陳春國(guó),陳櫞,楊松,倪陳婷,張一心,倪啟超

近些年,大量研究揭示多種基因、信號(hào)轉(zhuǎn)錄分子表達(dá)水平的變化及機(jī)體內(nèi)調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)活動(dòng)相關(guān)信號(hào)通路異常的活性狀態(tài)與乳腺癌的生物機(jī)制有著密切的聯(lián)系,但是正常乳腺細(xì)胞如何發(fā)生突變導(dǎo)致無序生長(zhǎng),其具體作用機(jī)制尚未可知。國(guó)內(nèi)外大量研究顯示,Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路異常激活參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程[1]。散亂蛋白2(dishevelled 2,DVL2)是細(xì)胞內(nèi)Wnt信號(hào)通路中的重要組分之一,也是人類D基因家族的重要成員之一,其通過抑制胞質(zhì)內(nèi)β-catenin泛素化降解,致使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)游離β-catenin不斷蓄積,通過與Tcf/Lef形成復(fù)合物而進(jìn)入細(xì)胞核,誘導(dǎo)下游等腫瘤相關(guān)基因的表達(dá),參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[2]。Yes相關(guān)蛋白1(YAP1)信號(hào)通路是一類調(diào)控哺乳動(dòng)物組織器官生長(zhǎng)發(fā)育的重要信號(hào)通路,其調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。Hippo信號(hào)通路與Wnt/β-catenin信號(hào)通路之間存在耦聯(lián)關(guān)系,Wnt/β-catenin信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)MST 1/2激酶的活性,而MST 1/2激酶則是Hippo-YAP信號(hào)通路中重要的組成部分[3-4];有實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,DVL2與YAP/TAZ存在相互作用,Hippo信號(hào)中的YAP/TAZ能抑制Wnt3a誘導(dǎo)Wnt信號(hào)通路對(duì)DVL2磷酸化調(diào)節(jié)作用,間接調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路中細(xì)胞信號(hào)的傳遞[5]。上述研究提示W(wǎng)nt及Hippo信號(hào)通路間存在耦聯(lián)作用可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān),但鮮有研究探討DVL2、YAP1在乳腺癌中的相關(guān)性。本研究檢測(cè)乳腺癌中DVL2、YAP1的表達(dá)水平,分析DVL2、YAP1與乳腺癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系,探討DVL2、YAP1在乳腺癌診斷及治療中的潛在價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 利用數(shù)據(jù)庫分析YAP1、DVL2蛋白在乳腺癌中的表達(dá)情況 利用臨床蛋白質(zhì)組腫瘤分析協(xié)作組(Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium, CPTAC) (http://ualcan.path.uab.edu/analysis-prot.html)數(shù)據(jù)庫分析DVL2、YAP1蛋白在不同類型乳腺癌中的表達(dá)差異。利用GEPIA2數(shù)據(jù)庫(http://gepia2.cancer-pku.cn/#correlation)分析YAP1、DVL2在乳腺癌組織中的表達(dá)相關(guān)性。

1.2 臨床資料 收集2008年1月至2010年6月在南通市腫瘤醫(yī)院住院的乳腺癌患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn):①病理確診為L(zhǎng)uminal型浸潤(rùn)性乳腺癌,術(shù)后免疫組化證實(shí)為浸潤(rùn)性乳腺癌(ⅠB～ⅢA期)的女性患者;②術(shù)前未接受化療、放療、免疫治療等其他抗腫瘤治療措施;③手術(shù)切除范圍為乳腺癌改良根治術(shù)切除范圍;④術(shù)后按照乳腺癌相關(guān)診療指南[6]行常規(guī)治療。最終有202例乳腺癌患者納入本研究,年齡34～81(59.8±12.5)歲,平均無瘤生存時(shí)間(57.7±26.2)個(gè)月。收集患者的雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、人表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER)及Ki-67增殖指數(shù)水平。

