林映雪 ，崔海鵬 ，王領(lǐng)弟 ，楊昌碩 ，莊朋偉 #（.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥學(xué)部，河北 承德 067000；.承德醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河北 承德 067000；.天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 009）

上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是上皮細(xì)胞失去極性，并轉(zhuǎn)化成間質(zhì)細(xì)胞表型的過(guò)程。EMT可破壞上皮屏障功能的完整性，誘發(fā)惡性腫瘤組織的上、下皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化成間質(zhì)細(xì)胞，使細(xì)胞間連接（緊密連接、黏附連接、橋粒/半橋粒等）解體，導(dǎo)致細(xì)胞表面的上皮標(biāo)志物[如E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、細(xì)胞角蛋白、緊密連接蛋白1（Zona occludens 1，ZO-1）等]表達(dá)水平逐漸降低，而間充質(zhì)標(biāo)志物[如N-鈣黏蛋白（Ncadherin）、波形蛋白（vimentin）、纖連蛋白等]表達(dá)水平升高，最終使腫瘤細(xì)胞具備轉(zhuǎn)移和侵襲能力[1—2]。因此，抑制腫瘤細(xì)胞EMT，改善上皮屏障功能，可能是治療腫瘤的有效靶點(diǎn)。

傳統(tǒng)中醫(yī)藥具有靶點(diǎn)多、副作用少的特點(diǎn)，近年來(lái)有關(guān)其在治療腫瘤方面的研究愈加深入。中醫(yī)認(rèn)為腫瘤發(fā)生的病因之一為“正氣內(nèi)虛”，正不抗邪，邪氣經(jīng)人體三焦、腠理等通道，四處侵染[3]，即出現(xiàn)腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲。玉屏風(fēng)散由黃芪、白術(shù)、防風(fēng)3味藥組成，是補(bǔ)氣固表的經(jīng)典方劑，目前其制劑有丸劑、顆粒劑、膠囊劑、口服液等多種劑型[4]。研究表明，玉屏風(fēng)散及其各組分可通過(guò)提高機(jī)體免疫功能、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、減緩腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移等起到防治腫瘤的作用[5]。但是關(guān)于玉屏風(fēng)散對(duì)腫瘤細(xì)胞EMT 及上皮屏障功能完整性影響的研究較少。鑒于此，本研究基于Lewis 荷瘤小鼠自發(fā)肺轉(zhuǎn)移模型，以玉屏風(fēng)顆粒為受試藥物，對(duì)上述問(wèn)題進(jìn)行探討，為進(jìn)一步研究玉屏風(fēng)散及其相關(guān)制劑防治腫瘤的機(jī)制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有Ⅸ53型倒置顯微鏡、Ⅸ71型顯微鏡圖像采集系統(tǒng)（日本Olympus 公司），CFX96 Touch型實(shí)時(shí)定量PCR儀、Amersham Imager 600型凝膠檢測(cè)成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2 主要藥品與試劑

玉屏風(fēng)顆粒（批號(hào)200213，規(guī)格5 g/袋）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)廣東環(huán)球制藥有限公司；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）（H+L）抗體（批號(hào)A0208、A0216）均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Carazzi 蘇木素染色液（批號(hào)G4510）、伊紅染色液（批號(hào)G1100）、免疫組化試劑盒（批號(hào)SA00011）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；兔源癌胚抗原檢測(cè)抗體（批號(hào)A12421）、兔源E-cadherin單克隆抗體（批號(hào)A3044）均購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司；兔源β-連環(huán)蛋白（β-catenin）多克隆抗體（批號(hào)51067-2-AP）、兔源vimentin多克隆抗體（批號(hào)10366-1AP）均購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；RNAprep pure動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒（批號(hào)DP431）、FastQuant cDNA 第一鏈合成試劑盒（批號(hào)KR106）、SuperReal PreMix SYBR Green qPCR檢測(cè)試劑盒（批號(hào)FP204）均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究所用動(dòng)物為SPF級(jí)雌性C57BL/6純系小鼠，共35只，體重（20±2） g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)為SCXK（京）2016-0006。小鼠飼養(yǎng)期間給予普通飼料和潔凈水。本研究所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均嚴(yán)格遵循動(dòng)物實(shí)驗(yàn)“3R”原則，嚴(yán)格按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查指南》（GB/T 35892-2018）執(zhí)行，并經(jīng)承德醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過(guò)后實(shí)施（倫理審查證號(hào)2019055）。

