鄧嘉林, 錢亞云, 楊妞妞, 2

(1. 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 江蘇 揚(yáng)州, 225009; 2. 揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院 中醫(yī)科, 江蘇 揚(yáng)州, 225012)

皮炎、濕疹、銀屑病是臨床上常見的易反復(fù)發(fā)作的慢性炎癥性皮膚病,且都伴有一定程度的皮損。目前,臨床上常使用激素和免疫抑制劑類藥物進(jìn)行治療,如皮質(zhì)類固醇類藥物、抗組胺類藥物[1], 但治療成本高、易復(fù)發(fā),且常伴有各種副作用[2]。激素類藥物可能導(dǎo)致機(jī)體代謝異常、肌無力、生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、誘發(fā)精神癥狀等結(jié)果[3], 免疫抑制劑可能會(huì)引起鼻咽炎、頭痛、肺結(jié)核、藥物性狼瘡、炎癥性腸病等不良反應(yīng)[4]。中藥作為中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的瑰寶,長(zhǎng)期被用于治療皮膚炎癥,具有配方靈活、成本低、療效穩(wěn)定、副作用小等優(yōu)點(diǎn)[5]。白鮮皮是蕓香科多年生草本植物白鮮的干燥根皮,具有清熱燥濕、祛風(fēng)解毒的作用,臨床上主要用于治療皮膚炎癥、濕疹、風(fēng)疹、風(fēng)濕、婦科炎癥等疾病[6-8]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究[9]發(fā)現(xiàn),白鮮皮具有明顯的抗炎、殺蟲、免疫抑制等作用,但白鮮皮用于治療皮炎、濕疹、銀屑病的共同機(jī)制尚不清楚。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)合分子對(duì)接技術(shù),探討白鮮皮“同病異治”皮炎、濕疹、銀屑病的作用機(jī)制,為后期實(shí)驗(yàn)研究及臨床藥物的研發(fā)提供一定指導(dǎo)[10]。

1 資料與方法

1.1 白鮮皮有效成分的獲取和作用靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP)(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)中檢索白鮮皮成分[11], 并以藥物生物口服利用度(OB)≥30%, 藥物相似性(DL)≥0.18作為有效成分篩選的標(biāo)準(zhǔn)[12]。將有效成分的SMILES號(hào)導(dǎo)入STP數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.swisstargetprediction.ch/),查得其對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)式,再進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè),選擇prob>0的靶點(diǎn)作為白鮮皮的潛在作用靶點(diǎn)[13], 再將所有作用靶點(diǎn)合并去重,最后使用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.Uniport.org/)對(duì)靶點(diǎn)基因的名稱進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化[14]。

1.2 皮炎、濕疹、銀屑病相關(guān)靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)和相同靶點(diǎn)的獲得

運(yùn)用TTD(https://db.idrblab.net/ttd/)、OMIM(http://www.omim.org/)、DrugBank(https://go.drugbank.com/)、GeneCards(https://www.genecards.org/)、DisGeNET(https://www.disgenet.org/)數(shù)據(jù)庫(kù),以“皮炎(dermatitis)”“濕疹(eczema)”“銀屑病(psoriasis)”為關(guān)鍵詞分別進(jìn)行檢索,獲得作用于皮炎、濕疹、銀屑病的相關(guān)靶點(diǎn),再將皮炎、濕疹、銀屑病的相關(guān)靶點(diǎn)分別導(dǎo)入Venny2.1.0在線軟件作圖工具平臺(tái)(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/Venny/)獲得皮炎、濕疹、銀屑病的相同靶點(diǎn)。

1.3 白鮮皮-皮炎/濕疹/銀屑病的相同靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)的獲得及網(wǎng)絡(luò)圖繪制

將白鮮皮有效成分的作用靶點(diǎn)與皮炎、濕疹、銀屑病的共同靶點(diǎn)分別導(dǎo)入Venny平臺(tái),繪制韋恩圖,得到白鮮皮-疾病共同靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)。運(yùn)用Cytoscape3.8.2軟件構(gòu)建白鮮皮有效成分與交集靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

