王銘 馬立旭 王秀萍 韓金榮 徐建虎**

(1.寧夏區(qū)域高發(fā)病中西醫(yī)結(jié)合防治研究重點實驗室,銀川 750004;2.寧夏醫(yī)科大學(xué)回醫(yī)藥現(xiàn)代化教育部重點實驗室,銀川 750004;3.寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院,銀川 750002)

慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)是由于體循環(huán)和肺循環(huán)瘀血從而出現(xiàn)心動過速、呼吸困難、下肢水腫等一系列癥狀[1-2],其中體循環(huán)和肺循環(huán)瘀血導(dǎo)致心臟缺血缺氧是CHF發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)G蛋白偶聯(lián)受體35(G protein-coupled receptor 35,GPR35)是治療心血管疾病的新興靶點[3],抑制GPR35可減輕心肌缺血缺氧損傷[4]。中醫(yī)認(rèn)為心氣虛是CHF發(fā)病的根本,瘀血為發(fā)病的中心環(huán)節(jié),水停為發(fā)病的必然結(jié)果[5-6]?！堵孕牧λソ咧嗅t(yī)診療專家共識》也指出痰飲和瘀血是CHF的病理因素[7]。本研究通過觀察消飲化瘀方對CHF大鼠前體腦鈉肽(N-terminal pro-brain natriuretic peptide,NT-proBNP)及GPR35mRNA的影響,探討其可能作用機制。

1 儀器與材料

1.1儀器 RM2016切片機(上海徠卡儀器有限公司);酶標(biāo)儀(芬蘭公司);洗板機(芬蘭公司);centrifuge5417R低溫高速離心機(Eppendorf公司);BioPhotometer生物分光光度計(Eppendorf公司);DS-Ⅱ核酸蛋白定量儀(美國丹諾爾);CFX Connect熒光定量PCR儀(美國Bio-RAD)。

1.2試藥 消飲化瘀方中所有藥材均購自寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬回醫(yī)中醫(yī)院門診部,經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院中藥教研室檢驗合格;美托洛爾(批號:H32025391,阿斯利康藥業(yè)有限公司);鹽酸阿霉素(批號:S17092,源葉生物公司)。 蘇木素染液(北京百靈威科技有限公司);伊紅染液(源葉生物,R20594);NT-proBNP Elisa試劑盒(上海信裕生物科技有限公司,XYR903292);2*SYBR Mixture 熒光定量試劑盒(北京天根,Cat# FP-205-2);HiFiScriptT 快速去除基因組cDNA第一條鏈合成試劑盒(康為試劑,Cat# CW2582M)。

1.3實驗動物 SPF級SD雄性大鼠,240～260 g,購買于寧夏醫(yī)科大學(xué)動物中心,許可證號:SCXK(京)2019-0008。已通過寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理申請。

2 方法

2.1分組與造模方法 用計算機隨機數(shù)字法將72只大鼠隨機分為空白組和A組,A組參考文獻[8-9]復(fù)制CHF模型,選用2 mg·kg-1的劑量進行腹腔注射阿霉素,每周2次,共6 w。將復(fù)制成功的CHF大鼠隨機分為模型組、消飲化瘀方(簡稱中藥)高劑量組、中藥中劑量組、中藥低劑量組、美托洛爾組,每組12只。

2.2藥物制備及干預(yù) 按照《中國藥典》制劑制備的相關(guān)要求,將消飲化瘀方制成含2 g·mL-1生藥的藥液。給藥劑量按照成人與大鼠體表面積換算,分別給予中藥高(28 g·kg-1)、中(14 g·kg-1)、低(7 g·kg-1)及美托洛爾(10 mg·kg-1)灌胃(高、中、低劑量分別相當(dāng)于成人等效劑量的2倍、1倍、0.5倍),空白組和模型組灌胃給予等量的生理鹽水,每日一次,連續(xù)4 w。

