李晶 謝開澤 張超 謝昌平

關(guān)鍵詞：檳榔；葉斑?。恍聰M盤多毛孢；鑒定；生物學(xué)特性

檳榔（ArecacatechuLinnaeus）是棕櫚科、檳榔屬的多年生常綠喬木。它含有豐富的藥理功能，對(duì)人體的多種系統(tǒng)具有一定調(diào)理作用，與益智仁、砂仁和巴戟天統(tǒng)稱為中國(guó)四大南藥，且檳榔居于首位。檳榔是濕熱型陽(yáng)性植物，喜高溫、多雨，原產(chǎn)于熱帶太平洋地區(qū)和東南亞地區(qū)。2020年海南省的檳榔種植面積約12.47萬(wàn)hm2[1]。近年來，隨著檳榔種植面積的逐漸擴(kuò)大，檳榔的病害發(fā)生率也越來越高，嚴(yán)重影響檳榔的生長(zhǎng)，制約著檳榔產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

目前，國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的檳榔葉片上的病害有Colletotrichumgloeosporioides、C.cordylinicola、C.fructicola、C.siamense、C.tropicale、C.arecicola和C.karstii引起的炭疽病[2-5]、由Capnodiumsp.、Meliolacamelliae和Acroconidiellaarecae引起的煤煙病[6-7]、由Phomopsispalmicolaf.arecae、Macrophomasp.、Phyllosticaaecae、Pestalotiapalmarum、Diaporthelimonicola和Curvulariapseudobrachyspora引起的葉斑病[8]、由Corynesporaelaeidicola和Cercosporaarecacearum引起的褐斑病[9]，由Cuignardiaarecae引起的灰斑病[5]，由Cephaleurosvirescens引起的藻斑病[10]，由Xanthomonascampestrispv.arecae引起的細(xì)菌性條斑病[11]，由Burkholderiaandropogonis引起的細(xì)菌性葉斑病[12]等。

在海南省儋州市檳榔種植基地病害調(diào)查中發(fā)現(xiàn)一種為害檳榔葉片的葉斑病，該病害發(fā)生初期葉片上產(chǎn)生黑褐色小病斑，發(fā)病后病斑中央白褐色，病斑上散生眾多黑色小點(diǎn)，最終葉片干枯、倒垂，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致葉片枯死，影響植株的光合作用，嚴(yán)重影響檳榔的產(chǎn)量和質(zhì)量。因此，本研究結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和多基因聯(lián)合建樹分析對(duì)該病原菌進(jìn)行鑒定，并系統(tǒng)研究該病原菌的生物學(xué)特性，為檳榔葉斑病的準(zhǔn)確診斷及田間防控措施的制定提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病株采集2021年3月，在海南省儋州市那大鎮(zhèn)大星大隊(duì)農(nóng)場(chǎng)檳榔種植基地（109°4567.02N，19°6077.54E）采集具有典型癥狀的病葉，并對(duì)檳榔發(fā)病植株的癥狀進(jìn)行描述和拍攝。

1.1.2主要試劑DNA快速抽提試劑盒（OMEGABIO-TEK）、DNA片段回收試劑盒、Taq酶、DNAMarker和通用引物[13]（表1）。參照《植病研究方法》和《植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》[14]制備試驗(yàn)所需培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)（PDA）、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)（PSA）、麥芽浸膏培養(yǎng)基（MEA）、胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基（CA）、察氏培養(yǎng)基（Czapek）、大豆瓊脂培養(yǎng)基（SGA）、玉米粉培養(yǎng)基（CMA）和水瓊脂培養(yǎng)基（WA）8種培養(yǎng)基（表2）。

1.2方法

1.2.1菌株的分離與純化采用組織分離法對(duì)采集的病害標(biāo)本進(jìn)行菌株分離。用自來水將具有典型癥狀的發(fā)病葉片清洗干凈，于病健交界處剪取5mm×5mm的組織塊，先用75%酒精消毒30s，再用2%NaClO消毒1min，最后用無菌水沖洗30s（重復(fù)3次），晾干，置于PDA培養(yǎng)基上，28℃光照培養(yǎng)，待菌落產(chǎn)孢后，制備孢子懸浮液，挑取單孢獲得純化菌株，純化后的菌株轉(zhuǎn)入PDA斜面試管，于4℃保存，備用。