為了探索白鮮皮與皮炎、濕疹、銀屑病相同靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)基因之間的相互作用,將交集靶點(diǎn)基因通過相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)STRING(https://cn.string-db.org/)進(jìn)行蛋白相互作用查詢并構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),選擇物種為“人(Homo sapiens)”, 最高置信度為0.400, 剔除無相互聯(lián)系的節(jié)點(diǎn),得到白鮮皮治療皮炎、濕疹、銀屑病相同靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)。利用Cytoscape3.8.2軟件對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?篩選出節(jié)點(diǎn)度值最大的10個(gè)靶點(diǎn)作為該機(jī)制的核心靶點(diǎn),用于后續(xù)的分子對(duì)接。

1.5 基因本體(GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析

為了明確交集靶點(diǎn)蛋白在基因功能及信號(hào)通路中的作用,對(duì)交集靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集分析。運(yùn)用R語言軟件編碼,使得交集靶點(diǎn)在Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)(http://metascape.org/gp/index.html)進(jìn)行GO富集分析和KEGG信號(hào)通路分析,并進(jìn)行可視化處理[15]。

1.6 分子對(duì)接

從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載5個(gè)核心成分的mol2格式。將篩選出的核心靶點(diǎn)輸入RCSB Protein Data Bank(pdb)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.rcsb.org), 查找相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu),并根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)的種屬、作用機(jī)制、是否存在突變氨基酸殘基、鏈數(shù)、分辨率和pH值、蛋白結(jié)構(gòu)中的配體與目標(biāo)化合物的結(jié)果相似度等6個(gè)條件篩選出最佳的蛋白結(jié)構(gòu)[16]。篩選出來的蛋白結(jié)構(gòu)借助Discovery Studio 2019 Client軟件提取出靶點(diǎn)基因原配體,并將其重新對(duì)接到靶點(diǎn)基因的活性口袋中,設(shè)置晶體結(jié)構(gòu)中原配體構(gòu)象的RMSD值為0, 計(jì)算對(duì)接后配體構(gòu)象的RMSD值, RMSD值≤2.5×10-10m時(shí),認(rèn)為分子對(duì)接結(jié)果可靠,可以用于分子對(duì)接[17]。運(yùn)用AutoDock Tools進(jìn)行分子對(duì)接,獲得的結(jié)果借助Open Babel軟件轉(zhuǎn)換為pdb格式,最后再用PyMOL軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié) 果

2.1 白鮮皮有效成分和潛在作用靶點(diǎn)

在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)共檢索到白鮮皮成分63個(gè),有效成分18個(gè),去除在STP數(shù)據(jù)庫(kù)中沒有預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的成分,共篩選得到15個(gè)有效成分,合并刪重后共有447個(gè)潛在作用靶點(diǎn)。運(yùn)用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)規(guī)范化處理靶點(diǎn)基因名稱。15個(gè)有效成分見表1。

表1 白鮮皮的有效成分

2.2 皮炎、濕疹、銀屑病的共同靶點(diǎn)

以“皮炎(dermatitis)”“濕疹(eczema)”“銀屑病(psoriasis)”為關(guān)鍵詞,在TTD、OMIM、DrugBank、GeneCards、DisGeNET 5個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索,獲得皮炎相關(guān)靶點(diǎn)1 675個(gè),濕疹相關(guān)靶點(diǎn)2 884個(gè),銀屑病相關(guān)靶點(diǎn)3 697個(gè),將皮炎、濕疹、銀屑病的靶點(diǎn)分別導(dǎo)入Venny平臺(tái),繪制韋恩圖,獲得皮炎、濕疹、銀屑病的交集作用靶點(diǎn)588個(gè),見圖1。

圖1 皮炎、濕疹、銀屑病的相同靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 白鮮皮-皮炎、濕疹、銀屑病共同靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)

在Venny平臺(tái)上分別錄入白鮮皮15個(gè)活性成分的447個(gè)靶點(diǎn)與588個(gè)皮炎、濕疹、銀屑病的交集靶點(diǎn),最終獲得白鮮皮活性成分共同作用于皮炎、濕疹、銀屑病的潛在靶點(diǎn)64個(gè),見圖2。

