王 佳，成偉偉，容維中，楊 明，陳伯祥，趙子惠，李元新

（ 甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅 平?jīng)?744000 ）

豬傳染性胃腸炎（porcine transmissible gastroenteritis）是由豬傳染性胃腸炎病毒（transmissible gastroenteritis virus，TGEV）引起的一種急性、高度接觸性傳染病。1946年，Doyle等[1]確定豬傳染性胃腸炎的病原體為病毒；1956 年我國(guó)首次報(bào)道后，該病在我國(guó)多省份接連發(fā)生[2]。豬傳染性胃腸炎以嚴(yán)重腹瀉、嘔吐和脫水為臨床特征，不同日齡的豬均易感，兩周齡內(nèi)仔豬病死率高達(dá)100%[3]。豬傳染性胃腸炎多發(fā)于冬、春季，感染高峰期在1～2月，在新疫區(qū)暴發(fā)性流行，老疫區(qū)間歇性流行。TGEV 通過(guò)呼吸道和消化道傳播，發(fā)病豬和帶毒豬可通過(guò)呼氣、嘔吐物、糞便排出病毒，患病豬經(jīng)治療痊愈后仍會(huì)帶毒。病毒經(jīng)口鼻進(jìn)入宿主體內(nèi)，在豬的鼻黏膜和肺部繁殖，再通過(guò)消化道和血液循環(huán)至小腸黏膜上皮細(xì)胞[4]。TGEV臨床中常與豬流行性腹瀉病毒（PRCV）、豬輪狀病毒和豬δ 冠狀病毒混合感染，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[5]。

TGEV屬于冠狀RNA病毒，基因組結(jié)構(gòu)具有較高的突變性，雖已研究出了TGEV 各類疫苗，但該病的防控難度仍然較大。進(jìn)行TGEV基因組解析有助于鑒別病毒、闡明病毒感染的作用機(jī)制，為新型疫苗和治療藥物的開(kāi)發(fā)提供方向。本文闡述了近年來(lái)TGEV的病毒特點(diǎn)、基因結(jié)構(gòu)以及編碼得到的主要蛋白功能的研究進(jìn)展，以期為后續(xù)TGEV防控及致病機(jī)制的相關(guān)研究提供參考。

1 TGEV病原學(xué)

TGEV 為尼多病毒目（Nidovirales）冠狀病毒科（Coronavirus）冠狀病毒屬（Coronavirus）α 亞群成員，是具有囊膜的單股正鏈RNA 病毒。病毒囊膜為雙層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，外形類皇冠或太陽(yáng)日冕形狀，為直徑約90～200 nm 的圓形或橢圓形，外膜上為柄狀結(jié)構(gòu)連接的纖突蛋白（S），形似花瓣，大而稀疏，長(zhǎng)約12～25 nm，末端膨大部直徑約10 nm。S、膜蛋白（M）與包膜蛋白（E）鑲嵌于病毒囊膜；核衣殼蛋白（N）與病毒RNA 結(jié)合，共同構(gòu)成直徑約9～16 nm的螺旋狀核糖核蛋白（RNP），使病毒粒子獲得感染力[3-4]。磷鎢酸負(fù)染電鏡觀察，制樣過(guò)程中纖突極易斷裂后脫落，有時(shí)只能觀察到少數(shù)花瓣?duì)罾w突或囊膜邊界視野中僅有一個(gè)電子透明中心。TGEV病毒結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1[2,6]。

