賴晶 倪琳 藺瑞麗 靳婉君 劉富強(qiáng) 宋平順 馬蕭 滕寶霞

(甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院/國(guó)家中藥材及飲片質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅 蘭州 730013)

《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版收載的柴胡為傘形科植物柴胡(BupleurumchinenseDC.)和狹葉柴胡(BupleurumscorzonerifoliumWild.)的干燥根,根據(jù)性狀不同,前者習(xí)稱“北柴胡”,后者習(xí)稱“南柴胡”[1]。柴胡作為大宗中藥材之一,含柴胡的中成藥的品種也有很多,如小柴胡顆粒、柴胡疏肝丸、柴胡滴丸等,不僅具解表散熱、疏肝和胃等功效,而且據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,加味小柴胡湯對(duì)治療肺部多重耐藥菌感染有明顯效果[2]。當(dāng)前,隨著不同地方引進(jìn)栽培,柴胡屬出現(xiàn)很多變種。藏柴胡作為柴胡屬變種之一,來源于傘形科植物窄竹葉柴胡BupleurummarginatumWall.ex DC.var.stenophyllum(Wolf) Shan et Y.Li的干燥根,主產(chǎn)于云南,四川、貴州、西藏等部分地區(qū)[3]。我國(guó)貴州省藥材標(biāo)準(zhǔn)中又以“竹葉柴胡”的名稱收載[4]。由于北柴胡野生資源短缺和價(jià)格高,藥材市場(chǎng)出現(xiàn)了以藏柴胡充當(dāng)正品北柴胡的現(xiàn)象,影響藥效和安全問題,因此建立基源鑒定方法十分必要。

《中國(guó)藥典》和《日本藥局方》通過柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的總含量控制柴胡質(zhì)量,《歐洲藥典》《英國(guó)藥典》《中藥材標(biāo)準(zhǔn)》和《韓國(guó)藥典》以單一指標(biāo)成分柴胡皂苷a進(jìn)行質(zhì)量控制[5]。有文獻(xiàn)報(bào)道利用HPLC和比色法對(duì)柴胡中柴胡皂苷a(SSa)和柴胡皂苷d(SSd)及總黃酮的含量來進(jìn)行柴胡質(zhì)量評(píng)價(jià)[6]。SSd是SSa的差向異構(gòu)體,SSd除了具有與SSa相似的抗炎[7]、抗腫瘤[8]和免疫調(diào)節(jié)[9]的藥理作用,SSd還有特定的藥理作用,如抗過敏[10]和抗凋亡[11]。現(xiàn)報(bào)道的文獻(xiàn)一般利用柴胡皂苷來鑒別柴胡藥材真?zhèn)?僅靠單一指標(biāo)對(duì)鑒別真?zhèn)斡泻艽蟮木窒扌?不能更全面控制柴胡質(zhì)量。

PCR-RFLP是利用特定的限制性內(nèi)切酶識(shí)別特異性序列將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物消化切割成大小不同的DNA片段,可直接用瓊脂糖凝膠電泳分辨DNA條帶大小及多態(tài)性的方法。現(xiàn)已有文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于PCR-RFLP鑒定中藥材的真?zhèn)舞b別,如大黃[12]、木通[13]、澤瀉[14]、川貝母[15]、人參[16]。PCR-RFLP方法不僅可以用于物種鑒定,還可以用于不同產(chǎn)地的地理鑒別[17]。本試驗(yàn)旨在篩選藏柴胡的限制性內(nèi)切酶,并設(shè)計(jì)引物,對(duì)PCR-RFLP方法優(yōu)化和考查,從而建立適用于快速、穩(wěn)定鑒別北柴胡混偽品藏柴胡的方法。

1 儀器與材料

1.1儀器 VeritiTM96-Well型PCR儀;Legend Micro 21R型高速冷凍離心機(jī);Nano Drop2000型微量核酸定量?jī)x(美國(guó)賽默飛世爾科技公司);Sub Cell?GT型電泳儀(美國(guó)伯樂公司);Geldoc-It2 315型凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)UVP公司)。

