，進化關系較近。

2.4 蘋果14-3-3 家族基因結構和motif分析

對36 個蘋果14-3-3 基因家族構建進化樹以及基因結構分析（圖3-A～B），該基因家族可分為ε 類和非ε 類。MdGRF11、MdGRF14、MdGRF23 和MdGRF27 僅有一個內(nèi)含子，MdGRF16 和MdGRF26有2 個內(nèi)含子，MdGRF7 和MdGRF24 有14 個內(nèi)含子。MdGRF24 和MdGRF33 明顯長于其他基因，序列長度超過8 kb。MdGRF2、MdGRF8、MdGRF13 和MdGRF28 屬于內(nèi)含子缺失類，整條序列均為外顯子，不同亞族序列外顯子分布位置和長度差異較大，推測不同亞族有較大功能差異。對蘋果14-3-3 家族成員的motif 分析顯示（圖3-C），共鑒定出10 個motif，且都含有motif 3。MdGRF8、MdGRF12 和MdGRF14 蛋白只有一個保守基序，分別為motif 3、motif 2 和motif 1。同一亞族成員結構相似，具有較高的保守性，其在蘋果生長中可能發(fā)揮相似的功能；不同亞族間的motif 存在差異，表明其可能具有不同的生物學功能。

2.5 蘋果14-3-3 家族基因的共線性和蛋白互作網(wǎng)絡分析

對36 個蘋果14-3-3 家族蛋白互作網(wǎng)絡分析表明（ 圖4-A）。15 個成員（MdGRF3、MdGRF4、MdGRF6 、MdGRF10 、MdGRF11 、MdGRF13 、MdGRF15 、MdGRF18 、MdGRF22 、MdGRF25 、MdGRF26 、MdGRF31 、MdGRF32 、MdGRF34 和MdGRF36）在網(wǎng)絡中與FT2、MdFT1 和XP—008366662.1 蛋白互作，推測蘋果14-3-3 家族蛋白與植物營養(yǎng)生長、生殖生長和開花調(diào)控相關。

染色體定位顯示，33 個蘋果14-3-3 家族基因分布在11 條蘋果染色體上，3 個蘋果14-3-3 家族基因分布在chrUr 染色體上，而染色體Chr 05 上分布最多，有5 個蘋果14-3-3 家族基因（圖4-B）。對蘋果的36 個14-3-3 家族基因進行共線性分析，結果如圖4-B 所示：10 對基因存在共線性，分別為MdGRF1/MdGRF34、MdGRF2/MdGRF32、MdGRF4/MdGRF20、MdGRF4/MdGRF29、MdGRF7/MdGRF18、MdGRF9/MdGRF21、MdGRF17/MdGRF30、MdGRF20/MdGRF29、MdGRF22/MdGRF35 和MdGRF24/MdGRF36，原因可能與大片段復制有關。存在MdGRF2/MdGRF3、MdGRF6/MdGRF7、MdGRF9/MdGRF10、MdGRF24/MdGRF25、MdGRF30/MdGRF31 和MdGRF32/MdGRF33 6 對串聯(lián)重復基因，片段重復在蘋果14-3-3 基因家族擴展中占主要作用，該家族基因具有較高的同源性。

為了探討不同物種14-3-3 家族基因的進化關系，分析了蘋果、單子葉植物水稻以及模式植物擬南芥之間的同源基因，結果表明（圖5），蘋果與擬南芥之間的關聯(lián)性較強，存在20 對共線性基因?qū)?，蘋果與水稻之間的關聯(lián)性相對較弱，存在3 對基因?qū)?。表明蘋果與擬南芥的14-3-3 家族基因親緣關系較近。

2.6 蘋果14-3-3 家族基因的組織特異性表達分析

對蘋果14-3-3 家族基因在根、莖和葉中的表達差異分析顯示（圖6），36 個基因在根、莖和葉中都有表達。4 個基因（MdGRF2、MdGRF17、MdGRF25 和MdGRF28）在根中有較高表達，16 和12 個基因分別在莖和葉中表達量較高。綜上所述，蘋果14-3-3 家族基因在不同組織中存在表達差異，且在莖中表達量高于葉和根。