1.3 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)DVL2、YAP1表達(dá)情況 將手術(shù)切除的標(biāo)本經(jīng)甲醛溶液固定后,石蠟包埋,5 mm連續(xù)切片脫蠟,PBS洗3 min,洗2次;滴加一抗,室溫2 h,PBS洗3 min,洗2次;滴加二抗,室溫20～30 ℃,PBS洗3 min,洗2次;DAB顯色后復(fù)染,分化水洗,脫水封片,高倍鏡下觀察染色結(jié)果。采用PBS緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照,已知陽性片作陽性對(duì)照。兔抗人DVL2多克隆抗體(貨號(hào):ab137528)及兔抗人活化的YAP1(非磷酸化)多克隆抗體(貨號(hào):ab205270)均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。以細(xì)胞質(zhì)中有棕褐色顆粒染色判為陽性。判斷標(biāo)準(zhǔn):①不著色:陰性,0分;②淡黃色:弱陽性,1分;③棕黃色:陽性,2分;④深棕黃色:強(qiáng)陽性,3分。敏感性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn):2～3分視為陽性;0～1分視為陰性[7]。

1.4 Real-Time PCR檢測(cè)YAP1、DVL2表達(dá)水平 提取乳腺癌及癌旁石蠟組織的RNA:將蠟塊組織切成6～8 μm切片,置于1.5 mL離心管中,加入1.0 mL二甲苯,混勻,離心2 min。取上清液,加入1.0 mL無水乙醇,混勻,離心2 min,取上清液。加入150 μL Buffer PKD,重懸沉淀。加入10 μL蛋白酶K,混勻。56 ℃孵育15 min,20 000轉(zhuǎn)離心15 min。取上清液至1.5 mL離心管中。提取方法參照文獻(xiàn)[8]。Real-Time PCR試劑盒(貨號(hào):04887352001)購(gòu)自美國(guó)Roche公司。引物購(gòu)自上海生工公司,見表1。構(gòu)建20 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系,混勻后37 ℃溫浴5 min。42 ℃溫浴60 min,70 ℃溫浴10 min,終止反應(yīng)。構(gòu)建20 μL PCR反應(yīng)體系,擴(kuò)增條件:94 ℃ 10 min,(94 ℃ 20 s,55 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s)40個(gè)循環(huán)。用ABI 7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行分析。根據(jù)陰性對(duì)照調(diào)整閾值和基線,以確定各個(gè)標(biāo)本的Ct值,并根據(jù)熔解曲線確定該Ct值是否有效。ΔCt(目的基因)=Ct(癌)-Ct(內(nèi)參),ΔCt(癌旁)=Ct(癌旁)-Ct(內(nèi)參),ΔΔCt=ΔCt(癌)-ΔCt(癌旁)。采用2-ΔΔCt法確定YAP1、DVL2表達(dá)水平,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)源性對(duì)照。以癌旁組織作為對(duì)照組進(jìn)行定性分析:若癌中表達(dá)量>癌旁,則為陽性;癌中表達(dá)量≤癌旁,則為陰性。

表1 所用引物序列

表2 DVL2、YAP1表達(dá)水平與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系

1.5 乳腺癌患者術(shù)后隨訪 自治療后起0～2年:每間隔2個(gè)月行?？葡到y(tǒng)檢查1次;3～5年:每間隔5個(gè)月行專科系統(tǒng)檢查1次。專科系統(tǒng)檢查項(xiàng)目包括?？企w格檢查、血液腫瘤標(biāo)志物、超聲及CT等影像學(xué)檢查。無復(fù)發(fā)生存期(recurrence-free survival, RFS):手術(shù)后至首次發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移(病理或影像學(xué)結(jié)果提示遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移)的時(shí)間。隨訪截至2020年12月31日,患者最長(zhǎng)隨訪時(shí)間126個(gè)月。

2 結(jié)果

2.1 YAP1、DVL2蛋白在Luminal型乳腺癌組織中的表達(dá)情況 經(jīng)CPTAC數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn),DVL2蛋白在Luminal型浸潤(rùn)性乳腺癌組織中高表達(dá),YAP1蛋白在乳腺癌組織中低表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。本研究選擇樣本量較多的Luminal型浸潤(rùn)性乳腺癌作為研究對(duì)象。

圖1 DVL2(1A)及YAP1(1B)在不同分子分型乳腺癌中的表達(dá)水平比較

2.2 YAP1、DVL2在乳腺癌組織中的表達(dá)相關(guān)性 以GAPDH為內(nèi)參基因,通過GEPIA2數(shù)據(jù)庫采用Spearman法分析發(fā)現(xiàn),YAP1與DVL2呈正相關(guān)(R=0.7,P<0.001,圖2)。