1.2試劑 Plant Genomic DNA Kit 200 preps植物基因組DNA提取試劑盒,2×Taq PCR MasterMix,50×TAE[天根生化科技(北京)有限公司],Prime STAR HS Premix,DL500 DNA Marker(TAKARA),Ase Ⅰ限制性內(nèi)切酶(美國(guó)NEB公司),2×Taq PCR StarMix(北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司),瓊脂糖(美國(guó)Invitrogen公司),GelRed (美國(guó)Biotium公司)。

1.3藥材 北柴胡對(duì)照藥材(批號(hào):120992-201509)購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。收集了9批北柴胡和21批藏柴胡的干燥根,經(jīng)甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院宋平順檢驗(yàn)師和馬蕭主任藥師鑒定,具體信息見表1。

2 方法

2.1酶切位點(diǎn)選擇及PCR-RFLP引物設(shè)計(jì) 將GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的北柴胡和藏柴胡的ITS序列利用DNAMAN軟件比對(duì),北柴胡和藏柴胡的ITS序列存在多個(gè)SNP位點(diǎn)變異,藏柴胡有Ase Ⅰ限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)(AT^TAAT),北柴胡無此酶切位點(diǎn)。通過Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)內(nèi)含此酶切位點(diǎn)的鑒別引物BmF-BmR(見表2),送華大基因(北京)有限公司合成。

表2 PCR擴(kuò)增引物序列

2.2基因組DNA提取 取適量藥材用75%乙醇消毒后用滅菌超純水沖洗,晾干,粉碎,稱取藥材粉末約30 mg,置于1.5 mL離心管中,采用植物基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA,加入50 μL洗脫緩沖液,于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化 用 1、7、9、10、13號(hào)樣品對(duì)特異性鑒別引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,為獲得最適特異性PCR反應(yīng)條件,分別考察退火溫度(58、60、62、63 ℃)、循環(huán)數(shù)(25、30、35個(gè)循環(huán))、不同酶(2×Taq PCR StarMix、Prime STAR HS Premix)對(duì)PCR擴(kuò)增的影響。

2.4酶切體系及條件考察 用 1、7、9、10、13號(hào)樣品對(duì)酶切條件進(jìn)行優(yōu)化,分別考察酶切時(shí)間(5、10、15、30和60 min)和酶切底物(6、10和12.5 μL)。

2.5電泳 用2.5%的瓊脂糖電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物,在130 V電壓的條件下電泳約50 min,然后利用凝膠成像分析儀拍照。

3 結(jié)果分析

3.1不同退火溫度考察 分別設(shè)置58,60,62和63 ℃ 4個(gè)退火溫度進(jìn)行考查。退火溫度為60 ℃,擴(kuò)增條帶均清晰可見,無假陽(yáng)性條帶;溫度上升至63 ℃時(shí),不易擴(kuò)增出條帶。因此,為保證PCR具有良好的重復(fù)性,采60 ℃作為此方法的退火溫度。結(jié)果見圖1。

注:A.58 ℃;B.60 ℃;C.62 ℃;D.63 ℃;M.DL500 DNA Marker;空白.空白對(duì)照;1、7、9、10、13分別與樣品信息表中的樣品對(duì)應(yīng)。

3.2不同循環(huán)數(shù)考察 將PCR循環(huán)數(shù)分別設(shè)置為25、30、35個(gè)循環(huán)。25、30個(gè)循環(huán)時(shí),有清晰的擴(kuò)增條帶;當(dāng)35個(gè)循環(huán)時(shí),有假陽(yáng)性條帶出現(xiàn)。因此為保證擴(kuò)增的穩(wěn)定性及區(qū)分度,選擇30個(gè)循環(huán)作為擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)。結(jié)果見圖2。

注:A.25個(gè)循環(huán);B.30個(gè)循環(huán);C.35個(gè)循環(huán);M.DL500 DNA Marker;空白.空白對(duì)照