2.7 蘋果14-3-3 家族基因?qū)Ψ巧锩{迫的表達分析

通過qRT-PCR 分析了36 個蘋果14-3-3 家族基因在PEG、ABA 和NaCl 處理下的相對表達量（圖7）。結果表明，ABA 處理2 h 后，MdGRF18 和MdGRF26 較對照顯著上調(diào)表達，MdGRF4 和MdGRF16 也有上調(diào)表達，MdGRF24 在ABA 處理24 h 后上調(diào)表達，其余基因均下調(diào)表達。MdGRF5、MdGRF14、MdGRF24 和MdGRF26 在PEG 處理2 h下與對照相比呈顯著上調(diào)表達，MdGRF2、MdGRF13和MdGRF26 在12 h 有較高表達，且MdGRF13 在24 h 表達量最高，為對照的1.8 倍，而其余基因表達量較低。NaCl處理下，MdGRF4、MdGRF5、MdGRF12、MdGRF14、MdGRF16、MdGRF19 和MdGRF24 在2 h較對照上調(diào)表達，MdGRF1、MdGRF9、MdGRF10、MdGRF13、MdGRF15 和MdGRF24 在12 h 顯著上調(diào)；MdGRF2 始終處于上調(diào)表達，且在2 h 表達量最高，為對照的18.6 倍，其可能在鹽脅迫中起正調(diào)控作用。MdGRF4、MdGRF5、MdGRF14 和MdGRF16 在NaCl 處理2 h 后表達量分別為對照的7.6、7.5、6.5 和15.6 倍，而MdGRF13 在NaCl 處理12 h 及24 h 后顯著上調(diào)表達，為對照的2.1 倍，推測蘋果14-3-3 家族基因可能響應鹽脅迫。

2.8 蘋果MdGRF13基因克隆和亞細胞定位分析

由qRT-PCR 分析（圖7）表明MdGRF13 基因在15% PEG 以及200 mmol·L-1 NaCl 處理12 h 和24 h后較對照顯著上調(diào)表達，說明其在抵御非生物脅迫的過程中發(fā)揮重要的作用。因此，選擇MdGRF13基因克隆并進行功能驗證。

以嘎拉蘋果cDNA為模板，進行PCR擴增，得到與預期目標一致的條帶（圖8-A），將擴增產(chǎn)物回收純化后連接大腸桿菌DH5α 并通過PCR 陽性檢測，所得結果與原序列（297 bp）相吻合（圖8-B）。最后轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，PCR檢測條帶合適（圖8-C）。

以pCAMBIA1300-GFP 空載體為陽性對照，將MdGRF13 重組質(zhì)粒在煙草葉片中瞬時表達。結果表明（圖9），pCAMBIA1300-MdGRF13-GFP 表達載體的熒光定位在細胞核、細胞質(zhì)和細胞膜上。

2.9 MdGRF13 過表達在蘋果愈傷組織的功能鑒定

將過表達載體pCAMBIA1300-MdGRF13-GFP轉(zhuǎn)化王林蘋果愈傷組織（圖10-A）。對所得轉(zhuǎn)基因愈傷組織通過PCR檢測，獲得了與陽性對照片段大小一致的條帶（圖10-B），證明MdGRF13 在蘋果愈傷組織中轉(zhuǎn)化成功。選取過表達型OE-4、OE-2 和OE-3 進行處理。

對野生型與過表達型愈傷組織經(jīng)不同濃度PEG處理下表型觀察發(fā)現(xiàn)（圖10-C），過表達型（OE）愈傷組織長勢優(yōu)于野生型（WT），且差異顯著，而2%PEG 處理下愈傷組織整體長勢優(yōu)于4% PEG。

