馮奕晨

（蘭州大學(xué) 口腔醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730030 ）

口腔黏膜下纖維化（oral submucous fibrosis,OSF）是一種常見口腔癌前病變，臨床上的癥狀包括灼痛、口干、吞咽困難、進(jìn)行性張口受限等。不同地區(qū)OSF 的發(fā)病率有明顯差異，一般于0.04%～24.40%不等。而在南臺(tái)灣的土著居民中，咀嚼檳榔物的流行率約為69.5%［1］。在口腔癌患者中，口腔癌常與OSF 纖維性變并存［2］。OSF 在我國(guó)內(nèi)陸地區(qū)主要發(fā)生于湖南、海南及臺(tái)灣等地，與當(dāng)?shù)鼐用裆铒嬍沉?xí)慣密切相關(guān)。謝賽飛等［3］近期就曾發(fā)表過中藥藥方通過Wnt/β-catenin 信號(hào)通路對(duì)OSF 的調(diào)控作用研究。盡管如此，OSF 的致癌率仍趨于高發(fā)，且臨床缺乏有效控制手段，尚未見檳榔致OSF 的具體機(jī)制研究。

檳榔是棕櫚科檳榔的種子，全世界檳榔咀嚼者約6 億～12 億［4］。經(jīng)常咀嚼含煙草的檳榔制品與諸如OSF、白斑等口腔癌前病變的發(fā)生之間的關(guān)系已經(jīng)得到肯定。檳榔堿是檳榔的活性成分，具有毒性，在從檳榔分離出的生物堿中含量最高。此外，從檳榔分離出的生物堿還包括少量去甲基檳榔次堿和檳榔次堿及含量更少的檳榔副堿、異去甲基檳榔次堿和去甲基檳榔堿等。檳榔堿是強(qiáng)堿性油狀液體，無色無臭，易溶于水、酒精及部分有機(jī)溶劑，能隨水蒸氣揮發(fā)［5］。

通過建立新型“疾病-基因-靶點(diǎn)-藥物”協(xié)同研究網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從整體的角度揭示藥物對(duì)機(jī)體的復(fù)雜作用和藥物對(duì)疾病的干預(yù)機(jī)制［6］。該方法所具有的系統(tǒng)性恰好契合生物提取物作用的協(xié)同性、整體性等特點(diǎn)［7］。近年來，口腔領(lǐng)域研究也逐漸應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理分析方法探討相關(guān)機(jī)制。顧磊等［8］應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)了白花蛇舌草中353 個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)25 條相關(guān)作用通路與口腔癌治療密切相關(guān)，功能方面則證實(shí)白花蛇舌草與口腔癌的細(xì)胞凋亡，增殖，炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激等多個(gè)生物過呈密切相關(guān)。本研究旨在通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出檳榔促進(jìn)OSF 的主要有效成分、潛在的復(fù)雜關(guān)系網(wǎng)絡(luò)和主要的作用核心靶點(diǎn)，為揭示檳榔致病機(jī)制提供科學(xué)參考，為探究OSF 癌變的預(yù)防和靶向治療提供新途徑和可靠理論基礎(chǔ)。

1 方法

1.1 篩選活性成分

以“Arecae Semen”（檳榔）為關(guān)鍵詞在中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.Php）進(jìn)行查找。隨后設(shè)置參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)為藥物相似性（DL）≥0.18，口服生物利用度（OB）≥30%，對(duì)檳榔的活性成分展開篩選。

1.2 篩選靶點(diǎn)

1.2.1 預(yù)測(cè)檳榔活性成分的靶點(diǎn) 經(jīng)過與靶點(diǎn)的相互作用，藥物活性成分才能夠發(fā)揮其生物功能，于是本研究采用TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)查找檳榔活性成分潛在的作用靶點(diǎn)，接著采用SwissTargetPrediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)結(jié)果開展標(biāo)準(zhǔn)化匹配。

1.2.2 篩選OSF 靶點(diǎn) 本研究通過在DisGeNET（https：//www.disgenet.org/）、GeneCards（https：//www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)中輸入“oral submucous fibrosis”來得到有關(guān)的非重復(fù)靶點(diǎn)。

1.2.3 分析OSF 相關(guān)的藥物活性成分靶點(diǎn) 將藥物活性成分相關(guān)靶點(diǎn)與疾病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行比較，取交集，最后得到OSF 相關(guān)的藥物活性成分靶點(diǎn)，待后續(xù)討論分析。

1.3 建立蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)和成分-靶點(diǎn)（C-T）網(wǎng)絡(luò)

1.3.1 PPI 網(wǎng)絡(luò) 借助String 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/），探究OSF 相關(guān)的藥物活性成分靶點(diǎn)，建立靶點(diǎn)蛋白間的互做網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。隨后，通過對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖的拓?fù)浞治錾钊胙芯亢诵陌悬c(diǎn)，詳見材料方法“1.4”項(xiàng)。

1.3.2 C-T 網(wǎng)絡(luò) 采用Cytoscape 3.8.2 軟件將藥物活性成分與核心靶點(diǎn)進(jìn)行聯(lián)系，建立藥物活性成分與核心靶點(diǎn)的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，再進(jìn)一步探究起主要作用的藥物活性成分。

1.4 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?/h3>

打開Cytoscape 3.8.2 軟件并導(dǎo)入材料方法“1.3”項(xiàng)建構(gòu)的PPI 網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果，根據(jù)“度”“度介中心度”和“接近中心度”這三個(gè)主要參數(shù)對(duì)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，再篩選其中的核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.5 GO 和KEGG 富集分析