1.4 細(xì)胞株

LLC小鼠Lewis肺癌細(xì)胞株購(gòu)于上海諾百生物科技有限公司。

2 方法

2.1 肺癌細(xì)胞懸液的制備

將LLC細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)并傳代3次后，調(diào)整細(xì)胞密度為1×107個(gè)/mL，接種至5 只小鼠的右腋下，每只0.2 mL。接種第10天左右，待瘤體長(zhǎng)至約1 000 mm3時(shí)將小鼠脫頸處死。將生長(zhǎng)良好的肺癌組織經(jīng)勻漿、過(guò)濾、離心、稀釋后制成細(xì)胞密度為1×107個(gè)/mL 的肺癌細(xì)胞混懸液[6]。

2.2 動(dòng)物造模、分組及給藥

采用隨機(jī)數(shù)字表法將剩下30只小鼠分為正常組、模型組、玉屏風(fēng)顆粒組，每組10只。取“2.1”項(xiàng)下細(xì)胞懸液0.2 mL 接種于模型組和玉屏風(fēng)顆粒組小鼠的右腋皮下處，當(dāng)該處出現(xiàn)小結(jié)節(jié)并不斷增長(zhǎng)時(shí)，判定小鼠自發(fā)肺轉(zhuǎn)移模型制備成功[7]。

精密稱(chēng)取玉屏風(fēng)顆粒，以蒸餾水溶解，制成質(zhì)量濃度為4 g/mL的玉屏風(fēng)顆粒給藥液，每日現(xiàn)配現(xiàn)用。接種細(xì)胞懸液的第10天開(kāi)始灌胃給藥，正常組和模型組小鼠給予蒸餾水，玉屏風(fēng)顆粒組小鼠給予40 g/kg玉屏風(fēng)顆粒（根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇20倍臨床等效劑量為受試劑量），給藥體積均為0.01 mL/g。每天給藥1 次，連續(xù)15 d。

2.3 一般情況觀察

給藥后每天定時(shí)觀察小鼠的狀態(tài)，包括毛發(fā)色澤、飲食、排便、精神、活動(dòng)等。

2.4 肺組織腫瘤轉(zhuǎn)移灶計(jì)數(shù)及肺轉(zhuǎn)移抑制率計(jì)算

給藥結(jié)束后將小鼠脫頸處死，取出肺組織，經(jīng)生理鹽水漂洗后在顯微鏡下對(duì)肺組織腫瘤轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行計(jì)數(shù)。轉(zhuǎn)移灶為類(lèi)圓形小突起，呈結(jié)節(jié)狀或半透明點(diǎn)狀，部分轉(zhuǎn)移灶可能融合到一起。根據(jù)肺結(jié)節(jié)直徑將其分為4級(jí)：Ⅰ級(jí)＜0.5 mm；0.5 mm≤Ⅱ級(jí)≤1 mm；1 mm＜Ⅲ級(jí)≤2 mm；Ⅳ級(jí)＞2 mm[8]。計(jì)算肺表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)總數(shù)和肺轉(zhuǎn)移抑制率：肺表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)總數(shù)＝Ⅰ級(jí)結(jié)節(jié)數(shù)量×1+Ⅱ級(jí)結(jié)節(jié)數(shù)量×2+Ⅲ級(jí)結(jié)節(jié)數(shù)量×3+Ⅳ級(jí)結(jié)節(jié)數(shù)量×4；肺轉(zhuǎn)移抑制率（%）＝（模型組平均肺表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)－玉屏風(fēng)顆粒組平均肺表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)）/模型組平均肺表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)×100%。