0.06 mol·L-1 NaCl 處理下，過表達型（OE）愈傷組織長勢優(yōu)于野生型（WT），而在0.08 mol·L-1 NaCl 處理下，過表達型（OE）愈傷組織長勢與野生型（WT）無顯著差異。

對WT和OE 愈傷組織進行鮮質(zhì)量統(tǒng)計，并對MDA（丙二醛）含量以及CAT、POD 和SOD 酶活性進行測定。結果表明（圖10-D），0.08 mol·L-1 NaCl處理下，OE愈傷組織鮮質(zhì)量、MDA含量以及CAT、POD和SOD酶活性較WT無顯著差異，而其他處理下，OE愈傷組織鮮質(zhì)量以及CAT、POD和SOD酶活性高于WT，而OE 的MDA含量低于WT。表明過表達MdGRF13 能夠增強蘋果愈傷組織對干旱和鹽脅迫的抗性。

3 討論

14-3-3 蛋白是一類調(diào)控植物激酶與轉(zhuǎn)錄因子信號轉(zhuǎn)導的基礎性蛋白，參與調(diào)節(jié)植物多種生理和發(fā)育過程[34-35]。筆者在本研究中通過對蘋果基因組數(shù)據(jù)分析鑒定得到36 個蘋果14-3-3 基因家族成員，與研究鑒定得到的擬南芥[16]、番茄[9]、苜蓿[11]、大豆[12]和茶樹[36]14-3-3 家族成員（分別為15、12、18、11 和23個）相比，蘋果14-3-3 基因家族成員數(shù)量大，表明14-3-3 基因家族成員在不同物種間有較大差異，而本研究較Ren 等[27]和Zuo 等[21]已發(fā)表文章鑒定出更多的蘋果14-3-3 家族成員，其中7 個基因（MdGRF8、12、13、16、23、26 和27）未被鑒定，且都存在于進化關系的非ε 類，MdGRF12/MdGRF13、MdGRF16/MdGRF26 及MdGRF23/MdGRF27 相鄰（圖2），進化關系較近。筆者在本文中通過qPCR 分析發(fā)現(xiàn)MdGRF19（MD10G1280300）在莖中表達量最高，而在葉中表達量最低，與Ren 等[27]的研究結果相反，與Zuo 等[21] 的研究結果相同。MdGRF11（MD10G1280300）[27]在ABA 和PEG 處理下表達趨勢與本文MdGRF19（MD10G1280300）研究結果基本一致。Zuo 等[21] 亞細胞定位發(fā)現(xiàn)MdGF14j（MD10G1280300）蛋白定位在細胞質(zhì)和細胞核中，與Ren 等[27]的研究結果相同。推測其原因可能是不同版本的數(shù)據(jù)庫有差異，以蘋果不同品種間的數(shù)據(jù)比對篩選出更多被識別的基因。

理化性質(zhì)分析表明，蘋果14-3-3 蛋白pI 值小于7，這與李菲等[11]14-3-3 蛋白是酸性氨基酸的研究結果一致。系統(tǒng)進化分析顯示蘋果14-3-3 基因家族分為ε 類和非ε 類，且非ε 類雙子葉植物蘋果（52.8%）、擬南芥（57.1%）和番茄（58.3%）比例高于單子葉植物二穗短柄草（85.7%）和番茄（85.7%），在ε 類的結果相同[17]。Zuo 等[21]的研究表明，蘋果MdGF14a、MdGF14d、MdGF14i 和MdGF14j 蛋白與關鍵的花整合因子MdTFL1 和MdFT相互作用，參與開花調(diào)控，在本研究中，MdGRF6 在系統(tǒng)發(fā)育樹與MdGF14i 和MdGF14j 相鄰，推測其具有相似的作用。研究發(fā)現(xiàn)，14-3-3 蛋白以N-端和C-端不同的motif 為核心結構發(fā)揮不同功能[37]，本研究中蘋果14-3-3 家族蛋白ε和非ε 類的N-端與C-端有不同的motif，該家族蛋白可能與靶蛋白相結合發(fā)揮重要功能。蘋果14-3-3 家族基因有10 對片段重復和6 對串聯(lián)重復基因，表明片段重復在其基因家族的進化過程中起著重要的作用，并且串聯(lián)和片段重復事件有利于植物進化過程中基因家族成員的擴展[38-39]。煙草葉片瞬時表達亞細胞定位實驗表明，MdGRF13 蛋白定位在細胞核、細胞質(zhì)和細胞膜中，與Ren等[27]和Zuo等[21]所得結果相似，說明14-3-3 家族蛋白在不同植物中有保守功能，其可能在細胞核中調(diào)控部分基因的轉(zhuǎn)錄。

