劉永宇 ，夏敏，唐園慧，汪詩琪，駱志國

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)十堰市太和醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，湖北 十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院十堰市太和醫(yī)院 腫瘤防治中心，湖北 十堰 442000；3.武漢市人民醫(yī)院 腫瘤科，湖北 武漢 430000；4.湖北醫(yī)藥學(xué)院研究生院，湖北 十堰 442000；5.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院十堰市太和醫(yī)院 腎內(nèi)科，湖北 十堰 442000 ）

食管癌作為較常見的消化道腫瘤之一，其死亡率在所有腫瘤中排在第6 位，約90%病理類型為鱗狀細(xì)胞癌［1］，多數(shù)病人通過檢查發(fā)現(xiàn)病變往往已處于晚期階段，失去手術(shù)機(jī)會，遠(yuǎn)期預(yù)后較差。放射治療在食管癌的綜合治療中扮演著重要的角色，能夠顯著減輕患者痛苦，提高生活質(zhì)量［2］。盡管目前放療發(fā)展迅速，但放射抵抗往往使放療的效果不盡人意，容易導(dǎo)致局部腫瘤復(fù)發(fā)和治療失敗［3］。因此，迫切需要找尋食管癌放射抵抗的生物學(xué)標(biāo)志物及提高放射敏感性的靶點(diǎn)。

糖基化是普遍的翻譯后修飾并深刻影響蛋白質(zhì)的功能，參與體內(nèi)的許多生物學(xué)過程［4］。已有研究認(rèn)為異常糖基化既與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)，又能促進(jìn)癌細(xì)胞放射抵抗，例如：小細(xì)胞肺癌［5］、前列腺癌［6］和神經(jīng)膠質(zhì)瘤［7］等。α-1,6 巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（FUT8）可通過形成α-1,6 糖苷鍵將GDP巖藻糖轉(zhuǎn)移至N-糖鏈核心結(jié)構(gòu)，組成核心巖藻糖［8］，有研究發(fā)現(xiàn)FUT8 參與調(diào)控多種腫瘤細(xì)胞功能［9］，但其對食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）細(xì)胞的放射抵抗的影響尚不清楚。本研究通過生物信息學(xué)手段和細(xì)胞學(xué)實(shí)驗探討FUT8 與食管癌放療敏感性的關(guān)系，針對提高食管癌臨床放射治療效果提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗材料

胎牛血清、1640 培養(yǎng)基，美國Gibco 公司；GADPH 抗體、FUT8 抗體、HRP-標(biāo)記Ⅱ；美國Abcam 公司，F(xiàn)UT8 過表達(dá)及敲低序列，中國上海吉瑪公司；蛋白裂解液、蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、細(xì)胞周期試劑盒、細(xì)胞凋亡試劑盒均，中國碧云天生物技術(shù)研究所；流式細(xì)胞儀，美國BD 公司；凝膠成像系統(tǒng)；美國Bio-Rad公司；人ESCC 細(xì)胞株KYSE，中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 數(shù)據(jù)庫分析 Oncomine 數(shù)據(jù)庫（http：//www.oncomine.org/）設(shè)置的數(shù)據(jù)提取條件為：①“腫瘤類型：Esophagus Cancer”；②“基因：FUT8”；③“數(shù)據(jù)類型：mRNA”；④“分析類型：Cancervs.Normal Analysis”；⑤臨界值設(shè)定條件（P-value＜0.05,fold change＞1.5,gene rank=top10%），選擇柱狀圖為展示結(jié)果。GEPIA 數(shù)據(jù)庫（http：//gepia.cancer-pku.cn/detail.php）在“表達(dá)”菜單中輸入“FUT8”，選擇“食管癌”進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。Strin 數(shù)據(jù)庫（www.string.or）設(shè)定的篩選條件如下：①“Protein Name：FUT8”；②“Organism：Homo sapiens”。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人ESCC 細(xì)胞株KYSE 購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，利用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)箱設(shè)置溫度37℃，CO2濃度5%，濕度95%，2～3 d 更換一次培養(yǎng)液，電子顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁生長至80%時，進(jìn)行胰酶消化傳代。

1.2.3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的構(gòu)建 采集生長狀態(tài)較好的KYSE 細(xì)胞，胰酶消化制備細(xì)胞懸液，接種在6 孔板上，細(xì)胞密度調(diào)整為2×105個/mL，根據(jù)Lipofectamine 3000 的操作指令，分別對表達(dá)組KYSE FUT8 及KYSE NC，敲低組KYSE shFUT8 及KYSE shNC 進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別在轉(zhuǎn)染48 h、72 h 后用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞發(fā)光情況，以便對生長和轉(zhuǎn)染效果進(jìn)行評價，后在嘌呤霉素中繼續(xù)篩選1周，為開展后續(xù)試驗提供穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。