2.5 肺組織腫瘤轉(zhuǎn)移灶觀察

取小鼠左肺組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定后，再經(jīng)梯度脫水、常規(guī)石蠟包埋、切片（5 μm）、蘇木素-伊紅（HE）染色，于顯微鏡下觀察肺組織腫瘤轉(zhuǎn)移灶。

2.6 肺組織癌胚抗原表達(dá)檢測(cè)

取“2.5”項(xiàng)下小鼠肺組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟、抗原修復(fù)、封閉后，滴加癌胚抗原一抗（稀釋比例1∶200），4 ℃孵育過(guò)夜；次日洗滌后，滴加HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG（H+L）二抗（稀釋比例1∶50），室溫孵育50 min；以DAB顯色，蘇木素染液復(fù)染細(xì)胞核，脫水封片，于顯微鏡下觀察肺組織中癌胚抗原的表達(dá)情況。每張切片在顯微鏡下選取3個(gè)視野，以棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)，采用Image J 軟件計(jì)算平均光密度值，平均光密度值越大表示癌胚抗原的表達(dá)水平越高。

2.7 肺組織中EMT相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè)

采用qRT-PCR 法進(jìn)行檢測(cè)。每組隨機(jī)選取5 只小鼠的肺組織，采用Trizol 法提取組織中總RNA，按FastQuant cDNA 第一鏈合成試劑盒操作將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后，按SuperReal PreMix SYBR Green qPCR 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性15 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火/延伸32 s，共40 個(gè)循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參，采用2－ΔΔCt法，以對(duì)照組為參照進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，計(jì)算EMT 相關(guān)基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平。PCR引物由筆者采用Primer 3.0軟件自行設(shè)計(jì)，經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)核查后，由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度見(jiàn)表1。

表1 引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度

2.8 肺組織中EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

采用Western blot 法進(jìn)行檢測(cè)。每組取3 只小鼠的肺組織，勻漿，提取總蛋白，按照BCA 試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行蛋白定量。取45 μg 變性后總蛋白，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)膜，以5%脫脂奶粉封閉；加入相應(yīng)一抗（E-cadherin稀釋比例1∶1 000、vimentin 稀釋比例1∶1 000、β-catenin 稀釋比例1∶1 000、β-actin 稀釋比例1∶5 000），4 ℃孵育過(guò)夜。次日將條帶洗滌后再加入相對(duì)應(yīng)的二抗（稀釋比例1∶10 000），25 ℃孵育1 h。孵育結(jié)束后，以TBST 緩沖液洗滌、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影，采用凝膠成像儀進(jìn)行檢測(cè)分析。采用Image Pro Plus 軟件進(jìn)行光密度分析，以EMT 相關(guān)蛋白條帶光密度值與內(nèi)參蛋白（β-actin）條帶光密度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Graphpad Prism 8軟件作圖。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 一般情況觀察結(jié)果

與正常組比較，模型組小鼠精神萎靡，活動(dòng)減少，毛發(fā)晦暗無(wú)光澤；與模型組比較，玉屏風(fēng)顆粒組小鼠精神狀態(tài)較好，毛發(fā)稍有光澤。

3.2 肺組織腫瘤轉(zhuǎn)移灶計(jì)數(shù)及肺轉(zhuǎn)移抑制率計(jì)算結(jié)果

與正常組比較，模型組、玉屏風(fēng)顆粒組小鼠肺組織中出現(xiàn)了腫瘤轉(zhuǎn)移灶；與模型組比較，玉屏風(fēng)顆粒組小鼠肺表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)總數(shù)顯著減少（P＜0.05），其肺轉(zhuǎn)移抑制率為46.52%。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠肺組織腫瘤轉(zhuǎn)移灶計(jì)數(shù)及肺轉(zhuǎn)移抑制率測(cè)定結(jié)果（±s，n＝10）

