李威材 秦剛 何凱毅 蘇國(guó)威 劉金富 肖世富 范以東 吳廣濤 劉俊良

骨肉瘤（osteosarcoma，OS）是一種原發(fā)性惡性骨腫瘤，好發(fā)于兒童和青少年時(shí)期[1]，其惡性程度高，病變迅速，具有高度的轉(zhuǎn)移傾向[2]。目前，新輔助化療聯(lián)合手術(shù)切除療法和術(shù)后輔助化療是OS 的主要治療方法[3]。近年來(lái)，盡管OS 治療進(jìn)展提高了患者的生存率，但由于基因組的復(fù)雜性和不穩(wěn)定性對(duì)OS 患者臨床治療產(chǎn)生的重大影響，轉(zhuǎn)移性和復(fù)發(fā)性O(shè)S 患者的生存率仍然較低[4]。有報(bào)道局限性O(shè)S 患者的長(zhǎng)期生存率約68%，而復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性O(shè)S 患者的生存率仍低于30%[5]，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量。因此，迫切需要探索可靠有效的預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，以指導(dǎo)OS 的臨床決策和個(gè)性化治療，從而提高OS 患者的生存率。

長(zhǎng)非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一種長(zhǎng)度超過200 個(gè)核苷酸的常見非編碼RNA，可通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)發(fā)揮生物功能，在癌癥的發(fā)展和進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用[6]。雙硫死亡是由二硫化物應(yīng)激引起的一種全新的細(xì)胞死亡形式，其引起細(xì)胞死亡的機(jī)制不同于已知的鐵死亡、細(xì)胞凋亡、自噬和壞死性凋亡等多種細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)機(jī)制；當(dāng)高表達(dá)的SLC7A11 與葡萄糖饑餓相結(jié)合時(shí)，細(xì)胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的二硫化物分子，誘導(dǎo)嚴(yán)重的二硫化物應(yīng)激，最終導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)崩潰和細(xì)胞死亡[7]。溶質(zhì)載體家族7 成員11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）是一種人體胱氨酸/谷氨酸反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其高表達(dá)水平與OS 細(xì)胞的增殖和遷移密切相關(guān)[8]。然而，雙硫死亡基因在OS 和其他癌癥中的機(jī)制和臨床作用尚不清楚，關(guān)于雙硫死亡相關(guān) lncRNA（disulfidptosis-related lncRNAs，DRLncs）在OS 中所起作用的研究仍不明確。因此，深入研究DRLncs 在OS 中的作用機(jī)制對(duì)OS 患者的診斷、治療和預(yù)后具有重要的臨床價(jià)值。

本研究旨在通過生物信息學(xué)分析探討DRLncs在OS 預(yù)后中的作用以及與免疫微環(huán)境和藥物敏感性之間的關(guān)系，為OS 的臨床治療和預(yù)后機(jī)制的研究提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

從加利福尼亞大學(xué)圣克魯茲分校（UCSC）基因組瀏覽器下載88 例OS 患者的mRNA-seq 及臨床數(shù)據(jù)和396 例正常肌肉骨骼組織樣本，下載時(shí)間為2023年3 月。10 個(gè)雙硫死亡相關(guān)基因（disulfidptosis-related genes，DRGs）從已發(fā)表的文章中獲取[7]。

1.2 方法

1.2.1 差異表達(dá)DRGs 的篩選 排除3 例無(wú)完整生存數(shù)據(jù)的OS 組織樣本后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行批次矯正獲取OS 相關(guān)的DRGs 表達(dá)矩陣，通過微陣列數(shù)據(jù)的線性模型（limma）包進(jìn)行差異分析，以獲得差異表達(dá)的DRGs。篩選標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05 和|logFC|＞1。

1.2.2 OS 相關(guān)DRLncs 的篩選及共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 使用R 軟件“l(fā)imma”包對(duì)差異表達(dá)DRGs 和lncRNA進(jìn)行共表達(dá)分析獲得DRLncs，以|Pearson 相關(guān)系數(shù)|＞0.4 和P＜0.001 為篩選標(biāo)準(zhǔn)[9]。