1.2.4 蛋白提取及Western blot 檢測 采集轉(zhuǎn)染后生長狀況良好KYSE 細(xì)胞，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）搖晃洗滌兩次，添加裂解緩沖液，置于冰上裂解30 min，離心機(jī)設(shè)置4℃、12 000 r/min、離心10 min 取上清液，用BCA 法測定每個樣品的蛋白含量。每種蛋白取50 μg 樣品，行10%SDSPAGE 電泳，儀器設(shè)置80 V 恒壓30 min，120 V 恒壓50 min，使蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，用脫脂奶粉配比封閉液，常溫條件下封閉2 h，按比例配一抗（FUT8 1∶1 500、GADPH 1∶1 000），加入一抗后在4℃的冰箱中冷藏1 晚，次日用TBST 緩沖液洗滌3 遍，每遍5 min，配比二抗羊抗兔IgGHRP（1∶1 000）、羊抗鼠IgG-HRP（1∶1 000），加入二抗后置于搖床，室溫孵育2 h，TBST 緩沖液洗滌3 遍，每遍5 min，ECL 上機(jī)曝光顯影。采用ImagePro Plus 6.0 圖像分析軟件得出灰度值，通過將內(nèi)參蛋白與目的蛋白兩者灰度值相比得出目的蛋白的表達(dá)量，繪制柱狀圖。

1.2.5 克隆形成實(shí)驗 將生長狀態(tài)良好的KYSE細(xì)胞進(jìn)行分組，以過表達(dá)的KYSE FUT8 細(xì)胞為實(shí)驗組，以NC 為陰性對照組；以敲低表達(dá)的KYSE shFUT8 細(xì)胞為實(shí)驗組，以shNC 為陰性對照組，各組細(xì)胞制備細(xì)胞懸液后，在電子顯微鏡下計數(shù)，每孔取適當(dāng)數(shù)量在6 孔板中均勻接種，每組重復(fù)3個復(fù)孔，給予6 Gy 劑量的X 線對接種后的6 孔板進(jìn)行照射，繼續(xù)培養(yǎng)兩周，細(xì)胞培養(yǎng)期間，需常觀察，培養(yǎng)完成后，取出各組6 孔板，棄去原培養(yǎng)基，PBS 搖晃洗滌2 次，自然晾干，4%多聚甲醇固定時間為15 min，棄去固定液，將0.1%結(jié)晶紫加入6 孔板，20 min 后回收結(jié)晶紫染料，洗凈自然晾干，對各孔存活細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行鏡下統(tǒng)計并拍照記錄，將細(xì)胞存活數(shù)作為縱坐標(biāo)，以照射劑量為橫坐標(biāo)，繪制畫柱狀圖。

1.2.6 細(xì)胞凋亡實(shí)驗 將生長狀態(tài)良好的KYSE細(xì)胞進(jìn)行分組，以過表達(dá)的KYSE FUT8 細(xì)胞為實(shí)驗組，以NC 為陰性對照組；以敲低的KYSE shFUT8 細(xì)胞為實(shí)驗組，以shNC 為陰性對照組，在顯微鏡下觀察，待細(xì)胞貼壁生長至80%，給予6 Gy 劑量的X 線照射，培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，取出培養(yǎng)瓶收集細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，依據(jù)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒操作說明，依次采用Annexin V/PI雙染，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡，得出各組細(xì)胞凋亡率，繪制柱狀圖。

1.2.7 細(xì)胞周期實(shí)驗 將生長狀態(tài)良好的KYSE細(xì)胞進(jìn)行分組，以過表達(dá)的KYSE FUT8 細(xì)胞為實(shí)驗組，以NC 為陰性對照組；以敲低的KYSE shFUT8 細(xì)胞為實(shí)驗組，以shNC 為陰性對照組，在顯微鏡下觀察，待細(xì)胞貼壁生長至80%，給予6 Gy 劑量的X 線照射，培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，取出培養(yǎng)瓶收集細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，70%的冷乙醇固定，置于4℃冰箱過夜，次日棄去固定液，PBS 搖晃洗滌3 遍，依據(jù)細(xì)胞周期檢測試劑盒操作說明，加入配置好的工作液，采用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測細(xì)胞周期，Modfit4.1 得出各組G2/M 期細(xì)胞阻滯情況，繪制柱狀圖。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用配對樣本t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FUT8 在臨床常見腫瘤中的表達(dá)