1.2.2致病性測(cè)定用無菌接種針刺傷和無傷在健康檳榔葉片進(jìn)行致病性測(cè)定。分離菌株在PDA培養(yǎng)基上28℃、24h光照培養(yǎng)7d后，將直徑為5mm的菌餅接種到刺傷的檳榔葉片上，以直徑為5mm的無菌瓊脂塊作為對(duì)照，表面覆蓋吸水的滅菌紙，保濕培養(yǎng)7d，每個(gè)處理3片葉，3次重復(fù)。

觀察并記錄發(fā)病情況，待葉片發(fā)病，再次對(duì)發(fā)病部位進(jìn)行菌株分離純化和鑒定[15]。

1.2.3病原菌形態(tài)學(xué)鑒定將純化后的菌株轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上，于28℃培養(yǎng)7d，觀察記錄菌落的形態(tài)、顏色、大小及氣生菌絲發(fā)達(dá)程度。待菌落產(chǎn)孢后，顯微鏡下觀察分生孢子的形態(tài)特征，測(cè)量記錄分生孢子的長(zhǎng)寬、有色胞的長(zhǎng)度、各個(gè)分隔細(xì)胞長(zhǎng)度、頂端附屬絲的數(shù)量以及頂端附屬絲和基部附屬絲長(zhǎng)度。

1.2.4病原菌分子生物學(xué)鑒定將分離純化的菌株置于28℃、24h光照培養(yǎng)7d，刮取氣生菌絲100mg，按照真菌基因組DNA快速抽提試劑盒（OMEGABIO-TEK）說明書提取菌株DNA，選擇通用引物[13]（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，產(chǎn)物經(jīng)純化后委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成測(cè)序[16]，將所得序列在NCBI網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，并提交序列至GenBank。下載GenBank中已報(bào)道的其他相關(guān)病原菌序列，以ITS-TUB-TEF順序用SequenceMatrix程序?qū)π蛄羞M(jìn)行首尾拼接，并通過MEGA7.0軟件采用Maximumlikelihood法以NeopestalotiopsisclavisporaBRIP70210作為外群，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5生物學(xué)特性分析（1）培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響。將直徑為5mm的菌餅接種于上述8種培養(yǎng)基平板上，于28℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，每個(gè)處理3次重復(fù)。5d后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

（2）溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)和分生孢子萌發(fā)的影響。①菌絲生長(zhǎng)。將直徑為5mm的菌餅接種于PDA平板上，分別置于10、15、20、25、28、30、32、35℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，每個(gè)處理3次重復(fù)。5d后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。②分生孢子萌發(fā)。采用懸滴法，將分生孢子制成濃度為1×105個(gè)/mL的孢子懸浮液，滴于涂有PDA培養(yǎng)基的載玻片上，分別置于10、15、20、25、28、30、32、35℃培養(yǎng)箱，保濕黑暗培養(yǎng)，每個(gè)處理3次重復(fù)。7h后鏡檢并計(jì)算孢子萌發(fā)率。

（3）pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)和分生孢子萌發(fā)的影響。①菌絲生長(zhǎng)。用1mol/LHCl和1mol/LNaOH溶液調(diào)配pH為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11的PDA培養(yǎng)基，將直徑為5mm的菌餅接種于PDA培養(yǎng)基平板上，于28℃黑暗培養(yǎng)，每個(gè)處理3次重復(fù)。5d后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。②分生孢子萌發(fā)。用1mol/LHCl和1mol/LNaOH溶液調(diào)配pH為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11的PDA培養(yǎng)基，將孢子懸浮液滴于涂有調(diào)好pH的PDA培養(yǎng)基的載玻片上，置于28℃培養(yǎng)箱黑暗保濕培養(yǎng)，每個(gè)處理3次重復(fù)。7h后鏡檢并計(jì)算孢子萌發(fā)率。