圖2 YAP1、DVL2在乳腺癌組織中的表達(dá)相關(guān)性

2.3 YAP1和DVL2的免疫組化結(jié)果 YAP1和DVL2均定位于細(xì)胞質(zhì)中,呈深褐色染色(圖3)。

圖3 DVL2和YAP1在乳腺癌組織中表達(dá)(免疫組化法,×100)

2.4 DVL2和YAP1表達(dá)水平與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系 DVL2與乳腺癌患者的TNM分期、有無神經(jīng)侵犯及癌栓有關(guān),YAP1與腋窩淋巴結(jié)、TNM分期、有無神經(jīng)侵犯及癌栓有關(guān),DVL2與YAP1的高表達(dá)和低表達(dá)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

2.5 DVL2與YAP1 mRNA在Luminal型浸潤(rùn)性乳腺癌組織中表達(dá)的相關(guān)性 DVL2與YAP1 mRNA在Luminal型浸潤(rùn)性乳腺癌組織中的表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.617,P<0.001)。乳腺癌組織中YAP1和DVL2的表達(dá)水平均高于癌旁組織(P<0.001,圖4)。

圖4 YAP1與DVL2 mRNA在Luminal型乳腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá) 4A:YAP1與DVL2 mRNA在Luminal型乳腺癌組織中表達(dá)的相關(guān)性;4B:YAP1基因在Luminal型乳腺癌組織中的表達(dá)水平差異;4C: DVL2基因在Luminal型乳腺癌組織中的表達(dá)水平差異

2.6 DVL2和YAP1表達(dá)水平與乳腺癌患者無瘤生存時(shí)間的關(guān)系 單因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn),年齡、腫瘤直徑、TNM分期、脈管癌栓、神經(jīng)侵犯對(duì)RFS無影響,而腋窩淋巴結(jié)、Luminal分型、HER2、Ki-67、DVL2、YAP1表達(dá)水平與RFS有關(guān),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。多因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn),Luminal分型、HER2陽性、Ki-67、DVL2和YAP1表達(dá)水平為乳腺癌患者無瘤生存時(shí)間的獨(dú)立影響因素(表3)。Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn):DVL2高表達(dá)組患者RFS低于低表達(dá)組(圖5A),而YAP1則相反(圖5B)。

圖5 YAP1(5A)、DVL2(5B)表達(dá)水平對(duì)Luminal型乳腺癌患者無復(fù)發(fā)生存時(shí)間的影響

根據(jù)YAP1和DVL2表達(dá)水平將本組202例患者分為4個(gè)組,即DVL2(+)/YAP1(+)組(47例),DVL2(-)/YAP1(+)組(56例),DVL2(+)/YAP1(-)組(76例),YAP1(-)/DVL2(-)組(23例),結(jié)果顯示:DVL2(-)YAP1(+)組中Luminal乳腺癌患者的RFS高于其他3組,而DVL2(+)YAP1(-)組中Luminal乳腺癌患者預(yù)后最差(圖6A)。兩種不同分子分型中,DVL2(+)YAP1(-)組中Luminal乳腺癌患者預(yù)后最差(P<0.05),DVL2(+)YAP1(+)患者預(yù)后優(yōu)于DVL2(+)YAP(-)患者(P<0.05,圖6B、6C)。

圖6 不同亞型Luminal型乳腺癌患者的生存曲線 6A:Luminal 型乳腺癌患者不同亞型中無瘤生存時(shí)間;6B:Luminal A型乳腺癌患者不同亞型中無瘤生存時(shí)間;6C:Luminal B型乳腺癌患者不同亞型中無瘤生存時(shí)間

3 討論

流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示,我國(guó)乳腺癌的發(fā)病率約為29/10萬,且每年以3%～5%的遞增速度逐年上升,目前其發(fā)病率已經(jīng)上升到女性惡性腫瘤的第2位;2021年底,我國(guó)乳腺癌患者人數(shù)將突破220萬[9-10]。