在Oncomine 數(shù)據(jù)庫，共收集到356 篇不同種類的研究成果。有52 項研究發(fā)現(xiàn)FUT8 表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，12 項研究表明FUT8 表達(dá)下降，表達(dá)增高有40 例（圖1A）。2005 年后，5 篇研究主要關(guān)注ESCC 及正常食管組織FUT8 的表達(dá)情況，共382 個樣本，文章分別發(fā)表于BMC Genomics，PLoS One，Cancer Res，Clin Cancer Res，Oncogene 等雜志。在上述5 項研究結(jié)果的中，F(xiàn)UT8 在ESCC 組織中較正常食管組織顯著高表達(dá)，中位數(shù)值排名為298.0，P=6.19e-4，表明其表達(dá)升高，并且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖1B）。對其中Hu Esophagus 和Su Esophagus 的研究數(shù)據(jù)分析顯示：與正常組織相比，F(xiàn)UT8 在ESCC 組織中的表達(dá)明顯增高（P＜0.05，圖1C）。GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)：FUT8 在食管癌中顯著高表達(dá)（P＜0.05，圖1D）。

圖1 生物信息學(xué)分析FUT8 在ESCC 組織中的表達(dá)

2.2 預(yù)測FUT8 基因在ESCC 中的變化及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

利用String 數(shù)據(jù)庫，以FUT8 為核心分析FUT8互作蛋白網(wǎng)絡(luò)（PPI），P＜1.94e-11，節(jié)點(diǎn)數(shù)為10個，在PPI 網(wǎng)絡(luò)中與FUT8 相互作用（P均＜0.05）的有 FUT6、MGAT2、MGAT4A、MGAT4B、MGAT4D、MGAT5、B4GALT1、B4GALT2、B4GALT3，涉及的主要生物學(xué)過程包括糖蛋白生物合成、蛋白折疊、免疫抵抗等，見圖2。

圖2 基于String 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建FUT8 相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)

2.3 FUT8 過表達(dá)及敲低細(xì)胞模型的構(gòu)建

為了探索FUT8 對ESCC 細(xì)胞放射敏感性的調(diào)控作用，采用慢病毒感染技術(shù)將帶有熒光蛋白的FUT8 過表達(dá)質(zhì)粒和配對的陰性對照組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至ESCC 細(xì)胞KYSE 中，也將帶有熒光蛋白的敲低FUT8 表達(dá)的質(zhì)粒及配對陰性對照組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至ESCC 細(xì)胞KYSE 中，通過觀察鏡下熒光蛋白的表現(xiàn)，判斷轉(zhuǎn)染效果（圖3）。經(jīng)嘌呤霉素篩選得到FUT8 穩(wěn)定過表達(dá)及敲低的ESCC 細(xì)胞株。Western blot 驗證轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞FUT8 的表達(dá)差異。結(jié)果表明：在轉(zhuǎn)染了FUT8 過表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞株中，F(xiàn)UT8 的表達(dá)量顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），在轉(zhuǎn)染了敲低FUT8 表達(dá)的質(zhì)粒后，F(xiàn)UT8 的表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖4）。

圖4 穩(wěn)定細(xì)胞系FUT8 過表達(dá)及敲低水平蛋白印跡檢測

2.4 調(diào)節(jié)FUT8 對ESCC 細(xì)胞放射抵抗的影響

為了探索ESCC 細(xì)胞中FUT8 表達(dá)量與放射抗拒之間的關(guān)系，首先將FUT8 過表達(dá)及陰性對照組、敲低及陰性對照組KYSE 細(xì)胞依次給予0 Gy、6 Gy 劑量X 線照射，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，通過流式細(xì)胞術(shù)和克隆形成試驗檢測FUT8 表達(dá)量的變化對細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期和克隆形成能力造成的影響。

給予6 Gy 劑量X 線照射后，KYSE NC 組、KYSE FUT8 組細(xì)胞調(diào)亡率分別為（3.12±1.32）%、（2.07±0.87）%，F(xiàn)UT8 過表達(dá)組ESCC 細(xì)胞的調(diào)亡率較陰性對照組顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0007，圖 5A）；KYSE shNC 組、KYSE shFUT8 組細(xì)胞凋亡率分別為（17.71±1.63）%、（23.86±2.52）%，F(xiàn)UT8 敲低組ESCC 細(xì)胞的調(diào)亡率較陰性對照組顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0054，圖5B）。

圖5 細(xì)胞凋亡實(shí)驗檢測FUT8 表達(dá)量的變化對ESCC 細(xì)胞放射敏感性的影響

A：過表達(dá)FUT8 的陰性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至KYSE 細(xì)胞后鏡下熒光成像（20×）；B：過表達(dá)FUT8 的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至KYSE 細(xì)胞后鏡下熒光成像（10×）；C：敲低FUT8表達(dá)的陰性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至KYSE細(xì)胞后鏡下熒光成像（4×）；D：敲低FUT8表達(dá)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至KYSE細(xì)胞后鏡下熒光成像（10×）。

