練毅剛,鄭豐杰,張寧,溫笑薇,張山,閆玉琴,崔蘭鳳,蘇惠萍

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院,北京 100700; 2.北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100029; 3.北京市隆福醫(yī)院,北京 100700

間質(zhì)性肺疾病(interstitial lung disease,ILD)臨床以進(jìn)行性加重的呼吸困難、通氣功能障礙伴彌散功能降低、低氧血癥為主要特征。間質(zhì)性肺疾病為一大類疾病,近年來(lái)發(fā)病呈上升趨勢(shì),其種類有180多種[1-3],病因不明,臨床特征為漸進(jìn)性呼吸困難、干咳、低氧血癥等,最終可導(dǎo)致雙肺纖維化,甚至危及生命。目前,關(guān)于間質(zhì)性肺疾病的有效治療方法有限,肺移植是ILD發(fā)展到終末期的有效治療手段,但費(fèi)用高昂、供體器官缺乏以及移植后的排斥反應(yīng)等導(dǎo)致難以廣泛開(kāi)展[4-6]。研究發(fā)現(xiàn),蘇惠萍老師經(jīng)驗(yàn)方劑扶正剔邪搜絡(luò)方治療博來(lái)霉素致肺纖維化大鼠療效顯著[7-9]?；诖?本研究擬觀察扶正剔邪搜絡(luò)方及吸氧條件下肺纖維化大鼠血氧分壓在不同時(shí)相的變化,為臨床改進(jìn)治療方案提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康清潔級(jí)雄性SD大鼠160只,體質(zhì)量(300±20)g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供,許可證編號(hào):SCXK(京)2012-0001。將動(dòng)物于SPF級(jí)動(dòng)物房進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,環(huán)境溫度20～25 ℃,相對(duì)濕度50%～60%,自然節(jié)律采光,標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng),自由進(jìn)食和飲水。

1.2 藥物與試劑注射用鹽酸博萊霉素(bleomycin hydrochloride for injection,規(guī)格:15 mg/瓶,日本化藥株式會(huì)社,批號(hào):Y91450);扶正剔邪搜絡(luò)方(顆粒劑,規(guī)格:7.440 g/袋,康美藥業(yè)集團(tuán),批號(hào):100829)。血?dú)馍囗?xiàng)測(cè)試卡片(干式電化學(xué)法,美國(guó)雅培公司,型號(hào):G3+,標(biāo)準(zhǔn)編號(hào):YZB/USA3421-2012)。

1.3 儀器JJ-12J型脫水機(jī)、JB-P5型包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司);RM2016型病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司);DHG-9140A型烤箱(上海慧泰儀器制造有限公司);NIKON DS-U3型全景組織顯微成像系統(tǒng)(日本尼康公司)。

2 方法

2.1 模型建立與分組采用隨機(jī)數(shù)字表法將160只大鼠分為假手術(shù)組、模型組、扶正剔邪搜絡(luò)方組、氧療組及扶正剔邪搜絡(luò)方+氧療組,每組32只。除假手術(shù)組外,按照參考文獻(xiàn)[10]方法建立肺纖維化大鼠模型,以50 mg·kg-1的劑量腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后,將大鼠固定,在輔助光源照射下提起大鼠舌頭,采用18號(hào)套管針經(jīng)口腔水平插入,達(dá)到咽喉部位后,將針尾壓低,使針頭抬高15°～30°,待插入氣管之后,將針芯拔出。使用棉球薄片檢驗(yàn)套管針位置,將其置于套管針外口,如果套管針已在氣管,可見(jiàn)到薄片隨呼吸前后運(yùn)動(dòng)。然后快速經(jīng)氣管插管以2.5 mL·kg-1的劑量注射0.2%博來(lái)霉素溶液,之后快速經(jīng)氣管插管注射0.3 mL空氣,并立即直立旋轉(zhuǎn)大鼠,令藥液在雙肺內(nèi)得以均勻分布。假手術(shù)組大鼠注射相同容積的生理鹽水,其余操作同上。

2.2 給藥在造模24 h后,扶正剔邪搜絡(luò)方組及扶正剔邪搜絡(luò)方+氧療組大鼠灌胃給予0.67 g·kg-1扶正剔邪搜絡(luò)方顆粒劑溶液;吸氧組、假手術(shù)組和模型組大鼠灌胃給予相同體積的生理鹽水,每天1次,連續(xù)28 d。吸氧組和扶正剔邪搜絡(luò)方+氧療組大鼠放置在封閉的吸氧倉(cāng)中,和外界用一個(gè)管道連接,該管道連接氧氣瓶,外部管道設(shè)置一個(gè)閥門(mén),用來(lái)控制給氧流量,在倉(cāng)內(nèi)放置氧濃度監(jiān)測(cè)裝置,然后通過(guò)調(diào)節(jié)氧流量,使得倉(cāng)內(nèi)氧濃度保持在30%左右,每天吸氧2 h。

2.3 血氧分壓檢測(cè)放置大鼠于解剖臺(tái),將腹部皮膚剪開(kāi),從腹主動(dòng)脈采血,單片測(cè)試卡片要在室溫下放置5 min,排棄采血針第一滴血,迅速將血樣注入注樣口后,立即封閉注樣口,之后分析動(dòng)脈血?dú)狻?/p>