1.2.3 風(fēng)險(xiǎn)預(yù)后模型的構(gòu)建 將OS 樣本隨機(jī)分為訓(xùn)練組（n=43）和測(cè)試組（n=42），所有患者的臨床數(shù)據(jù)見表1，訓(xùn)練組和驗(yàn)證組中患者的臨床特征比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表2）。使用R 軟件“survival”包對(duì)OS 數(shù)據(jù)進(jìn)行單變量Cox 回歸分析篩選出與OS 預(yù)后相關(guān)的DRLncs。在訓(xùn)練組中進(jìn)行LASSO 回歸分析，通過1 000 倍交叉驗(yàn)證進(jìn)一步篩選出關(guān)鍵的DRLncs。獲得的DRLncs 納入多變量Cox 回歸分析，以基于訓(xùn)練組中的最低赤池信息量準(zhǔn)則（Akaike information criterion，AIC）值對(duì)模型進(jìn)行優(yōu)化，鑒定出用于構(gòu)建OS 患者預(yù)后模型的DRLncs。使用以下公式確定了各分組中每個(gè)患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，其中Coef（lncRNAi）表示相關(guān)系數(shù)，Expr（lncRNAi）表示DRLncs 的表達(dá)量。

表1 所有OS 患者的臨床數(shù)據(jù)

表2 測(cè)試組與驗(yàn)證組中患者的臨床特征

1.2.4 風(fēng)險(xiǎn)預(yù)后模型的驗(yàn)證 根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的中位數(shù)將各樣本組分為高、低風(fēng)險(xiǎn)組，通過主成分分析（principal component analysis，PCA）驗(yàn)證分組的準(zhǔn)確性，對(duì)各分組進(jìn)行生存分析、ROC 曲線以驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性。通過獨(dú)立預(yù)后分析，鑒定出獨(dú)立預(yù)后的因素。最后構(gòu)建列線圖預(yù)測(cè)OS 患者的 1、3 和5 年生存率，并用校準(zhǔn)曲線評(píng)估列線圖的預(yù)后價(jià)值。

1.2.5 腫瘤微環(huán)境和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的評(píng)估 使用R軟件“l(fā)imma”“estimate” 和“ggpubr”包進(jìn)行腫瘤微環(huán)境分析。利用單樣本基因集富集分析（single-sample gene set enrichment analysis,ssGSEA）分析總樣本組中高、低風(fēng)險(xiǎn)組患者與免疫細(xì)胞和免疫功能的差異，使用“ggboxplot”包將結(jié)果可視化。

1.2.6 藥物敏感性分析 為篩選治療OS 患者的潛在藥物，本研究使用R 軟件“l(fā)imma”、“ggpubr”和“oncoPredict”包對(duì)總樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行藥物敏感性分析，以P＜0.001 為篩選標(biāo)準(zhǔn)，預(yù)測(cè)兩個(gè)風(fēng)險(xiǎn)亞組OS 患者潛在治療藥物的敏感性。

1.2.7 qRT-PCR 檢測(cè) 為了進(jìn)一步生物信息學(xué)分析的結(jié)果，本研究選取近10 年自廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院OS 患者的腫瘤組織及健康人的正常組織各30 例以用于進(jìn)行qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。使用Trizol 試劑盒（購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司）從各受試組織中提取總RNA。使用HiFiScript cDNA 第一條鏈合成試劑盒（購(gòu)自江蘇省泰州市康為世紀(jì)公司）將總RNA 合成為cDNA。CFX ConnectTM熒光定量PCR 儀（購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司）以95℃ 15 min 1 個(gè)循環(huán)，95℃10 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s 40 個(gè)循環(huán)反應(yīng)程序下進(jìn)行qRT-PCR 定量每個(gè)基因的表達(dá)水平，β-actin 作為內(nèi)參，并用2-△△CT方法計(jì)算。引物序列見表3，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的OS 患者臨床數(shù)據(jù)表4 所示。

表3 RERG-IT1、AL035446.1、AC010894.1 和β-actin 引物序列

表4 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證中OS 患者的臨床數(shù)據(jù)