圖2 白鮮皮與皮炎、濕疹、銀屑病相同靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)韋恩圖

2.4 “有效成分-交集靶點(diǎn)”的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及其可視化分析

將白鮮皮的15個(gè)有效成分以及白鮮皮與皮炎、濕疹、銀屑病相同靶點(diǎn)的64個(gè)交集靶點(diǎn)輸入Cytoscape3.8.2軟件中,構(gòu)建“有效成分-交集靶點(diǎn)”相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖(圖3), 圖中黃色節(jié)點(diǎn)代表白鮮皮中的15種活性成分,藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表64個(gè)交集靶點(diǎn),節(jié)點(diǎn)度值表示該成分與作用靶點(diǎn)的關(guān)聯(lián)個(gè)數(shù),節(jié)點(diǎn)度值越大說明該成分發(fā)揮治療作用的可能性越大,其顯示在網(wǎng)絡(luò)中的圖標(biāo)也越大。使用該軟件的Network Analyzer功能對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析預(yù)測(cè),按照篩選度值從大到小排序,得到白鮮皮作用于皮炎、濕疹、銀屑病的相同靶點(diǎn)的前5個(gè)活性成分: 赤霉素B、甘遂烷、前茵芋堿、7α-乙酰葉枯醇、白鮮明堿。

圖3 “有效成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

將獲得的64個(gè)潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)并構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)(圖4), PPI網(wǎng)絡(luò)顯示有64個(gè)節(jié)點(diǎn), 465條相互作用連線,平均節(jié)點(diǎn)度值為14.5, 平均集聚系數(shù)為0.689。PPI網(wǎng)絡(luò)圖中,節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn),節(jié)點(diǎn)越大、顏色越深說明該靶點(diǎn)在PPI網(wǎng)絡(luò)中涉及的生物功能越多。利用Cytoscape 3.8.2軟件的CytoNCA插件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?以Betweenness、Closeness、Degree、Eigenvector、Information、LAC這6個(gè)值為篩選條件,得到白鮮皮活性成分治療皮炎、濕疹、銀屑病的前10個(gè)潛在作用靶點(diǎn),依次為腫瘤壞死因子(TNF)、Toll樣受體4 (TLR4)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A (VEGFA)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子3 (STAT3)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子1 (STAT1)、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、蛋白酪氨酸磷酸酶受體C型(PTPRC)、環(huán)氧合酶2(PTGS2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9 (MMP9)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ (PPARG), 見圖5。

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)圖 圖5 核心靶點(diǎn)圖

2.6 GO富集分析

借助Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)64個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析,以P<0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn),并對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化處理(圖6), 共獲得1 191個(gè)生物學(xué)過程(BP)、29個(gè)細(xì)胞成分(CC)以及72個(gè)分子功能(MF), 分別選擇前10條分析結(jié)果繪制成柱狀圖。結(jié)果顯示,白鮮皮主要通過影響炎癥反應(yīng)、肽基酪氨酸磷酸化、肽基酪氨酸修飾等生物學(xué)過程來緩解皮炎、濕疹、銀屑病。對(duì)細(xì)胞成分的富集分析結(jié)果表明,白鮮皮的影響主要發(fā)生在膜筏、膜微區(qū)、神經(jīng)元胞體。細(xì)胞因子受體結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性、核受體活性等分子功能與白鮮皮緩解皮炎、濕疹、銀屑病癥狀有關(guān)。