（4）光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響。將直徑為5mm的菌餅接種于PDA培養(yǎng)基平板，分別置于24h光照、12h光暗交替和24h黑暗3個(gè)光周期的28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)5d，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.3數(shù)據(jù)處理

使用SPSS和Excel軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，使用AdobePhotoshopCS6軟件處理拍攝的圖片。

2結(jié)果與分析

2.1田間癥狀

2021年3月，在海南省儋州市檳榔種植基地發(fā)現(xiàn)檳榔葉斑病病株，該病害發(fā)病于檳榔葉片。發(fā)病初期，葉片上產(chǎn)生黑褐色小病斑，病斑近圓形或不規(guī)則形，病斑略有凹陷，環(huán)繞淡黃色暈圈（圖1A）；發(fā)病中期，小病斑增多且不斷向葉片兩端擴(kuò)展，病斑中央黑褐色，邊緣淺褐色并帶有黃色暈圈（圖1B，圖1C）；后期病斑中央淺褐色，其上散生眾多黑色小點(diǎn)，即分生孢子堆，病部邊緣深褐色（圖1D），最終導(dǎo)致葉片干枯、倒垂。

2.2菌株的致病性測(cè)定

從采自海南省儋州市那大鎮(zhèn)大星大隊(duì)農(nóng)場(chǎng)檳榔種植基地的10份具典型葉斑病的檳榔葉片上分離出3種不同的真菌菌株，經(jīng)純化后得到菌株HNDZAC-1、HNDZAC-2和HNDZAC-3。

采用刺傷和無傷接種的方法將這3株菌株分別接種到活體健康的檳榔葉片上。刺傷接種HNDZAC-1菌株的葉片3d后，檳榔葉片開始發(fā)病，接種部位出現(xiàn)淺棕色病斑，邊緣具黃色暈圈，并逐漸向四周擴(kuò)展；接種5d后，病斑中央壞死，邊緣呈棕色并帶有黃色暈圈；7d后，發(fā)病部位產(chǎn)生大量黑色分生孢子堆，與田間癥狀相同（圖2A，圖2B），發(fā)病率均為100%。無傷接種和對(duì)照組均未發(fā)?。▓D2C，圖2D）。從病斑處再次分離純化的菌株與接種菌株菌落形態(tài)特征相同，符合柯赫氏法則。而接種HNDZAC-2和HNDZAC-3菌株的葉片均未發(fā)病。結(jié)果表明菌株HNDZAC-1是檳榔葉斑病的致病菌。

2.3病原菌的形態(tài)學(xué)觀察

菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d后菌落白色，邊緣不整齊，菌落直徑8.5～8.7cm（x=8.6cm），菌株的菌絲濃密，氣生菌絲發(fā)達(dá)，菌落背面有淺黃色色素沉積，且菌落具環(huán)狀同心輪紋（圖3A）。30d后在PDA培養(yǎng)基上菌株的分生孢子堆產(chǎn)生于菌絲層表面或埋生于培養(yǎng)基底層，呈黑色墨汁狀，單生或成簇聚集（圖3B，圖3C）。分生孢子梗退化為產(chǎn)孢細(xì)胞，產(chǎn)孢細(xì)胞無色透明，光滑，壁薄，圓筒形至安瓿瓶形（圖3D，3E）。分生孢子4分隔，分隔處縊縮，擬紡錘形，直立，18.3～28.6μm×5.1～7.6μm（x=23.1μm×6.4μm）；基部細(xì)胞倒圓錐形或倒三角形，壁薄，光滑，長(zhǎng)2.5～6.1μm（x=3.6μm）；中間3個(gè)有色胞異色，長(zhǎng)12.1～17.8μm（x=14.4μm），似甕形，隔膜及周壁顏色較其他部分深，基部向上第二細(xì)胞淺棕色，長(zhǎng)3.0～5.7μm（x=4.3μm）；第三細(xì)胞深棕色，長(zhǎng)3.8～5.0μm（x=4.4μm）；第四細(xì)胞淡棕色，長(zhǎng)3.6～5.4μm（x=4.5μm）；頂端細(xì)胞無色透明，鈍三角形，壁薄而光滑，長(zhǎng)3.9～5.2μm（x=4.4μm）；有2～3根管狀頂端附屬絲，從頂端脊處產(chǎn)生，不分枝，15.9～29.2μm（x=22.8μm）；具1根基部附屬絲，中生式，絲狀，不分枝，長(zhǎng)2.4～7.0μm（x=4.6μm）（圖3F～圖3I）。根據(jù)上述形態(tài)特征，可初步判斷引起檳榔葉斑病的病原菌為新擬盤多毛孢屬（Neopestalotiopsissp.）。