給予KYSE FUT8 組、KYSE NC 組細(xì)胞6 Gy劑量的X 線照射后，G2/M 期阻滯細(xì)胞占比情況分別是（34.29±0.47）%、（21.97±0.58）%，提示與對照組相比，F(xiàn)UT8 過表達(dá)組ESCC 細(xì)胞的G2/M期細(xì)胞比例顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0004,圖6A）；而在KYSE shNC 組、KYSEshFUT8 組細(xì)胞中，G2/M 期阻滯細(xì)胞占比情況分別是（32.56±0.27）%、（41.61±2.97）%，提示與對照組相比，F(xiàn)UT8 敲低組ESCC 細(xì)胞的G2/M 期細(xì)胞比例顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0004，圖6B）。

圖6 細(xì)胞周期實(shí)驗檢測FUT8 表達(dá)量的變化對ESCC 細(xì)胞放射敏感性的影響

KYSE FUT8 組、KYSE NC 組細(xì)胞經(jīng)6 Gy 劑量的X 線照射后，繼續(xù)培養(yǎng)2 周，電子顯微鏡下計數(shù)克隆形成細(xì)胞數(shù)目分別是（43.12±1.74）、（25.05±1.52），對比陰性對照組，F(xiàn)UT8 過表達(dá)組ESCC 細(xì)胞的克隆形成細(xì)胞數(shù)顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0005，圖7A）；KYSE shFUT8 組、KYSE shNC 組細(xì)胞中克隆形成細(xì)胞數(shù)目分別為（23.15±1.32）、（41.05±1.83），對比陰性對照組，F(xiàn)UT8 敲低組ESCC 細(xì)胞的克隆形成細(xì)胞數(shù)顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0005，圖7B）。

圖7 克隆形成實(shí)驗檢測FUT8 表達(dá)量的變化對ESCC 細(xì)胞放射敏感性的影響

3 討論

放射治療作為食管癌綜合治療中的主要手段之一，治療效果會因瘤體對輻射的敏感性下降而不盡人意［10］。國內(nèi)外對食管癌放射抵抗機(jī)制做出了大量研究，例如有環(huán)氧化酶［11］、信號轉(zhuǎn)錄激活因子3［12］、X 線修復(fù)交叉互補(bǔ)基因［13］等，均為解決食管癌放療相關(guān)臨床問題提供了幫助。

糖基化是普遍的翻譯后修飾的過程，且對蛋白質(zhì)的功能有重要影響，研究表明，糖基化在腫瘤細(xì)胞的放射抵抗中能起到重要的調(diào)控作用，目前己被證實(shí)的分子有糖基轉(zhuǎn)移酶C1GALT1［14］、AGL3［15］、GnT-Vl［16］等。糖基轉(zhuǎn)移酶FUT8 可將GDP 巖藻糖轉(zhuǎn)移至N-糖鏈核心結(jié)構(gòu)，從而構(gòu)成核心巖藻糖，對糖蛋白加工修飾，并調(diào)控其生物功能。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在甲狀腺乳頭狀癌中FUT8 的高表達(dá)與腫瘤的大小、轉(zhuǎn)移、分化程度有著必然聯(lián)系［17］；在胰腺癌中FUT8 高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)大量的巖藻糖基化的觸珠蛋白［18］；在直結(jié)腸癌研究中，F(xiàn)UT8 介導(dǎo)的核心巖藻糖基化能夠調(diào)節(jié)E-鈣黏蛋白狀態(tài)得到證實(shí)［19］。這些研究幫助筆者進(jìn)一步了解了FUT8 在腫瘤細(xì)胞發(fā)展過程中的作用，但是對食管癌放射抵抗的影響尚不清楚。

為探索FUT8 對ESCC 細(xì)胞放射敏感性的影響。在本研究中，筆者通過體外實(shí)驗采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)將ESCC 細(xì)胞KYSE 分別進(jìn)行FUT8 的過表達(dá)和敲低，經(jīng)X 射線處理后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)和克隆形成實(shí)驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：FUT8 過表達(dá)組的ESCC 細(xì)胞凋亡率呈下降趨勢，阻滯在G2/M 期的細(xì)胞比例下降，克隆形成能力增強(qiáng)。而FUT8 敲低組的ESCC 細(xì)胞凋亡率呈上升趨勢，阻滯在G2/M期的細(xì)胞比例增高，克隆形成能力減弱。因此，筆者得出結(jié)論：FUT8 過表達(dá)可以降低ESCC 細(xì)胞放射敏感性，敲低FUT8 表達(dá)可以增強(qiáng)ESCC 細(xì)胞放射敏感性。

綜上所述，糖基轉(zhuǎn)移酶FUT8 參與調(diào)控ESCC細(xì)胞放射的產(chǎn)生過程，可能成為解決食管癌放射抗拒問題的潛在靶點(diǎn)。然而在本研究中僅在一種食管癌細(xì)胞系中得到驗證，下一步研究仍需在更多的細(xì)胞系中驗證并探究具體通路分子機(jī)制。