表2 各組小鼠肺組織腫瘤轉(zhuǎn)移灶計(jì)數(shù)及肺轉(zhuǎn)移抑制率測(cè)定結(jié)果（±s，n＝10）

a：與模型組比較，P＜0.05。

組別正常組模型組玉屏風(fēng)顆粒組肺表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)總數(shù)/個(gè)－1.87±0.95 1.00±0.00a肺轉(zhuǎn)移抑制率/%－－46.52

3.3 肺組織腫瘤轉(zhuǎn)移灶HE染色結(jié)果

與正常組比較，模型組小鼠左肺組織出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移灶，與鄰近組織有明顯的分界；與模型組比較，玉屏風(fēng)顆粒組小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移灶變小，組織大體形態(tài)有所恢復(fù)。HE染色結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠肺組織腫瘤轉(zhuǎn)移灶HE染色顯微圖

3.4 肺組織癌胚抗原表達(dá)檢測(cè)結(jié)果

與正常組（平均光密度值為52.17±7.00）比較，模型組小鼠肺組織癌胚抗原的表達(dá)（平均光密度值為258.40±15.65）顯著增強(qiáng)（P＜0.05），且呈散在性分布；與模型組比較，玉屏風(fēng)顆粒組小鼠肺組織癌胚抗原的表達(dá)（平均光密度值為50.48±7.03）顯著減弱（P＜0.05）。免疫組化染色結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 各組小鼠肺組織癌胚抗原表達(dá)檢測(cè)的免疫組化圖

3.5 肺組織中EMT相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果

與正常組比較，模型組小鼠肺組織中E-cadherin mRNA 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），vimentin、β-catenin mRNA表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，玉屏風(fēng)顆粒組小鼠肺組織中E-cadherin mRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），vimentin、β-catenin mRNA 表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠肺組織中EMT 相關(guān)基因mRNA 的表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果（±s，n＝5）

表3 各組小鼠肺組織中EMT 相關(guān)基因mRNA 的表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果（±s，n＝5）

a：與正常組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05。

組別正常組模型組玉屏風(fēng)顆粒組β-catenin/GAPDH 1.00±0.00 1.70±0.20a 0.75±0.07b E-cadherin/GAPDH 1.00±0.00 0.45±0.12a 0.70±0.03b vimentin/GAPDH 1.00±0.00 1.67±0.13a 1.09±0.04b

3.6 肺組織中EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果

與正常組比較，模型組小鼠肺組織中E-cadherin 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），vimentin、β-catenin蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，玉屏風(fēng)顆粒組小鼠肺組織中E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），vimentin、β-catenin蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表4、圖3。

圖3 各組小鼠肺組織中EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的電泳圖

表4 各組小鼠肺組織中EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果（±s，n＝3）

表4 各組小鼠肺組織中EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果（±s，n＝3）

a：與正常組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05。

組別正常組模型組玉屏風(fēng)顆粒組β-catenin/β-actin 0.76±0.03 1.27±0.06a 0.44±0.03b E-cadherin/β-actin 1.02±0.03 0.67±0.02a 0.88±0.02b vimentin/β-actin 0.46±0.01 0.74±0.03a 0.17±0.01b

4 討論

惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展不僅與腫瘤細(xì)胞的快速增殖有關(guān)，還與腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲密切相關(guān)，而腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲又是一個(gè)復(fù)雜的、多步驟的過(guò)程[8]。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為“正氣虛弱，腠理不密”是腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的重要條件。在病理狀態(tài)下，正氣虧虛，癌毒可以由經(jīng)絡(luò)、三焦、腠理等通道進(jìn)行轉(zhuǎn)移[3]。上皮屏障是由上皮細(xì)胞間連接及細(xì)胞間的黏附物構(gòu)成的一種物理及生物學(xué)功能性屏障，是機(jī)體對(duì)抗環(huán)境因素的主要防御系統(tǒng)[9]。而上皮屏障功能的完整性與腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移能力密切相關(guān)[10]。因此，筆者認(rèn)為上皮屏障功能異?？赡苁恰半砝聿幻堋钡慕M織病理學(xué)基礎(chǔ)。