2.4病原菌的分子鑒定

提取病原菌HNDZAC-1的DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增病原菌ITS、TUB和TEF的基因序列，經(jīng)PCR反應(yīng)并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)測(cè)序后得到基因長(zhǎng)度分別為527、453、275bp的序列（圖4）（GenBank登錄號(hào)分別為ON323485、ON323486、ON323487）。將得到的序列在GenBank中進(jìn)行比對(duì)，并對(duì)3個(gè)基因序列聯(lián)合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示：菌株HNDZAC-1與N.sonnerataeMFLUCC17-1745聚為一個(gè)進(jìn)化分支，自舉支持率為98%（圖5）。因此，根據(jù)形態(tài)學(xué)鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析，將引起檳榔葉斑病的病原菌鑒定為N.sonneratae。

2.5病原菌生物學(xué)特性

2.5.1培養(yǎng)基對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響病原菌在8種不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌落均為白色，邊緣整齊。在PDA、PSA和MEA三種培養(yǎng)基上的氣生菌絲發(fā)達(dá)，CA和Czapek培養(yǎng)基上的氣生菌絲較發(fā)達(dá)，SGA和CMA培養(yǎng)基上的氣生菌絲不發(fā)達(dá)，在WA培養(yǎng)基上的氣生菌絲極不發(fā)達(dá)；病原菌在8種培養(yǎng)基上培養(yǎng)5d均無分生孢子產(chǎn)生（圖6）。菌絲在CA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度最快，其次是PDA培養(yǎng)基，生長(zhǎng)最慢的是Czapek培養(yǎng)基（圖7）。

2.5.2溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)和分生孢子萌發(fā)的影響病原菌的菌絲在10～35℃下均能生長(zhǎng)，當(dāng)溫度為10～28℃時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速率隨溫度升高而增大，其中，在28℃時(shí)菌落生長(zhǎng)速度最快，菌落直徑達(dá)6.49cm。當(dāng)溫度為28～35℃時(shí)，隨溫度的增加菌落生長(zhǎng)速度明顯減緩（圖8）。

病原菌分生孢子萌發(fā)的適宜溫度為20～32℃；在10～28℃范圍內(nèi)，分生孢子萌發(fā)率隨溫度升高而升高；當(dāng)溫度為28℃時(shí)，分生孢子萌發(fā)率最高，可達(dá)97%；在28～35℃范圍內(nèi)，分生孢子萌發(fā)率隨溫度升高而降低；溫度高于35℃時(shí)，分生孢子不能萌發(fā)（圖8）。

2.5.3pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)和分生孢子萌發(fā)的影響在pH為3～10時(shí)病原菌菌絲均可生長(zhǎng)，菌絲適宜生長(zhǎng)pH為5～8，且各pH下菌絲生長(zhǎng)速率無顯著差異，當(dāng)pH為5時(shí)，菌落生長(zhǎng)速度最快，直徑達(dá)7.14cm，pH為11時(shí)，菌落停止生長(zhǎng)（圖9）。因此偏酸性生長(zhǎng)條件更適合該病原菌生長(zhǎng)。

分生孢子在pH為3～11時(shí)均能萌發(fā)。當(dāng)pH≤2時(shí)，孢子不能萌發(fā)；pH為2～6時(shí)，隨著pH的增大孢子萌發(fā)率逐漸增高；pH為6時(shí)，分生孢子萌發(fā)率達(dá)到最大，可達(dá)99%；pH為6～11時(shí)，隨著pH的增大孢子萌發(fā)率逐漸降低（圖9）。結(jié)果表明弱酸性至中性的條件更適合孢子的萌發(fā)。