圖1 TGEV病毒結(jié)構(gòu)Fig.1 Virus structure of TGEV

TGEV 只存在一種血清型，與豬呼吸道冠狀病毒（PRCV）具有交叉保護(hù)性，與犬冠狀病毒（CCV）和貓傳染性腹膜炎病毒（FIPV）具有抗原相關(guān)性，與戊型肝炎病毒（HEV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）無(wú)抗原相關(guān)性[3]。TGEV對(duì)溫度、紫外線敏感，耐冷不耐熱、對(duì)乙醚、SDS等有機(jī)試劑敏感，病毒粒子在膽汁中較穩(wěn)定。此外，病毒的毒力越強(qiáng)，對(duì)胰酶的敏感性越低。SH株和TO株在4 ℃的條件下會(huì)凝集部分動(dòng)物的紅細(xì)胞，但不凝集鵝和小鼠的紅細(xì)胞[7]。TGEV感染豬睪丸細(xì)胞（ST）和豬腎細(xì)胞（PK-15）時(shí)會(huì)形成雙膜囊泡（DMVs），DMV是冠狀病毒復(fù)制的一種標(biāo)志。實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)常用ST 和PK-15 細(xì)胞系，其中TGEV 對(duì)ST 細(xì)胞系最為敏感，但在ST 細(xì)胞和PK-15細(xì)胞系上進(jìn)行體外培養(yǎng)并不能完全模擬TGEV 在體內(nèi)宿主細(xì)胞中的完整過(guò)程。因此，李甜甜等[8]建立了豬腸道上皮細(xì)胞系（IPEC-J2）模型，尹靈丹等[9]建立了TGEV的腸小體感染模型，均比ST和PK-15細(xì)胞系更接近體內(nèi)環(huán)境。

TGEV 感染宿主細(xì)胞的主要受體為豬氨基肽酶N（pAPN）。有研究在新生仔豬的小腸絨毛上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)一個(gè)約200 kDa 的蛋白質(zhì)，此蛋白質(zhì)在3 周齡以上豬中不存在，推測(cè)該蛋白受體為T(mén)GEV 感染低齡仔豬的第二受體[10]。表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）作為輔助因子在感染早期與pAPN 協(xié)同作用[11]。輔助受體（Neu5Gc）決定TGEV的腸道趨向性，PRCV缺乏此受體，故不感染腸道器官[12]。

2 TGEV基因組結(jié)構(gòu)及功能

2.1 TGEV基因組結(jié)構(gòu)

TGEV基因組長(zhǎng)度約28.5 kbp，是最大的RNA病毒，雖為單股正鏈不分節(jié)段RNA 病毒，但具有類似分節(jié)段RNA病毒的高重組率特點(diǎn)[13]。TGEV 分子量約6×103kDa，全基因組共7 個(gè)分區(qū)，其中ORF1 由ORF1a 和ORF1b 共同構(gòu)成，ORF3 由ORF3a 和ORF3b 共同構(gòu)成，基因組排列順序?yàn)椋?'-UTR-ORF1a-ORF1b-S-ORF3a-ORF3b-E-M-NORF7-UTR-3'，5'端有帽子結(jié)構(gòu)，3'端有poly（A）尾，各個(gè)基因間結(jié)構(gòu)緊湊。5'端的ORF1長(zhǎng)約20 kbp占據(jù)整個(gè)基因組的2/3，3'端的基因組約8.4 kbp 占整個(gè)基因組的1/3。不同基因之間被核心區(qū)為（CUAAAC）的轉(zhuǎn)錄調(diào)整序列（TRS）隔開(kāi)，是轉(zhuǎn)錄亞基因組RNA的起始信號(hào)[14]。5'端前598 bp為病毒包裝信號(hào)，3'端后494 bp對(duì)病毒包裝非必需，但可提高包裝效率[11]。TGEV基因組結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2。

圖2 TGEV基因組結(jié)構(gòu)Fig.2 Genome structure of TGEV

不同毒株非編碼區(qū)的長(zhǎng)度不同，5'端非編碼區(qū)（UTR）約200～400 bp，3'端UTR 約300～500 bp，5'-UTR 包含存在65～98 bp的前導(dǎo)序列。不同CoV 5'-UTR二級(jí)結(jié)構(gòu)存在較大差異，但均存在一個(gè)約15個(gè)核苷酸組成的“莖環(huán)結(jié)構(gòu)”。3'-UTR 尤其是Poly（A）附近高度保守的基因序列對(duì)TGEV 的RNA 轉(zhuǎn)錄具有非常重要的作用，兩端UTR 中的順勢(shì)調(diào)控區(qū)域?qū)Σ《巨D(zhuǎn)錄具有重要作用[2]。TGEV的繁殖階段在胞質(zhì)中進(jìn)行，過(guò)程與其他冠狀病毒相似。TGEV 基因組RNA可直接作mRNA，或作模板擴(kuò)增負(fù)鏈，再由負(fù)鏈作模板擴(kuò)增新的正鏈RNA 和亞基因組RNA，而后經(jīng)過(guò)翻譯、組裝、釋放，完成整個(gè)復(fù)制周期。