2.3指標(biāo)檢測

2.3.1HE染色觀察心肌組織形態(tài)學(xué)變化 取心肌組織放入4%多聚甲醛固定,經(jīng)沖水、梯度酒精脫水、透明、浸蠟、包埋等步驟后,制成切片,60 ℃烘片 2 h后進行脫蠟、梯度酒精脫水、蘇木精染色、鹽酸酒精分化、伊紅染色、透明、封片。顯微鏡下觀察心肌組織形態(tài)學(xué)變化并拍照。

2.3.2Elisa檢測血清中NT-proBNP含量 腹主動脈采血,4000 r·min-1,離心10 min,吸取上層血清,用酶聯(lián)免疫吸附法檢測各組大鼠血清中NT-proBNP的水平。按照試劑盒使用說明書中操作步驟進行操作。

2.3.3Real Time PCR檢測心肌組織中GPR35mRNA表達水平 用Trizol提取心肌組織中總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,并進行實時熒光定量PCR檢測。將樣品放入實時定量PCR擴增儀中預(yù)變形95 ℃ 15 min后,95 ℃變形10 s、退火30 s、72 ℃延伸30 s,40個循環(huán)。用GPR35mRNA基因引物和β-actin內(nèi)參基因引物進行擴增。同時在60～95 ℃進行溶解曲線分析利用PCR儀繪出擴增曲線,進行結(jié)果分析。見表1。

表1 引物序列

3 結(jié)果

實驗過程中,模型組死亡1只(腹水),美托洛爾組死亡4只(腹水及麻藥過量),中藥低劑量組死亡2只(腹水及灌胃手法操作不當(dāng)),中藥中劑量組死亡1只(灌胃手法操作不當(dāng)),中藥高劑量組死亡2只(灌胃手法操作不當(dāng))。

3.1消飲化瘀方對大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)變化的影響 HE染色結(jié)果顯示:空白組可見心肌細(xì)胞橫紋清楚,排列整齊,無肌纖維斷裂,胞質(zhì)均勻,表明心肌為正常結(jié)構(gòu);模型組可見心肌細(xì)胞排列紊亂,心肌間質(zhì)水腫,肌纖維斷裂,伴有大量的慢性炎癥細(xì)胞浸潤,出現(xiàn)明顯的心肌纖維化特征;各治療組與模型組相比,心肌細(xì)胞排列變整齊,無心肌纖維斷裂。見圖1。

3.2消飲化瘀方對大鼠血清NT-proBNP含量的影響 與空白組相比,模型組NT-proBNP含量明顯升高(P<0.01);治療后,各組NT-proBNP含量均明顯降低(P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠血清NT-proBNP含量的比較

3.3消飲化瘀方對大鼠心肌組織GPR35mRNA表達水平 與空白組相比,模型組GPR35mRNA表達水平明顯升高(P<0.01);治療后各組GPR35mRNA表達水平明顯降低(P<0.01,P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠GPR35mRNA表達水平的比較

4 討論

中醫(yī)并無“心力衰竭”這一病名,近代醫(yī)家認(rèn)為《金匱要略》中記載的“心水”“支飲”與CHF的癥狀十分相近,認(rèn)為水飲是導(dǎo)致心衰發(fā)生的關(guān)鍵。唐宗海的《血證論》中提出“血病不離乎水,水病不離乎血”的觀點,認(rèn)為水飲和瘀血之關(guān)系密切。治法上根據(jù)“病痰飲者,當(dāng)以溫藥和之”的治療原則及《經(jīng)方例釋》曰“葶藶本治心水,故《千金》十水丸,用以治赤水之從心腫者”。故選用的消飲化瘀方是以經(jīng)方苓桂術(shù)甘湯合葶藶大棗瀉肺湯為主方,加丹參、川芎、葛根組成,以化飲為主,兼以活血。2014年《慢性心力衰竭中醫(yī)診療專家共識》中也同樣指出活血化痰利水的治法[7]。史君等[10]將近20年CHF的臨床用藥規(guī)律進行分析,發(fā)現(xiàn)也是以益氣、活血、利水的藥物為主。說明消飲化瘀方與近代醫(yī)家思路是一致的。