2.4 電鏡觀察組織病理變化電鏡固定液固定后的肺組織用0.1 mol·L-1磷酸緩沖液漂洗,每次 15 min,共3次。用含1%鋨酸的0.1 mol·L-1磷酸緩沖液室溫固定2 h,0.1 mol·L-1磷酸緩沖液漂洗3次,每次15 min。上行酒精脫水(體積分?jǐn)?shù)50%乙醇15 min→體積分?jǐn)?shù)70%乙醇15 min→體積分?jǐn)?shù)80%乙醇15 min→體積分?jǐn)?shù)90%乙醇15 min→體積分?jǐn)?shù)95%乙醇15 min→體積分?jǐn)?shù)100%乙醇 15 min→體積分?jǐn)?shù)100%乙醇15 min→體積分?jǐn)?shù)100%丙酮15 min→體積分?jǐn)?shù)100%丙酮15 min),滲透(丙酮與812包埋劑11滲透2 h→丙酮與812包埋劑12滲透過(guò)夜),包埋,60 ℃聚合48 h,超薄切片機(jī)切片,電子顯微鏡下采集圖像并分析。

3 結(jié)果

3.1 模型組大鼠肺組織電鏡病理結(jié)果電鏡病理結(jié)果顯示,模型組大鼠肺小動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞腫脹,樹(shù)狀突起,凸向管腔,膜平滑肌增厚,內(nèi)彈力板粗細(xì)不均勻,第7天模型組大鼠肺組織內(nèi)皮細(xì)胞與基底膜相連處有大量空泡,局部肺泡纖維化,第14天模型組大鼠肺組織少量肺泡纖維化,第21、28天模型組大鼠肺組織肺泡纖維化嚴(yán)重,說(shuō)明造模成功。

注:A:第7天;B:第14天;C:第21天;D:第28天。

3.2 各組大鼠血氧分壓比較與假手術(shù)組比較,第7、14、21、28天時(shí),模型組大鼠血氧分壓均明顯降低(P<0.01);與模型組比較,第7、14、21、28天時(shí),扶正剔邪搜絡(luò)方組大鼠血氧分壓均明顯改善(P<0.01);第14天時(shí),氧療組大鼠血氧分壓明顯改善(P<0.01);第7、14、21天,扶正剔邪搜絡(luò)方+氧療組大鼠血氧分壓明顯改善(P<0.01或P<0.05)。

表1 各組大鼠不同時(shí)相血氧分壓結(jié)果

4 討論

肺絡(luò)指肺及肺系之絡(luò)脈,包括肺中的血管、細(xì)支氣管及淋巴管等[11-12]。與肺間質(zhì)纖維化病變部位相符,肺之絡(luò)脈又有血絡(luò)、氣絡(luò)之分,分行于內(nèi)外,即張介賓所說(shuō):“血脈在中,氣絡(luò)在外。”血絡(luò)起到行營(yíng)血、濡養(yǎng)本臟的作用,可化生神氣;氣絡(luò)起到行氣津,溫養(yǎng)機(jī)體的作用[13-15]。肺間質(zhì)纖維化在其發(fā)病之初期,主要病變部位是在氣絡(luò),隨著疾病進(jìn)展,邪氣逐漸從淺表之氣絡(luò)向深部傳入終至血絡(luò),肺炎期到纖維化期的發(fā)展過(guò)程亦是氣絡(luò)病向血絡(luò)病的發(fā)展過(guò)程[16-17],在肺氣虛、痰濁、瘀血共同作用下而致肺絡(luò)痹阻[18-20]。扶正剔邪搜絡(luò)方由人參、麥冬、五味子、浙貝母、皂角刺、水蛭、地龍、全蝎組成,其中人參、麥冬、五味子三藥共用,益氣養(yǎng)陰,潤(rùn)燥生津;皂角刺搜絡(luò)剔痰;浙貝母清熱散結(jié)化痰;蟲(chóng)類藥物地龍等搜剔經(jīng)絡(luò),針對(duì)肺纖維化瘀血干結(jié)難破的特點(diǎn),辛通、甘潤(rùn)之品配伍應(yīng)用,起到攻補(bǔ)兼施,祛瘀同時(shí)促進(jìn)新血生成[21-22]。全方諸藥合用,益氣養(yǎng)陰化痰通絡(luò),氣絡(luò)血絡(luò)同治,解氣郁,通血絡(luò)。

研究發(fā)現(xiàn),肺部纖維化與血管生成之間關(guān)系密切,多種刺激因素可引起肺血管再生[23-24],如缺氧、應(yīng)激損失、細(xì)胞因子等,缺氧刺激促血管生成因子釋放,引起毛細(xì)血管代償性增生以適應(yīng)組織代謝需要,同時(shí)炎性細(xì)胞釋放大量促血管生成因子促進(jìn)血管生成及重構(gòu)[25-27],血管的過(guò)度生成及重構(gòu)導(dǎo)致無(wú)效通氣的增加。與模型組比較,各不同時(shí)相中藥組血氧分壓均明顯改善,其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)過(guò)度血管生成及重構(gòu)有關(guān)[28]。氧療組只在第14天時(shí)對(duì)大鼠血氧分壓起到改善作用,而中藥加氧療組在第7、14、21天時(shí)大鼠血氧分壓均改善明顯,亦說(shuō)明中藥具有改善大鼠血氧分壓的作用[29]。

本次實(shí)驗(yàn)氧療組第7、21、28天時(shí)對(duì)大鼠血氧分壓的改善作用不明顯,而中藥加氧療組對(duì)血氧分壓改善效果亦不如單用中藥,在第28天時(shí)對(duì)于血氧分壓改善已無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明在肺泡炎癥期到肺纖維化形成的過(guò)程中給予氧療最終未起到改善氧合的作用,推測(cè)可能與給氧濃度、給氧時(shí)間及肺部血管再生產(chǎn)生無(wú)效血管灌注相關(guān),需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。