2.2 TGEV結(jié)構(gòu)基因

2.2.1 S基因

S 基因長(zhǎng)度約4.35 kbp，編碼得到1 447～1 449 個(gè)氨基酸殘基的前體蛋白。蛋白質(zhì)糖基化對(duì)病毒抗原性具有重要作用，TGEV S 蛋白約含51 個(gè)N-糖基化修飾位點(diǎn)，糖基化前分子量128～160 kDa，糖基化后增加約30 kDa。蛋白質(zhì)磷酸化介導(dǎo)蛋白質(zhì)活性，增強(qiáng)蛋白質(zhì)相互作用的能力。TGEV S 蛋白約含139 個(gè)磷酸蛋白[15]。S 蛋白是Ⅰ型跨膜糖蛋白，為一種同源三聚體。每個(gè)單體分為S1 和S2 兩個(gè)區(qū)域，S1 具有S1-CTD 和S2-NTD 兩個(gè)獨(dú)立的功能亞域，CTD 是受體結(jié)合關(guān)鍵區(qū)域；S2 存在HR1 和HR2 兩個(gè)重要的保守重復(fù)氨基酸序列[15]?；ò?duì)頢1直接參與病毒、靶細(xì)胞的識(shí)別，誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，決定病毒的種屬嗜性和感染特性。連接病毒囊膜與S1 部分的柄狀S2 區(qū)域，固定S蛋白于囊膜上，參與病毒囊膜和宿主細(xì)胞膜融合的過(guò)程。

S蛋白氨基端在外，羧基端在內(nèi)，具有膜外區(qū)、跨膜區(qū)、膜內(nèi)區(qū)等3 個(gè)區(qū)域，N 端aa1～aa16 分泌信號(hào)肽。膜外區(qū)主要為冠狀凸起部分，其上含有氨基肽酶N（APN）識(shí)別位點(diǎn)，aa522～aa744區(qū)域與pAPN發(fā)生黏附介導(dǎo)感染，pAPN上的aa36～aa223、aa349～aa591、aa592～aa963 可與抗pAPN 抗體結(jié)合，不同程度地阻斷TGEV 感染。研究表明，敲除pAPN 的仔豬對(duì)TGEV 具有抵抗力，并且敲除該位點(diǎn)后不會(huì)引起宿主細(xì)胞生理功能改變。N 端存在一處血凝活性區(qū)，故與其他冠狀病毒（CoV）相比，TGEV雖無(wú)血凝素蛋白（HE），但仍具有血凝活性，PRCV缺失該血凝活性區(qū)，故利用檢測(cè)血凝活性可區(qū)分PRCV和TGEV。

S 蛋白從氨基端到羧基端存在為C、B、D、A 等4 個(gè)抗原位點(diǎn)。A 位點(diǎn)在aa538～aa591 內(nèi)，是分布在病毒粒子表面的不連續(xù)抗原位點(diǎn)。aa537～aa547處有一條可部分代表A 位點(diǎn)的多肽，可用于病毒的區(qū)分。A 位點(diǎn)存在Aa、Ab、Ac等3個(gè)亞位點(diǎn)，核心分別位于538、591和543殘基處。B位點(diǎn)位于aa97～aa144，具有復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)。C 位點(diǎn)位于aa49～aa52，是一段連續(xù)的線狀結(jié)構(gòu)，對(duì)溫度和pH值進(jìn)行調(diào)節(jié)可影響C 位點(diǎn)的親和性。PRCV 缺少C 位點(diǎn)，通過(guò)此位點(diǎn)可區(qū)分PRCV 和TGEV。D 位點(diǎn)位于aa382～aa385，高度保守，可能在病毒繁殖中起到一定作用。S 蛋白存在抗原位點(diǎn)、抗原亞位點(diǎn)和抗原決定簇等3種抗原層次。目前已知S蛋白的抗原決定簇共11個(gè)，與產(chǎn)生中和抗體相關(guān)的有5個(gè)，A、D位點(diǎn)誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體。