NT-proBNP主要由心室肌細(xì)胞釋放,主要生理功能是舒張血管、利尿、抑制腎素-血管緊張素-醛固酮(RAA)和交感神經(jīng)系統(tǒng)[11]。在CHF發(fā)生時,心臟內(nèi)壓力增高,NT-proBNP的分泌和合成增多,所以NT-proBNP的濃度反應(yīng)了心衰的嚴(yán)重程度。在本研究中模型組的NT-proBNP含量明顯高于空白組,提示CHF大鼠模型復(fù)制成功。治療后各組NT-proBNP含量明顯下降,提示消飲化瘀方能夠有效改善CHF。這可能與消飲化瘀方利尿、擴張血管的功能密不可分?，F(xiàn)代藥理學(xué)表明葶藶子有強心、利尿、拮抗腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)等作用[12]。苓桂術(shù)甘湯合葶藶大棗瀉肺湯具有調(diào)節(jié)水液代謝的作用[13-14]。葛根、丹參、桂枝等藥具有擴張血管的作用[15-17]。

G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)是最大和最多的基因家族之一,并構(gòu)成最大的受體家族,很多臨床藥物都是通過此類受體來發(fā)揮作用[18]。GPR35是一種孤兒受體(尚未被內(nèi)源性配體激活的受體),近年來被發(fā)現(xiàn)與心血管疾病關(guān)系密切,可作為治療心血管疾病的新興靶點[19]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)GPR35的基因表達在人類衰竭的心肌中增加,認(rèn)為可以將GPR35基因用于診斷心力衰竭,并作為治療心力衰竭的可能藥物靶點[20]。Ronkainen VP等[21]研究認(rèn)為GPR35是一種新型的缺氧敏感基因,缺氧誘導(dǎo)因子 1 (HIF-1) 激活誘導(dǎo)GPR35過表達,導(dǎo)致肌動蛋白細(xì)胞骨架的排列,使心肌細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)變化,從而介導(dǎo)心肌重塑。同時發(fā)現(xiàn)GPR35在缺氧導(dǎo)致壓力負(fù)荷引起的心臟肥大、心肌梗死急性期及小鼠心衰模型中明顯升高。賀磊[4]等研究發(fā)現(xiàn)使用GPR35活性抑制劑(CID2745678)能夠抑制低氧環(huán)境導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡,改善心肌梗死后的心肌重構(gòu)。這些研究提示心肌缺血缺氧是導(dǎo)致GPR35上調(diào)的一個主要因素,在CHF的發(fā)病中起著重要作用。

不同的心血管疾病都存在一定程度的缺血缺氧[22-24]。我們認(rèn)為CHF的缺血缺氧與水飲、血瘀有密切關(guān)系?！端貑枴ゐ粽摗吩?“心主身之血脈?！毙呐K健康,心氣旺盛,血脈充盈,心主血脈功能正常,將血中的營養(yǎng)物質(zhì)供給周身組織器官。反之,心臟受損,心主血脈功能失常,心陽不足,推動無力,則血行瘀阻;心陽不足,坐鎮(zhèn)無權(quán),不能鎮(zhèn)攝寒水,則水飲邪氣乘虛上逆凌心;心臟受損,水谷精微貫注心脈,不能順利化赤為血,則致心血不足。血行瘀阻、水飲內(nèi)停,阻滯了氣血的運行,則心肌組織缺血缺氧,缺血缺氧又進一步加重了瘀血和水飲在體內(nèi)的聚集,所以缺血缺氧與水飲瘀血形成一個惡性循環(huán)。在本研究中苓桂術(shù)甘湯合葶藶大棗瀉肺湯消除了水飲,丹參、川芎、葛根祛除了瘀血,使氣血運行通常,改善了心臟缺血缺氧的狀態(tài)?，F(xiàn)代藥理研究證實丹參、葛根具有改善血液循環(huán),抗心肌缺血缺氧的作用[25]。結(jié)合本研究結(jié)果,治療后各組GPR35mRNA表達水平明顯降低,提示消飲化瘀方可能是通過抑制GPR35表達,改善心肌缺血缺氧,從而防治CHF。