組織特異性表達有助于了解植物中的基因功能[40-41]。通過qRT-PCR發(fā)現(xiàn)蘋果14-3-3 家族基因在根、莖和葉組織中都有表達，而在莖中表達量較高，與木薯14-3-3 蛋白在塊根不同發(fā)育時期有不同組織的表達研究結果相似[42]，說明14-3-3 家族基因在蘋果中有一定的組織特異性表達。研究發(fā)現(xiàn)，水稻OsGF14b 的突變對干旱和滲透脅迫耐受性的提高可能與ABA 信號通路有關[43]。qPCR 結果顯示，MdGRF4、MdGRF16、MdGRF18 和MdGRF26 在ABA處理下上調(diào)表達，本文結果與以上研究相似，推測該家族基因功能與ABA相關，表明蘋果14-3-3蛋白可能與ABA介導的保衛(wèi)細胞相結合，進而影響其在激活ABA應答基因中的轉(zhuǎn)錄[5]。干旱脅迫會降低植物的光合和碳水化合物的合成，進而減緩植物的生長發(fā)育[44]。14-3-3 蛋白作為重要的干旱調(diào)控因子在脅迫反應中有不同程度的表達，MdGRF26 在PEG處理下高表達，同時，6 個基因有一定量的上調(diào)表達。本研究在蘋果愈傷組織過表達MdGRF13，在不同濃度PEG處理下，轉(zhuǎn)基因愈傷組織長勢優(yōu)于野生型，且以2% PEG 處理下長勢最好，與棉花CGF14-4[45]和油菜GF14omeg 基因[46]在干旱脅迫下上調(diào)表達研究結果相似，表明過表達MdGRF13 增強了蘋果愈傷組織的抗旱性。實時熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)，MdGRF2、MdGRF4、MdGRF5、MdGRF13、MdGRF14 和MdGRF16 在NaCl 處理下表達量分別為對照的18.6、7.6、7.5、2.1、6.5 和15.6 倍，且本研究在0.06 mol·L-1 NaCl 處理下，轉(zhuǎn)基因愈傷組織長勢優(yōu)于野生型，與小麥[23]、番茄[9]、水稻[47]及短柄草[48]TaGF14b 在煙草中異位表達時增強鹽脅迫耐受性的研究結果相似，表明過表達MdGRF13 增強了蘋果愈傷組織對鹽脅迫的抗性。而在0.08 mol·L-1 NaCl 處理下，轉(zhuǎn)基因愈傷組織較野生型表型未發(fā)生較大變化，可能是較高濃度NaCl 處理抑制了愈傷組織的生長。同時，本文研究結果與Ren 等[27]MdGRF11（MD10G1280300）在愈傷組織中過表達可增強抗旱性和耐鹽性研究結果一致。說明蘋果14-3-3 家族基因在抵御非生物脅迫的過程中發(fā)揮了重要的作用。

4 結論

本研究通過生物信息學分析鑒定出36 個蘋果14-3-3 基因家族成員，系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)其與擬南芥同源性較高，且各亞族成員結構保守。亞細胞定位顯示，MdGRF13 蛋白定位在細胞核、細胞質(zhì)和細胞膜中。過表達MdGRF13 增強了蘋果愈傷組織的抗旱性和耐鹽性。對進一步研究蘋果14-3-3 家族成員的功能具有重要意義。

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