2.2.2 M基因

M 基因長(zhǎng)度約789 bp，編碼得到的蛋白質(zhì)前體約含262 個(gè)氨基酸殘基，切除aa1～aa16 的信號(hào)肽、轉(zhuǎn)膜、糖基化后得到成熟的M蛋白，攜帶一條富含甘露糖天冬氨肽連接的側(cè)鏈[4]。M蛋白分子量約29～31 kDa，形成于宿主細(xì)胞質(zhì)中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，可在病毒囊膜中多次跨膜，包埋在病毒囊膜中，含量最多，維持了病毒包膜形狀。TGEV 的M蛋白1/3的C端暴露于病毒的囊膜之外，2/3的C端存在于病毒內(nèi)部，是一種不同于其他冠狀病毒的空間構(gòu)象。膜外的C端可作為保護(hù)性抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體中和病毒，介導(dǎo)被感染細(xì)胞發(fā)生補(bǔ)體溶解反應(yīng)。N 端6～22 氨基酸殘基區(qū)具有誘導(dǎo)機(jī)體干擾素產(chǎn)生的抗原決定簇，可在體外誘導(dǎo)干擾素-α（INF-α）。此外，M蛋白還可以通過(guò)誘導(dǎo)干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF-3）的磷酸化和核轉(zhuǎn)移激活I(lǐng)FN-β 信號(hào)通路，誘導(dǎo)干擾素-β（INF-β）的產(chǎn)生[16]。TGEV 的M 蛋白可同Nsp3 結(jié)合調(diào)節(jié)病毒早期復(fù)制。Ji 等[17]闡明了TGEV 內(nèi)化侵入細(xì)胞的一種新機(jī)制——通過(guò)網(wǎng)格蛋白（clathrin）介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，幫助TGEV M 蛋白與HSC70 互相作用，影響病毒TGEV內(nèi)化過(guò)程。

2.2.3 E基因

E 基因長(zhǎng)度約246 bp，編碼后得到的蛋白質(zhì)前體含82個(gè)氨基酸，成熟的E蛋白僅含78個(gè)氨基酸。E蛋白（sM蛋白、包膜蛋白E）是一種小分子跨膜蛋白，分子量約7.9 kDa。E蛋白由一個(gè)疏水結(jié)構(gòu)域和一個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)域組成，參與病毒組裝、出芽和包膜形成過(guò)程[12]。E蛋白可調(diào)控病毒粒子的裝配和釋放，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，提高白細(xì)胞介素18（IL-18）的表達(dá)[18]。雖然E蛋白缺失不影響病毒RNA合成，但對(duì)于TGEV 的復(fù)制、病毒粒子在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸和成熟是必需的。研究發(fā)現(xiàn)，TGEV M 蛋白和E蛋白共表達(dá)是病毒樣顆粒組裝和釋放的必要條件，而且M蛋白與E蛋白形成的病毒樣顆粒（VLPs）能夠誘導(dǎo)INF-α產(chǎn)生，可抵御TGEV的感染[19]。

2.2.4 N基因

N基因長(zhǎng)約1 149 bp，編碼得到的蛋白質(zhì)前體約382個(gè)氨基酸殘基。成熟的N 蛋白分子質(zhì)量約45 kDa，與病毒RNA結(jié)合形成核衣殼，使病毒獲得感染力[20]。N蛋白是一種序列保守的磷酸化酸性蛋白，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答，含有A、B、C等3個(gè)高度保守的抗原位點(diǎn)[20]。N蛋白可延長(zhǎng)細(xì)胞周期的合成期，能夠引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和白細(xì)胞介素-8（IL-8）上調(diào)[18]。研究發(fā)現(xiàn)，N蛋白定位于核仁這一過(guò)程對(duì)核糖體優(yōu)先翻譯病毒亞基因組RNA和調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂周期具有重要作用[21]。TGEV抗N蛋白血清中和全活病毒時(shí)90%以上的亞基因組mRNA合成被抑制[14]。