圖6 GO富集分析圖 圖7 KEGG富集分析圖

2.7 KEGG信號(hào)通路分析

KEGG信號(hào)通路富集分析說明了交集靶點(diǎn)與通路的關(guān)系,借助Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析后共得到97條結(jié)果,前20條結(jié)果見圖7。結(jié)果顯示,相同靶點(diǎn)主要富集于酪氨酸激酶-信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子(JAK-STAT)信號(hào)通路、白細(xì)胞介素17(IL-17)信號(hào)通路、高級(jí)糖基化終末產(chǎn)物-受體(AGE-RAGE)信號(hào)通路等。將前20條有關(guān)信號(hào)通路和靶點(diǎn)的結(jié)果借助R語言繪制靶點(diǎn)-信號(hào)通路圖,結(jié)果見圖8(藍(lán)色節(jié)點(diǎn)為靶點(diǎn),粉色節(jié)點(diǎn)為信號(hào)通路)。對(duì)關(guān)系最密切的JAK-STAT信號(hào)通路上所有的靶點(diǎn)基因進(jìn)行可視化處理,見圖9(節(jié)點(diǎn)為JAK-STAT信號(hào)通路上所有基因,其中紅色節(jié)點(diǎn)為JAK-STAT信號(hào)通路上此次富集的靶點(diǎn)基因)。

圖8 靶點(diǎn)-信號(hào)通路圖

圖9 JAK-STAT信號(hào)通路圖

2.8 分子對(duì)接及其可視化

為了進(jìn)一步探討白鮮皮治療皮炎、濕疹、銀屑病的機(jī)制,借助Discovery Studio 2019 Client、AutoDock Tools、PyMOL進(jìn)行分子對(duì)接和可視化。在pdb數(shù)據(jù)庫(kù)檢索并篩選出PTGS2、TNF、EGFR、MMP9、PPARG 共5個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)。經(jīng)Discovery Studio 2019 Client軟件驗(yàn)證只有TNF、EGFR、MMP9、PPARG 這4個(gè)靶點(diǎn)存在RMSD<2.5的蛋白構(gòu)象。把白鮮皮的5個(gè)主要活性成分赤霉素B、甘遂烷、前茵芋堿、7α-乙酰葉枯醇、白鮮明堿分別與TNF、EGFR、MMP9、PPARG進(jìn)行分子對(duì)接。化合物與蛋白之間的自由結(jié)合能小于-5 kcal/mol說明結(jié)合穩(wěn)定,并且這個(gè)值越小表明越穩(wěn)定[18]。分子對(duì)接結(jié)果提示,關(guān)鍵成分與核心靶點(diǎn)之間的結(jié)合都較為穩(wěn)定,見表2。選擇與4個(gè)靶點(diǎn)結(jié)合最穩(wěn)定的化合物,并對(duì)其與靶點(diǎn)之間的對(duì)接關(guān)系進(jìn)行可視化處理,見圖10。結(jié)果顯示,其均與對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的相應(yīng)位點(diǎn)形成了氫鍵,氫鍵的數(shù)量及結(jié)合位點(diǎn)見表3。

表2 關(guān)鍵化合物與核心蛋白結(jié)合能

表3 關(guān)鍵化合物與核心靶點(diǎn)氫鍵結(jié)合數(shù)量與位點(diǎn)

3 討 論

本研究從白鮮皮中篩選出赤霉素B、槲皮素、前茵芋堿、木犀草素、白鮮明堿等15個(gè)有效成分,其中作用于皮炎、濕疹、銀屑病的關(guān)鍵成分是赤霉素B、甘遂烷、前茵芋堿、7α-乙酰葉枯醇、白鮮明堿?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究[19]表明,赤霉素B有顯著的抗瘧原蟲活性,而甘遂烷、前茵芋堿、白鮮明堿、7α-乙酰葉枯醇具有明顯的抗炎作用。前茵芋堿可以抑制脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的一氧化氮的產(chǎn)生來起到抗炎作用[6, 20]。