2.5.4光照對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響在24h光照條件下菌落生長(zhǎng)速度最快，菌落直徑為7.20cm；光暗交替次之，菌落直徑為6.86cm；24h黑暗條件下菌落生長(zhǎng)速度最慢，菌落直徑為6.51cm（圖10）。由此可見，光照有利于菌絲的生長(zhǎng)。

3討論

MARARACHCHIKUMBURA等[17]通過形態(tài)學(xué)和多基因分析將類擬盤多毛孢真菌分為Pestalotiopsis、Neopestalotiopsis和Pseudopestalotiopsis三個(gè)不同屬，Neopestalotiopsis與其他2個(gè)屬的主要區(qū)別是中間3個(gè)有色胞異色，然而，通過形態(tài)學(xué)特征無法準(zhǔn)確鑒定病原菌，需要結(jié)合ITS、TUB和TEF多個(gè)核苷酸序列建樹將病原菌進(jìn)行準(zhǔn)確分類。本研究通過病害田間癥狀觀察、致病性測(cè)定、病原菌形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定，將引起檳榔葉斑病的病原菌鑒定為N.sonneratae。由N.sonneratae引起植物病害的報(bào)道較少，目前僅有在杯萼海桑（Sonneratiaalba）的葉片上引起葉斑病的報(bào)道[18]。本研究中病原菌株的分生孢子長(zhǎng)度和寬度小于NORPHANPHOUN等[18]的研究結(jié)果；而且本研究中頂端附屬絲只有2～3根，NORPHANPHOUN等[18]的研究有1～3根；但本研究中分生孢子的頂端附屬絲和基部附屬絲的長(zhǎng)度均長(zhǎng)于NORPHANPHOUN等[18]的研究結(jié)果。二者的分生孢子大小、頂端附屬絲和基部附屬絲的長(zhǎng)度及頂端附屬絲的數(shù)量存在差異，其原因可能是寄主和采集地不同，導(dǎo)致病原菌的分生孢子形態(tài)產(chǎn)生差異。

研究N.sonneratae真菌的生物學(xué)特性，對(duì)于該病原菌的田間防治策略的制定、藥劑對(duì)真菌靶向抑制機(jī)理的研究及殺菌劑對(duì)該病原菌的抑制效果及作用機(jī)制的研究等有著重要的意義。本研究表明，該病原菌菌絲生長(zhǎng)的溫度范圍廣，在10～35℃下菌絲均能生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度為28℃，菌絲生長(zhǎng)適宜pH為5～8，最適pH為5；分生孢子萌發(fā)的適宜溫度為20～32℃，在28℃時(shí)，分生孢子萌發(fā)率最高，分生孢子萌發(fā)的適宜pH為4～8，最適pH為6；光照條件有利于病原菌菌絲的生長(zhǎng)。通過生物學(xué)特性研究可知，病原菌的生長(zhǎng)和分生孢子萌發(fā)的適宜pH均在5～8之間，高溫高濕、強(qiáng)光照有利于該病的發(fā)生及傳播，此外，夏季高溫是引起檳榔病害的一個(gè)主要原因，因此，在種植檳榔時(shí)，可以適當(dāng)調(diào)整土壤的pH，選擇靠近水源的區(qū)域，并留有適當(dāng)?shù)臉淠颈邮a，減少因高溫引起的日灼，以減輕病原菌的侵入。另外，長(zhǎng)期施用單一農(nóng)藥也會(huì)引起病原菌產(chǎn)生耐藥性，所以在化學(xué)防治時(shí)，要注意根據(jù)田間實(shí)際情況混用或交替使用或不使用農(nóng)藥，才能取得最佳的防治效果。本研究明確了N.sonneratae菌絲生長(zhǎng)和分生孢子萌發(fā)的最適條件，有利于認(rèn)識(shí)該病害的發(fā)生發(fā)展規(guī)律，為防治檳榔葉斑病提供一定的理論依據(jù)。