DVL2作為人類DVL家族成員重要成員之一,是Wnt信號(hào)通路中的核心組成部分,通過抑制絲/蘇氨酸激酶的活性,減少β-catenin泛素化降解的生物學(xué)過程,最終導(dǎo)致游離β-catenin在胞漿內(nèi)蓄積,促進(jìn)游離的β-catenin與Tcf/Lef原件相結(jié)合而進(jìn)入細(xì)胞核,進(jìn)而調(diào)控Wnt信號(hào)通路核內(nèi)部分,誘導(dǎo)下游細(xì)胞周期蛋白-D1、C-myc等腫瘤相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)[11]。研究表明DVL2在食管癌[12]、胃癌[13]、鼻咽癌[14]等腫瘤模型中表達(dá)異常。在原發(fā)性肝癌中,DVL2在腫瘤組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織,并與肝癌的不良預(yù)后密切相關(guān)[15]。另有研究顯示,在乳腺癌細(xì)胞模型中,DVL2是乳腺癌細(xì)胞遷移所必需的信號(hào)通路關(guān)鍵位點(diǎn),通過抑制DVL2的磷酸化可明顯減少乳腺癌細(xì)胞的遷移活動(dòng)[16-17]。

Hippo信號(hào)通路在哺乳動(dòng)物的組織器官生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)方面有著重要作用,其介導(dǎo)的磷酸化作用可以激活Hippo信號(hào)通路的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子YAP蛋白,磷酸化狀態(tài)的YAP蛋白能夠進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮作用,維持細(xì)胞的分化增殖與細(xì)胞凋亡的相對(duì)平衡,調(diào)節(jié)組織器官的生長(zhǎng)發(fā)育,維持組織器官的穩(wěn)態(tài)。YAP1作為YAP家族中的一員,其異常表達(dá)參與腫瘤的形成過程[18]。有研究在非小細(xì)胞肺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、肝細(xì)胞肝癌等多種腫瘤模型中均發(fā)現(xiàn)異常表達(dá)的YAP1蛋白[19-21]。YAP1的作用機(jī)制目前尚不明確,在某些腫瘤模型中,YAP1表現(xiàn)出癌基因的特性,而在另一些腫瘤模型中則表現(xiàn)出抑癌基因的作用。Yuan等[22]在2008年首次報(bào)道了YAP1在乳腺癌中作為腫瘤抑制因子存在,其乳腺癌中的表達(dá)降低,影響腫瘤的信號(hào)通路。而Muhammad等[23]研究發(fā)現(xiàn),YAP1與雌二醇(E2)呈正相關(guān),在激素依賴的乳腺癌模型中YAP1 mRNA高表達(dá),通過下調(diào)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3B,降低其啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平,加速乳腺癌細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化,促進(jìn)細(xì)胞的自噬、抑制凋亡并誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的無限增殖。本研究顯示,YAP1高表達(dá)的乳腺癌患者無瘤生存時(shí)間高于YAP1低表達(dá)患者,而且合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管癌栓及神經(jīng)浸潤(rùn)的乳腺癌患者YAP1的陽性表達(dá)率不高,提示YAP1發(fā)揮著類似抑癌基因的作用。

有研究發(fā)現(xiàn),YAP/TAZ既可以在細(xì)胞核中作為Wnt信號(hào)的轉(zhuǎn)錄介質(zhì),也可以在細(xì)胞質(zhì)中作為Wnt/β-catenin的抑制劑[24]。在細(xì)胞質(zhì)中,YAP/TAZ通過與β-catenin或DVL的相互作用調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路,YAP/TAZ既能抑制β-catenin入核,又能被DVL2抑制YAP/TAZ磷酸化[25-26]。在肝癌[24]、胃腸道組織腫瘤[3,27]、乳腺癌[28]中,可見Hippo/Wnt/β-catenin相互作用。有研究發(fā)現(xiàn),Wnt/β-catenin的表達(dá)下調(diào)可上調(diào)間充質(zhì)樣三陰性乳腺癌細(xì)胞中YAP靶基因的表達(dá)[28]。而DVL2通過抑制胞質(zhì)內(nèi)β-catenin泛素化降解,胞漿內(nèi)游離β-catenin不斷蓄積,抑制YAP相關(guān)靶基因的表達(dá)[29]。加拿大學(xué)者通過免疫共沉淀發(fā)現(xiàn),相對(duì)于DVL的其他同源異構(gòu)體,YAP1/TAZ偏好于DVL2[27]。有研究通過轉(zhuǎn)基因小鼠研究腸干細(xì)胞發(fā)現(xiàn)YAP1也與DVL2相互作用,在細(xì)胞質(zhì)中YAP1和TAZ結(jié)合DVL,DVL2作為Wnt信號(hào)通路中的的關(guān)鍵調(diào)控因子,高表達(dá)抑制YAP1/TAZ活性,YAP1敲除導(dǎo)致DLD1細(xì)胞中DVL2堆積,在YAP缺失的情況下,DVL2和DVL3部分或完全恢復(fù)Wnt靶基因功能,提示YAP1具有阻斷DVL2誘導(dǎo)Wnt信號(hào)的能力,該研究還發(fā)現(xiàn)YAP1在人類結(jié)直腸癌中發(fā)揮腫瘤抑制作用[29]。