白鮮皮“同病異治”皮炎、濕疹、銀屑病的核心靶點(diǎn)是TNF、TLR4、VEGFA、STAT3、STAT1、EGFR、PTPRC、PTGS2、MMP9、PPARG。TNF在調(diào)節(jié)適應(yīng)性和先天免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用,因此是感染性和非感染性炎癥性疾病的關(guān)鍵因素。TNF通過TNFR1抑制炎癥和組織變性,并通過TNFR2發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和組織再生的作用[21]。TLR4可被LPS激活,在天然免疫應(yīng)答中起到重要調(diào)控作用?，F(xiàn)代研究[22]表明, TLR4在炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答及腫瘤治療等方面都有一定作用。VEGF是一種有效的血管生成生長(zhǎng)因子。VEGFA是VEGF家族7個(gè)成員中被研究得最多的成員,是血管生成的主要介質(zhì)[23], 在銀屑病患者的皮膚中過度表達(dá),并與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。表皮細(xì)胞中酪氨酸激酶受體(Flt1)或神經(jīng)纖毛蛋白1(Nrp1)的條件性缺失可抑制由VEGFA過表達(dá)誘導(dǎo)的銀屑病的發(fā)生[24]。STAT1和STAT3都屬于STATs家族,具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活的功能,參與調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞存活、免疫應(yīng)答等過程。STAT1和STAT3在常見的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的下游被激活,破壞其平衡可以引導(dǎo)細(xì)胞從存活到凋亡或從炎癥反應(yīng)到抗炎反應(yīng)[25]。EGFR是一種受體酪氨酸激酶,具有跨膜區(qū)和細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域[26]。EGFR通過誘導(dǎo)血紅素加氧酶1(HO-1)的表達(dá),促進(jìn)牙周膜細(xì)胞的成骨細(xì)胞分化,抑制牙周炎的發(fā)生[27]。PTPCR也稱為CD45, 是一種跨膜糖蛋白,幾乎在所有造血細(xì)胞上(除成熟的紅細(xì)胞以外)表達(dá)。蛋白質(zhì)酪氨酸激酶和磷酸酶活性之間平衡的破壞可導(dǎo)致免疫缺陷和自身免疫[28]。研究[29]證實(shí), MMP9在銀屑病中性粒細(xì)胞中過度表達(dá),在銀屑病皮損中含量豐富,尤其是鄰近血管內(nèi)和血管周圍組織,表明MMP9可能在銀屑病血管重塑中發(fā)揮作用。PPARG在尿路上皮細(xì)胞中可以通過調(diào)控線粒體生物發(fā)生、細(xì)胞分化和炎癥反應(yīng)在尿路感染中發(fā)揮重要作用[30]。PTGS2可以與多種炎癥細(xì)胞因子和介質(zhì)響應(yīng),并且快速穩(wěn)健地表達(dá)抑制作用[31]。

借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對(duì)接技術(shù),本研究發(fā)現(xiàn)白鮮皮的5個(gè)主要活性成分可能通過JAK-STAT、IL-17、AGE-RAGE等多個(gè)通路作用于TNF、TLR4、VEGFA等多個(gè)靶點(diǎn),在常見皮膚病中起到抗炎止癢的作用。但這些方法有一定局限性,如數(shù)據(jù)庫(kù)更新慢和容量問題: TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)最新更新時(shí)間為2014年5月30日; STP數(shù)據(jù)庫(kù)每個(gè)成分只能檢索出100個(gè)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn),由于篩選條件的限制,一些關(guān)鍵的化合物和靶點(diǎn)可能未被納入研究(藥物代謝動(dòng)力學(xué)指標(biāo)很多, OB和DL只是其中2個(gè),按照OB≥30%和DL≥0.18的條件篩選藥物的有效成分不一定準(zhǔn)確); 《中國(guó)藥典》評(píng)價(jià)白鮮皮品質(zhì)的3個(gè)成分——白鮮堿、梣酮、黃柏酮,在用生物OB≥30%、 DL≥0.18來進(jìn)行篩選時(shí),不是白鮮皮的有效成分。此外,本研究只分析了部分且單一的化合物的作用,未考慮其協(xié)同作用。因此,需要更多的研究來闡明白鮮皮治療皮炎、濕疹、銀屑病的相同的作用機(jī)制。但本研究從多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)和平臺(tái)獲取白鮮皮有效成分及皮炎、濕疹、銀屑病的靶點(diǎn)信息,并且利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)從分子水平進(jìn)行了相對(duì)科學(xué)的理論研究和驗(yàn)證,對(duì)臨床藥物的研發(fā)具有一定的指導(dǎo)作用。