3.3不同聚合酶考察 除上述方法中使用的聚合酶2×Taq PCR Mastermix外,本試驗(yàn)還考察了2×Taq PCR StarMix酶和Prime STAR HS Premix酶對(duì)該P(yáng)CR擴(kuò)增的影響。PCR反應(yīng)體系為20 μL,包括2×Taq PCR Mastermix 10 μL,正反向引物0.4 μL,DNA模板1 μL,無菌水補(bǔ)足至20 μL;反應(yīng)條件為94 ℃ 3 min,30個(gè)循環(huán)(94 ℃ 30 s,60 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s),72 ℃ 5 min。用不同聚合酶均能擴(kuò)增出單一DNA條帶,說明PCR擴(kuò)增條件適用于不同酶。結(jié)果見圖3。

注:A.2×Taq PCR StarMix;B.Prime STAR HS Premix

3.4酶切體系及條件 考察酶切時(shí)間分別為5、10、15、30及60 min,藏柴胡均能被限制性內(nèi)切酶AseⅠ酶切切割成79 bp和252 bp兩條DNA條帶。隨著酶切反應(yīng)時(shí)間的增長(zhǎng),藏柴胡酶切后的兩條DNA條帶逐漸變亮?？紤]到非特異性擴(kuò)增和酶切后79 bp的DNA條帶不清晰引起的誤判,酶切時(shí)間為1 h。結(jié)果見圖4。

注:A.酶切時(shí)間為5 min;B.酶切時(shí)間為10 min;C.酶切時(shí)間為15 min;D.酶切時(shí)間為30 min;E.酶切時(shí)間為60 min

分別設(shè)置6、10、12.5 μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物梯度,酶切1 h。北柴胡不能被酶切,藏柴胡被酶切成79 bp和252 bp兩條DNA條帶。隨著PCR產(chǎn)物量的增大,酶切后的兩條DNA條帶逐漸變亮。結(jié)果見圖5。

注:A:PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6 μL;B:PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL;C:PCR擴(kuò)增產(chǎn)物12.5 μL

綜上所述,酶切反應(yīng)總體積20 μL,反應(yīng)體系包括10×酶切緩沖液2 μL,限制性內(nèi)切酶Ase Ⅰ (10 U/μL) 0.4 μL,PCR反應(yīng)液10 μL,無菌超純水7.6 μL,酶切反應(yīng)在37 ℃水浴反應(yīng)1 h。

3.5適用性的考察 按照上述PCR-RFLP方法對(duì)北柴胡對(duì)照藥材、9份北柴胡和21份藏柴胡進(jìn)行鑒別。PCR反應(yīng)體系為20 μL,包括2×Taq PCR Mastermix 10 μL,正反向引物0.4 μL,DNA模板1 μL,無菌水補(bǔ)足至20 μL;反應(yīng)條件為94 ℃ 3 min,30個(gè)循環(huán)(94 ℃ 30 s,60 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s),72 ℃ 5 min。結(jié)果表明,北柴胡和藏柴胡均能擴(kuò)增出一條331 bp的單一DNA條帶(圖6A)。用限制性內(nèi)切酶Ase Ⅰ酶切后21份藏柴胡均被酶切成大小不同的兩條條帶,分別為79 bp和252 bp;而北柴胡對(duì)照藥材和北柴胡藥材均不能被酶切(圖6B)。說明該P(yáng)CR-RFLP反應(yīng)方法適用于鑒別藏柴胡。

注:A:PCR擴(kuò)增電泳圖;B:AseⅠ 酶切電泳圖?？瞻?空白對(duì)照;對(duì)照:北柴胡對(duì)照藥材

3.6摻偽檢出限考察 為考察藏柴胡特異性PCR擴(kuò)增對(duì)北柴胡中摻偽藏柴胡的鑒別能力。按0%(北柴胡)、1%、3%、5%、10%、25%、50%、75%、100%(藏柴胡)比例將藏柴胡摻于北柴胡中,充分混勻即可。使用上述PCR-RFLP方法。摻有1%的藏柴胡,酶切后有很淺的條帶;隨著藏柴胡摻入量增加,酶切條帶越來越清晰。結(jié)果見圖7。

圖7 北柴胡中摻假不同比例藏柴胡的PCR-RFLP電泳圖

3.7不同產(chǎn)地?fù)郊衮?yàn)證 取不同產(chǎn)地的北柴胡與藏柴胡,隨機(jī)比例摻兌。所有樣品均能擴(kuò)增出一條331 bp的單一DNA條帶,摻有藏柴胡的混合樣均被酶切成79 bp和252 bp兩條DNA條帶。結(jié)果見圖8。