2.3 TGEV非結(jié)構(gòu)基因

2.3.1 ORF1（Nsp1～Nsp16）

ORF1 位于基因組5'端，編碼病毒復(fù)制與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的酶，由ORF1a和ORF1b構(gòu)成。ORF1全長(zhǎng)約20 kbp，ORF1a約12 051 bp，ORF1b 約8 094 bp，ORF1a 的變異性明顯高于ORF1b。ORF1b 有43 個(gè)堿基重疊于上游ORF1a 中，重疊部分為核糖體移碼信號(hào)區(qū)。ORF1a編碼多聚蛋白pp1a，ORF1a 和ORF1b 共同編碼多聚蛋白pp1ab，經(jīng)Nsp3 和Nsp5 切割后形成16 個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp1～Nsp16。非結(jié)構(gòu)蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生DMVs，以此組裝形成病毒的轉(zhuǎn)錄復(fù)合體（RTC），在RTC幫助下以不連續(xù)轉(zhuǎn)錄的方式合成一套具有5'端帽子結(jié)構(gòu)和3'端Poly（A）尾嵌套的亞基因組RNA[22]。在ORF1 的上游117 位堿基處有一個(gè)小ORF（AUGAAAUCA），通過(guò)同源蛋白的結(jié)構(gòu)和功能推斷，該ORF 可能對(duì)ORF1 的翻譯起到調(diào)控作用。Nsp3、Nsp4 和Nsp6 可促進(jìn)DMVs 的形成；Nsp7、Nsp8、Nsp9、Nsp12 和Nsp13 相互作用形成RTC，促進(jìn)RNA 序列反應(yīng)，共同參與RTCs 的形成[23]。非結(jié)構(gòu)蛋白在不同冠狀病毒中相對(duì)保守，在病毒的生命周期中起到重要作用[22]。

α 屬病毒Nsp1 不與40s 核糖體結(jié)合，也不促進(jìn)宿主細(xì)胞mRNA 降解，但可在一定程度上抑制宿主蛋白質(zhì)翻譯，并且這種抑制具有宿主特異性[24]。TGEV Nsp1 可抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞和海拉細(xì)胞無(wú)細(xì)胞提取物的蛋白質(zhì)翻譯，但不影響兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物的翻譯[25]。TGEV Nsp1 的aa85～aa102 區(qū)域磷酸化后，激活核因子κB（NF-κB），誘導(dǎo)Ⅲ型IFN產(chǎn)生[26]。Nsp1蛋白存在于α屬和β屬CoV中，但兩個(gè)屬抑制宿主基因的表達(dá)機(jī)制不同，比較Nsp1 表面靜電、形成和氨基酸序列，推測(cè)同源異途進(jìn)化是導(dǎo)致表達(dá)機(jī)制不同的原因。因此，兩屬病毒的Nsp1 氨基酸序列差異大也可作為區(qū)分冠狀病毒屬的特異性標(biāo)記[2,12]。

Nsp2分子量較大，序列不保守，不是CoV復(fù)制的必需成分，但缺少Nsp2會(huì)導(dǎo)致病毒合成量降低[2]。Nsp2可誘導(dǎo)前炎性因子表達(dá)，aa1～aa120 區(qū)域可激活核因子NF-κB 信號(hào)通路[12]。Nsp3 約含1 922 個(gè)氨基酸，平均分子量200 kDa，是CoV 編碼的最大的多結(jié)構(gòu)域非結(jié)構(gòu)蛋白。所有CoV Nsp3中均具有泛素樣結(jié)構(gòu)域1、泛素樣結(jié)構(gòu)域2、宏結(jié)構(gòu)域、富含Glu 的酸性域、木瓜蛋白酶樣蛋白酶2、NSP3胞外域、未知功能域Y1和CoV-Y結(jié)構(gòu)域等8種結(jié)構(gòu)域[24]。Nsp3 具有木瓜蛋白酶樣蛋白酶活性（PLpro），包括PL1pro和PL2pro等兩個(gè)水解活性位點(diǎn)，水解多聚蛋白獲得Nsp1～Nsp4[27]。Nsp3 宏結(jié)構(gòu)域在病毒復(fù)制和免疫逃避中起到作用[12]。α屬冠狀病毒Nsp3主要結(jié)構(gòu)域[22]見(jiàn)圖3。