EMT與上皮屏障功能密切相關(guān)，其過(guò)程受到眾多參與維持上皮特性的細(xì)胞黏附分子的調(diào)節(jié)。EMT 在腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，是腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移的初始步驟[11]。EMT的重要分子特征是上皮細(xì)胞膜表面的E-cadherin等上皮標(biāo)志物被vimentin等間充質(zhì)標(biāo)志物取代，形成間充質(zhì)結(jié)構(gòu)，使腫瘤細(xì)胞游離并突破基底膜從而進(jìn)行遷移和侵襲[12]。E-cadherin 作為一類(lèi)單通道跨膜蛋白，其胞外結(jié)構(gòu)域能夠介導(dǎo)相鄰細(xì)胞間產(chǎn)生親和作用，即黏附連接，有助于維持屏障功能的完整性[13]。當(dāng)E-cadherin 表達(dá)下降時(shí)，同表型細(xì)胞-細(xì)胞間黏附和連接被破壞，這一過(guò)程被認(rèn)為是細(xì)胞脫離原發(fā)腫瘤侵入周?chē)M織，并遷移到遠(yuǎn)端的作用基礎(chǔ)[14]。vimentin也是EMT的重要標(biāo)志物，其會(huì)使上皮細(xì)胞失去極性、黏附力減弱，從而破壞細(xì)胞的緊密連接結(jié)構(gòu)，促進(jìn)細(xì)胞遷移，故其在癌組織中過(guò)表達(dá)會(huì)驅(qū)動(dòng)EMT的發(fā)生[15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，玉屏風(fēng)顆?？娠@著抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，使肺組織形態(tài)有所恢復(fù)，減少肺組織癌胚抗原的表達(dá)。同時(shí)，經(jīng)玉屏風(fēng)顆粒干預(yù)后，EMT相關(guān)因子E-cadherin的表達(dá)顯著下調(diào)，提示玉屏風(fēng)顆?？梢种颇Ｐ托∈蟮腅MT，修復(fù)上皮細(xì)胞屏障功能。

β-catenin 是一類(lèi)重要的黏附分子[16]，可介導(dǎo)鈣黏蛋白黏附受體與細(xì)胞骨架連接。正常情況下，E-cadherin與β-catenin 結(jié)合，形成E-cadherin/β-catenin 復(fù)合物以穩(wěn)定細(xì)胞間的聯(lián)系[13]。而當(dāng)機(jī)體受刺激時(shí)，E-cadherin 黏著度降低，β-catenin 從細(xì)胞膜上脫落下來(lái)，激活下游靶基因，導(dǎo)致EMT 產(chǎn)生[17]。本研究結(jié)果顯示，玉屏風(fēng)顆?？墒鼓Ｐ徒M小鼠肺組織中β-catenin的表達(dá)顯著下調(diào)，提示玉屏風(fēng)顆粒可能是通過(guò)降低β-catenin 的表達(dá)抑制模型小鼠的EMT。

綜上所述，玉屏風(fēng)顆粒可能是通過(guò)減少β-catenin的表達(dá)抑制EMT的發(fā)生，從而改善小鼠的上皮屏障功能，進(jìn)而降低腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的能力，發(fā)揮抑制腫瘤的作用。本研究從形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)角度初步證實(shí)了玉屏風(fēng)顆粒對(duì)EMT 的調(diào)控作用，為探尋腫瘤轉(zhuǎn)移的預(yù)防策略提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，同時(shí)也為進(jìn)一步闡明玉屏風(fēng)散及其相關(guān)制劑治療腫瘤的機(jī)制提供了參考。