注:空白.空白對(duì)照;對(duì)照.北柴胡對(duì)照藥材;1.北柴胡(鎮(zhèn)原)摻入藏柴胡(鎮(zhèn)原);2.北柴胡(隴西)摻入藏柴胡(臨洮);3.野生北柴胡(華亭)摻入藏柴胡(鎮(zhèn)原);4.北柴胡(和政)摻入藏柴胡(臨洮)

4 討論

在市場(chǎng)中存在以藏柴胡冒充北柴胡藥材或摻雜混用的現(xiàn)象,這嚴(yán)重影響藥材質(zhì)量、藥效和用藥安全。隨著DNA分子鑒定技術(shù)越來越成熟,可以從基因?qū)用娼鉀Q以化學(xué)成分為主的傳統(tǒng)鑒定帶來的不足,為中藥材鑒定提供更加準(zhǔn)確、可靠的手段。ITS序列是位于核糖體DNA(rDNA)上具有高度重復(fù),各位點(diǎn)間協(xié)同進(jìn)化,可用于屬、種的鑒定。謝暉等[18]通過對(duì)9種柴胡屬植物進(jìn)行ITS序列測(cè)序后同源性比對(duì),結(jié)果發(fā)現(xiàn)柴胡屬屬內(nèi)兩兩比對(duì)同源性均大于88%,同種植物大于99%。Lin等[19]對(duì)柴胡3個(gè)種(柴胡、高氏柴胡、阿爾泰柴胡)設(shè)計(jì)出序列特異性寡核苷酸探針(SSOP),分別和樣品ITS區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物雜交,通過掃描檢測(cè)可鑒定不同種的柴胡。因DNA測(cè)序和DNA芯片技術(shù)制備樣本時(shí)間長(zhǎng)及程序多,該方法在日常檢驗(yàn)中有一定的局限性。PCR-RFLP方法作為DNA鑒定的方法之一,具有簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、專屬性強(qiáng)和反應(yīng)靈敏等優(yōu)勢(shì),在藥用植物鑒定中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。本試驗(yàn)以ITS序列作為分子標(biāo)記,依據(jù)北柴胡和藏柴胡的種間差異,篩選藏柴胡的特異性限制性內(nèi)切酶Ase Ⅰ(AT^TAAT),設(shè)計(jì)含酶切位點(diǎn)的引物,建立了北柴胡藥材及飲片中摻偽藏柴胡的檢查方法。

PCR-RFLP反應(yīng)又受到PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)條件以及酶切時(shí)間等的影響,其中,最重要的是退火溫度、引物濃度和循環(huán)數(shù),引物濃度與退火溫度選擇不好會(huì)造成非特異性擴(kuò)增,出現(xiàn)假陽(yáng)性[20]。在酶切反應(yīng)時(shí),底物濃度也會(huì)影響酶切的效果,當(dāng)?shù)孜餄舛冗^低,可能會(huì)導(dǎo)致酶切后的條帶不清晰,可能會(huì)有一定的誤判。本試驗(yàn)對(duì)該P(yáng)CR擴(kuò)增條件、不同聚合酶、酶切反應(yīng)條件考察,建立了能夠檢測(cè)北柴胡中含1%藏柴胡摻偽檢出限的PCR-RFLP方法。PCR-RFLP方法提高了目的DNA的相對(duì)特異性、靈敏度,極大程度降低了PCR的假陽(yáng)性,保證鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

在歷年抽檢過程中,存在摻雜非藥用部位的問題[21-22]。本試驗(yàn)存在一定的局限性,因是從北柴胡和藏柴胡的基源出發(fā),只能定性的鑒別北柴胡中是否摻有藏柴胡,但對(duì)于是否摻雜北柴胡非藥用部位還有待于解決。但該P(yáng)CR-RFLP方法依然是可用于鑒別北柴胡中摻偽藏柴胡手段之一,可供質(zhì)控部門參考使用。