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用R.4.2.3、GraphPad Prism v8.2.1 和SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果采用（±s）表示，通過單因素方差分析確定統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OS 差異DRGs 和共表達(dá)DRLncs 的鑒定

共鑒定出RPN1、SLC7A11、GYS1、NDUFS1、NDUFA11、NCKAP1 6 個(gè)OS 差異表達(dá)DRGs（圖1A）。通過共表達(dá)分析，鑒定出125 個(gè)OS 相關(guān)的DRLncs（圖1B）。

圖1 OS 數(shù)據(jù)樣本中差異DRGs 的鑒定

2.2 風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型的構(gòu)建

單變量Cox 回歸確定了AC005082.1、AC13910 0.2、AL035446.1、AC010894.1、RERG-IT1 5 種與OS預(yù)后相關(guān)的DRLncs（圖2A）。通過LASSO 回歸和多因素Cox 回歸分析最終鑒定出3 個(gè)DRLncs 參與預(yù)后模型的構(gòu)建（圖2B～2D，表5）。使用以下公式計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分：（0.678087244×RERG-IT1 expression）-（1.317581601×AL035446.1 expression）-（1.262917565×AC010894.1 expression），根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分中位值分別將總樣本組、訓(xùn)練組和驗(yàn)證組分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。

圖2 風(fēng)險(xiǎn)預(yù)后模型的構(gòu)建

表5 多變量Cox 回歸分析結(jié)果

2.3 風(fēng)險(xiǎn)預(yù)后模型的驗(yàn)證

PCA 結(jié)果表明，該風(fēng)險(xiǎn)預(yù)后預(yù)測(cè)模型能有效區(qū)分OS 患者的風(fēng)險(xiǎn)狀態(tài)（圖3）。生存分析顯示，各分組中高風(fēng)險(xiǎn)組患者的死亡率均高于低風(fēng)險(xiǎn)組（圖4）；死亡風(fēng)險(xiǎn)隨著風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的增加逐漸上升（圖5）。風(fēng)險(xiǎn)熱圖提示，隨著風(fēng)險(xiǎn)值的增加，RERG-IT1 的表達(dá)水平逐漸增高，而AL035446.1 和AC010894.1 的表達(dá)水平逐步降低（圖6）。ROC 曲線顯示，各分組在1、3 和5 年時(shí)均顯示較高的曲線下面積（area under curve，AUC），見圖7。單因素和多因素Cox 回歸分析表明，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和腫瘤轉(zhuǎn)移均可作為OS 患者獨(dú)立的預(yù)后因素（圖8）。利用獨(dú)立預(yù)后因素構(gòu)建列線圖（圖9A），結(jié)合校準(zhǔn)曲線（圖9B），表明預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)際OS 生存率之間具有良好的一致性。

圖3 主成分分析結(jié)果

圖4 生存分析結(jié)果

圖5 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分及生存狀態(tài)

圖6 風(fēng)險(xiǎn)熱圖

圖7 ROC 曲線

圖8 單因素和多因素Cox 回歸分析結(jié)果（P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）

圖9 列線圖與校準(zhǔn)曲線

2.4 風(fēng)險(xiǎn)預(yù)后模型與OS 患者的免疫微環(huán)境分析

腫瘤微環(huán)境分析結(jié)果顯示，高危OS 患者的免疫評(píng)分和總分低于低?；颊撸▓D10A）。免疫細(xì)胞浸潤(rùn)箱線圖（圖10B）顯示，與低風(fēng)險(xiǎn)患者相比，單核細(xì)胞和M2 巨噬細(xì)胞在高風(fēng)險(xiǎn)組顯著下調(diào)（P＜0.05）。ssGSEA分析表明，在高風(fēng)險(xiǎn)組中，細(xì)胞溶解活性、APC 共同抑制、APC 共同激活和檢查點(diǎn)等9 種免疫相關(guān)功能顯著下調(diào)（圖10C）。

圖10 DRLncs 預(yù)后模型與腫瘤微環(huán)境、免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和免疫功能之間的相關(guān)性