本研究通過分析網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),DVL2與YAP1密切相關(guān),DVL2在乳腺癌腫瘤組織中表達(dá)明顯高于癌旁正常組織,DVL2高表達(dá)的乳腺癌患者無瘤生存時(shí)間明顯縮短,可能與DVL2激活Wnt信號(hào)通路有關(guān),提示DVL2參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程,并可能是影響患者預(yù)后的因素之一。本研究還發(fā)現(xiàn),乳腺癌腫瘤分期越晚,DVL2表達(dá)水平越高,且伴有脈管浸潤(rùn),神經(jīng)浸潤(rùn)患者的DVL2陽性率升高,預(yù)后不理想,提示DVL2表達(dá)水平可用于評(píng)估乳腺癌患者的治療效果及臨床預(yù)后。本研究還發(fā)現(xiàn)乳腺癌中YAP1 mRNA與DVL2 mRNA的表達(dá)呈正相關(guān),與GEPIA2數(shù)據(jù)庫的預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致,但是蛋白表達(dá)水平卻相反,說明蛋白表達(dá)受到了抑制。目前的理論普遍認(rèn)為限制YAP的轉(zhuǎn)錄活性是Hippo通路抑制腫瘤生長(zhǎng)的主要機(jī)制,目前的治療努力旨在降低許多惡性腫瘤中的YAP蛋白水平,包括結(jié)腸癌[29]、肝癌[24]。但哈佛學(xué)者通過轉(zhuǎn)基因和基因敲除小鼠及臨床研究發(fā)現(xiàn),YAP1可能在人類結(jié)直腸癌中發(fā)揮腫瘤抑制作用,過度抑制YAP1可能會(huì)導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)增加,YAP1的靶向治療應(yīng)以破壞YAP/TEAD的相互作用或誘導(dǎo)YAP的細(xì)胞質(zhì)易位為目標(biāo)[29]。

國(guó)外有研究顯示,當(dāng)Hippo信號(hào)通路處于失活或靜息狀態(tài)時(shí),YAP/TAZ能夠與核-環(huán)蛋白結(jié)合形成復(fù)合物,級(jí)聯(lián)放大Wnt信號(hào)通路中的細(xì)胞增殖信號(hào)的傳遞,抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)組織器官的生長(zhǎng)發(fā)育[30]。另一方面,在生物體內(nèi)缺乏Wnt蛋白的情況下,YAP/TAZ蛋白也可以募集β-TrCP,對(duì)Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路起到負(fù)性調(diào)控作用,使Wnt信號(hào)通路維持在靜息狀態(tài);一旦體內(nèi)存在的Wnt信號(hào)蛋白激活Wnt信號(hào)通路時(shí),YAP/TAZ從YAP/TAZ/β-TrCP結(jié)構(gòu)復(fù)合物中解離,參與Wnt信號(hào)通路誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖信號(hào)傳導(dǎo)過程[31],提示W(wǎng)nt信號(hào)通路與Hippo信號(hào)通路間可能存在交叉作用。本研究發(fā)現(xiàn)DVL2和YAP1在乳腺癌組織中高表達(dá),但YAP1在臨床表現(xiàn)中卻表現(xiàn)出類似于抑癌基因的作用,該現(xiàn)象與國(guó)外學(xué)者研究的基本一致[24,29],可能與Wnt信號(hào)通路、Hippo信號(hào)通路之間潛在的相互作用有關(guān),具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

綜上所述,YAP1和DVL2的異常表達(dá)在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用,與乳腺癌的臨床預(yù)后相關(guān)。本研究為單中心研究,雖樣本量不大,但已為YAP1和DVL2的聯(lián)合檢測(cè)提供了有益的探索并得到初步結(jié)果;其在乳腺癌中的臨床價(jià)值有待大樣本量、多中心的研究進(jìn)一步驗(yàn)證,YAP1與DVL2在乳腺癌中的具體作用機(jī)制及潛在的交叉作用有待在轉(zhuǎn)基因分子水平層面進(jìn)一步探討。