圖3 α屬冠狀病毒Nsp3主要結(jié)構(gòu)域Fig.3 Primary domain of α-coronavirus Nsp3

Nsp4是一個(gè)跨膜蛋白，包含TM1、TM2、TM3、TM4等4個(gè)預(yù)測(cè)的跨膜區(qū)域[24]。Nsp4是一種糖基化蛋白，對(duì)病毒DMVs 的形成很重要，糖基化程度與CoV 適應(yīng)性相關(guān)[2]。Nsp5也稱3-胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶（3CLpro），水解多聚蛋白獲得Nsp5～Nsp16，是研發(fā)抗冠狀病毒藥物的重要靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，Nsp5 具有多種形態(tài)，只有二聚體形態(tài)才具有3CLpro活性[2]。

Nsp6是一個(gè)跨膜蛋白，是病毒的轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的跨膜組成部分，包含6 個(gè)跨膜區(qū)和1 個(gè)保守的疏水結(jié)構(gòu)域。Nsp6可誘導(dǎo)小直徑自噬體的產(chǎn)生，限制了其運(yùn)送病毒的能力，利于病毒感染[12]。Nsp7 定位于細(xì)胞質(zhì)，對(duì)細(xì)胞周期、細(xì)胞周期蛋白A 的表達(dá)均無(wú)影響，具有使小腸上皮細(xì)胞（IEC）降低分泌IL-8 的能力[28]。晶體角度發(fā)現(xiàn)，Nsp7 能夠與Nsp8 形成復(fù)合體[12]。Nsp8 具有RNA 聚合酶活性，但與Nsp12 相比則弱得多。有研究認(rèn)為，Nsp8 是Nsp12 的潛在RNA 引物酶，可指導(dǎo)RNA 合成。此外，Nsp8 是復(fù)制轉(zhuǎn)錄復(fù)合物（RTC）相關(guān)蛋白[2]。Nsp9有核酸結(jié)合能力，與Nsp8形成二聚體，對(duì)病毒復(fù)制起到重要作用[29]。

Nsp10是一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，具有核酸結(jié)合能力，可與Nsp14、Nsp16、UTR 結(jié)合，是RNA 合成的關(guān)鍵調(diào)控因子。Nsp10和Nsp14作用，增加NSP14的外切核糖核酸酶活性，避免病毒復(fù)制期間的錯(cuò)配；與Nsp16 1∶1結(jié)合，增強(qiáng)Nsp16的2'-O-甲基轉(zhuǎn)移酶活性，用于加帽。有研究推測(cè)，Nsp10可在病毒復(fù)制期間調(diào)節(jié)Nsp14外顯子活性[30-31]。Nsp11僅13個(gè)氨基酸，相關(guān)報(bào)道很少。Nsp12分子量約102 kDa，氨基酸序列保守，具有RdRp 活性。Nsp12 單獨(dú)作用僅具有較弱的RNA 聚合酶活性，但與Nsp7 或Nsp8 結(jié)合后，該活將明顯提高[22]。Nsp12 與Nsp13 協(xié)同可提高病毒復(fù)制效率，與Nsp14作用則可參與病毒復(fù)制保真過(guò)程[12]。

Nsp13具有核酸解旋酶活性，依靠pH值和金屬離子濃度發(fā)揮活性。氨基端aa1～aa77 區(qū)域?yàn)殇\指結(jié)構(gòu)域，其中14 個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基對(duì)Nsp13 的核酸解旋酶活性具有影響；aa279 到羧基端尾部為解旋酶結(jié)構(gòu)域[29]。Nsp14 分子量約為60 kDa，具有外切核酸酶活性和N7-甲基轉(zhuǎn)移酶活性[23]。外切核酸酶活性避免了病毒復(fù)制過(guò)程中的錯(cuò)配，保證病毒復(fù)制的保真性，為T(mén)GEV 遠(yuǎn)大于其他RNA 病毒的基因組長(zhǎng)度提供了條件。Nsp14 與Nsp10 作用，其外切核酸酶活性顯著增加。N7-甲基轉(zhuǎn)移酶對(duì)病毒進(jìn)行Cap 0 型加帽有利于病毒mRNA 的核轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯和穩(wěn)定性。兩種酶活性功能域在結(jié)構(gòu)上交錯(cuò)，但在功能表達(dá)上相互影響。Nsp14 外顯子對(duì)Nsp12 聚合酶起上位基因作用，參與病毒復(fù)制中的矯正過(guò)程。