2.5 OS 藥物敏感性分析

如低風(fēng)險(xiǎn)患者對(duì)瑞博西尼比高危組患者更敏感；然而高危患者則對(duì)BI-2 536 顯示較高的敏感性（圖11）。本研究結(jié)果表明，瑞博西尼和BI-2 536 可能是OS 的潛在治療藥物。

圖11 高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組患者之間的藥物敏感性分析（P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）

2.6 qRT-PCR 結(jié)果

qRT-PCR 結(jié)果顯示，與正常組織相比，RERGIT1 在OS 組織中顯著上調(diào)，而AL035446.1 和AC0 10894.1 則顯著下調(diào)（圖12），結(jié)果與此前分析結(jié)果一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了生物信息學(xué)分析的準(zhǔn)確性。

圖12 qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

OS 是兒童和青少年常見的惡性骨腫瘤，其復(fù)發(fā)率高、易發(fā)生轉(zhuǎn)移，常導(dǎo)致OS 患者不良的預(yù)后[10]。因此，亟需尋找與OS 相關(guān)的新生物標(biāo)志物以進(jìn)一步改善OS 患者的預(yù)后。雙硫死亡是一種新的細(xì)胞死亡形式，二硫化物的代謝可影響細(xì)胞的增殖與凋亡。二硫化物的代謝與氧化還原狀態(tài)的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，氧化還原狀態(tài)是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一[11]。腫瘤細(xì)胞通過改變細(xì)胞內(nèi)氧化還原環(huán)境來(lái)提高其存活率和耐受性[12]。二硫化物在腫瘤治療中可能具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。Yue 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，二烯丙基二硫化物可通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路抑制人OS 細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移。因此，針對(duì)雙硫死亡的治療可能成為OS 臨床治療的新策略。lncRNA 與OS 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可對(duì)OS 患者的預(yù)后進(jìn)行預(yù)測(cè)[14]。然而，目前鮮見關(guān)于OS 中DRLncs 預(yù)后價(jià)值的研究報(bào)道。

本研究基于3 個(gè)DRLncs 構(gòu)建了預(yù)后預(yù)測(cè)模型，在此模型中，RERG-IT1 可能是OS 預(yù)后不良的風(fēng)險(xiǎn)因子，而AL035446.1 和AC010894.1 則是保護(hù)因子，然而模型中3 個(gè)DRLncs 與OS 的相關(guān)研究鮮見報(bào)道。對(duì)此，本研究進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，進(jìn)一步驗(yàn)證了生物信息學(xué)分析的準(zhǔn)確性。

腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）在OS 細(xì)胞的增殖和侵襲中發(fā)揮著重要作用[15]，lncRNA可通過影響TME 進(jìn)而影響腫瘤的進(jìn)展[16]。本研究顯示，高風(fēng)險(xiǎn)組患者的免疫評(píng)分較低，與腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)[17]。免疫浸潤(rùn)分析顯示，高風(fēng)險(xiǎn)組OS 患者中的單核細(xì)胞和M2 巨噬細(xì)胞顯著下調(diào)。低免疫評(píng)分的患者中M2 巨噬細(xì)胞水平顯著降低，與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分呈負(fù)相關(guān)[18]。單核細(xì)胞浸潤(rùn)水平的降低常導(dǎo)致較差的免疫環(huán)境，從而促進(jìn)腫瘤遷移[19]。9 種免疫相關(guān)功能在高風(fēng)險(xiǎn)組中下調(diào)，進(jìn)一步驗(yàn)證了TME 和免疫浸潤(rùn)分析的結(jié)果。因此，本研究認(rèn)為低免疫評(píng)分和弱免疫狀態(tài)可能與OS 患者的不良預(yù)后有關(guān)。

本研究首次構(gòu)建了OS 的DRLncs 預(yù)后模型，為OS 的臨床治療和預(yù)后機(jī)制研究提供了新方向。但本研究仍存在局限性：1）OS 數(shù)據(jù)樣本過于單一，缺乏lncRNA 表達(dá)譜，易出現(xiàn)誤差；2）DRLncs 在OS 診斷和治療中的潛在機(jī)制需更多的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

本文無(wú)影響其科學(xué)性與可信度的經(jīng)濟(jì)利益沖突。