Nsp15 彌漫分布在整個(gè)細(xì)胞質(zhì)中，不形成斑點(diǎn)[32]。Nsp15 具有尿苷特異性內(nèi)切核糖核酸酶活性，優(yōu)先切割3'尿嘧啶核苷酸，產(chǎn)生2'-3'環(huán)磷酸酯端。Nsp16 具有2'-O-甲基轉(zhuǎn)移酶活性，與Nsp10 相互作用可增強(qiáng)活性。2'-O-甲基轉(zhuǎn)移酶對(duì)自身RNA 進(jìn)行加帽，將Cap 0 甲基化為Cap 1，甲基化修飾會(huì)穩(wěn)定基因組RNA 的化學(xué)性質(zhì)并且偽裝RNA以進(jìn)行免疫逃避[12]。

2.3.2 ORF3

ORF3 由ORF3a 和ORF3b 組成，ORF3a 編碼蛋白質(zhì)含71 個(gè)氨基酸，ORF3b 編碼蛋白質(zhì)含有254 個(gè)氨基酸，ORF3b 序列較保守，編碼蛋白質(zhì)分子量約27.7 kDa，糖基化后形成分子量約31 kDa 的整合膜蛋白。與TGEV 進(jìn)行對(duì)比，TGEV變異株SP以及PRCV均在ORF3處有缺失，提示ORF3在病毒復(fù)制中非必需，但可能與病毒毒力相關(guān)[14]。

2.3.3 ORF7

ORF7 為α 屬冠狀病毒特有，編碼蛋白質(zhì)約含78 個(gè)氨基酸，為分子量約9.1 kDa的疏水蛋白，氨基端aa1～aa30區(qū)域?yàn)樾盘?hào)肽序列。ORF7蛋白表達(dá)定位于宿主細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在體外合成時(shí)與微粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等相關(guān)。ORF7 蛋白不直接參與病毒復(fù)制過(guò)程，但具有調(diào)控病毒復(fù)制的能力，ORF7 過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致宿主細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）程度降低，降低TGEV 的復(fù)制水平，而缺少ORF7 蛋白的TGEV毒力會(huì)增強(qiáng)[33]。

3 展望

豬傳染性胃腸炎暫無(wú)特效藥物，臨床中以免疫接種為主要防治手段，但由于TGEV 高突變率的特點(diǎn)，傳統(tǒng)疫苗的保護(hù)能力愈顯不足，基因工程疫苗和抗病毒藥物的開(kāi)發(fā)為現(xiàn)在的主要研究方向。

TGEV 既具有冠狀病毒的一部分共同特征，也有基于本屬的特點(diǎn)，病毒結(jié)構(gòu)蛋白、非結(jié)構(gòu)蛋白和附屬蛋白的結(jié)構(gòu)功能對(duì)病毒繁殖研究具有重大意義。結(jié)構(gòu)蛋白尤其是S蛋白與N蛋白是TGEV研究最多的結(jié)構(gòu)部分，參與宿主細(xì)胞的識(shí)別、誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體和病毒繁殖過(guò)程等，對(duì)分子診斷、疫苗研發(fā)和抗病毒藥物開(kāi)發(fā)等具有重大意義。非結(jié)構(gòu)蛋白參與轉(zhuǎn)錄翻譯，在指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成以及附屬基因的表達(dá)中起到重要作用；非編碼區(qū)調(diào)控病毒轉(zhuǎn)錄翻譯，在病毒復(fù)制過(guò)程中可能起到重要作用，但目前這方面研究主要集中于冠狀病毒β 屬，而α 屬的非結(jié)構(gòu)蛋白與非編碼區(qū)的研究相對(duì)較少。非結(jié)構(gòu)蛋白為抗病毒藥物的研發(fā)提供了多個(gè)重要靶點(diǎn)，是今后研究的重要方向。