登陸DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/），導(dǎo)入疾病相關(guān)的藥物活性成分靶點(diǎn)，對(duì)其進(jìn)行GO 與KEGG 富集分析。隨后將前20 個(gè)GO/KEGG 結(jié)果歸類展示。信號(hào)通路中各種靶點(diǎn)與相關(guān)藥物成分的藥理作用關(guān)系越密切，則結(jié)果顯示的FDR 數(shù)值越高。

2 結(jié)果

2.1 活性成分

TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中可以檢索到52 個(gè)與檳榔相關(guān)的化合物成分。按照DL≥0.18 以及OB≥30%的參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，最終篩選出5 個(gè)活性成分。見表1。

表1 檳榔相關(guān)活性成分

2.2 靶點(diǎn)的篩選

依據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)的相似性篩選5 個(gè)檳榔活性成分靶點(diǎn)，共得到213 個(gè)活性成分相關(guān)的靶點(diǎn)。在GeneCards 和DisGeNET2 數(shù)據(jù)庫(kù)中得到與OSF 有關(guān)的疾病靶基因，再通過整合數(shù)據(jù)庫(kù)除去重復(fù)靶點(diǎn)，最終得到596 個(gè)OSF 的相關(guān)靶點(diǎn)。然后通過對(duì)疾病靶點(diǎn)與藥物活性成分靶點(diǎn)的結(jié)果取交集，得到31 個(gè)OSF 相關(guān)的藥物活性成分靶點(diǎn)（見圖1），待后續(xù)進(jìn)行分析。

圖1 藥物-疾病交集基因

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)和核心靶點(diǎn)分析

為了更好地理解檳榔對(duì)OSF 的作用機(jī)制，借助String 數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，再把PPI 網(wǎng)絡(luò)上傳至Cytoscape3.8.2 軟件，繪制互作網(wǎng)絡(luò)圖（見圖2）。31 個(gè)核心靶點(diǎn)分別為TERT、TP53、MMP2、MMP9、VEGFA、PTGS2、EGFR、HIF1A、ACE、KIT、MMP3、MDM2、MPI、BCL2、MAPK1、KRAS、MMP8、MAP2K1 等（見圖3）。

圖2 核心基因網(wǎng)絡(luò)互作圖

圖3 PPI 對(duì)接圖

2.4 GO 功能富集

GO 功能富集獲得檳榔作用生物學(xué)過程，根據(jù)FDR≤0.01 的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選后對(duì)前20 條顯著的生物學(xué)功能進(jìn)行做圖展示，主要包括細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖和炎癥反應(yīng)4 個(gè)方面（見圖4）。具體涉及的功能包括：①細(xì)胞對(duì)缺氧的反應(yīng)；②基因表達(dá)的正向調(diào)控；③MAPK 級(jí)聯(lián)正調(diào)控［9-10］；④細(xì)胞外基質(zhì)分解?；谝陨? 個(gè)主要方面可以看出，檳榔對(duì)OSF 促進(jìn)作用可能是一個(gè)復(fù)雜的多途徑協(xié)同作用的結(jié)果。

2.5 KEGG 通路富集

KEGG 通路富集能對(duì)已篩選出的31 個(gè)靶點(diǎn)開展分析，其目的是揭示檳榔對(duì)OSF 的潛在促進(jìn)作用機(jī)制。本研究根據(jù)FDR≤0.01 的標(biāo)準(zhǔn)，篩選得到KEGG 信號(hào)通路。其中前20 條中跟癌癥有關(guān)的信號(hào)通路涉及：①內(nèi)分泌代謝；②中樞代謝；③PI3K-Akt［11-13］等（見圖5）。

圖5 KEGG 基因通路富集分析

3 討論

其中多個(gè)基因與口腔癌前病變的惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，如原癌基因MDM2 已被證實(shí)與OSF 的癌變過程相關(guān)聯(lián)，尹曉敏等［14］通過免疫組織化學(xué)法檢測(cè)對(duì)比OSF 組織、OSF 癌變組織及正?？谇火つそM織中MDM2 蛋白的表達(dá)及分布發(fā)現(xiàn)，MDM2蛋白在正常口腔黏膜中呈陰性表達(dá)，在OSF 及OSF 癌變組織中陽(yáng)性表達(dá)率逐漸增加，OSF 組及OSF 癌變組織組顯著高于正常對(duì)照組。

基因靶點(diǎn)MMP-2/-9 是癌細(xì)胞遷移和入侵所必需的，在癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移（遷移和入侵）中具有重要作用。PENG 等［15］發(fā)現(xiàn)石榴提取物（POMx）可以抑制口腔癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移?；诳谇话〩SC-3 和Ca9-22 細(xì)胞的酶圖和MMP-2/-9 的Western 印跡分析，口腔癌細(xì)胞的POMx 抑制性遷移可以通過MMP-2/-9 的失活來實(shí)現(xiàn)。這表明MMP-2/-9 的表達(dá)是口腔癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要影響因素之一。

人類癌癥中最常發(fā)生突變的基因是p53（TP53）。李懷奇等［16］采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)HPV16E6 和p53 在不同組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)p53 在口腔癌中的陽(yáng)性表達(dá)率為23.7%，在癌前病變中的陽(yáng)性表達(dá)率為57.1%，在癌周正常組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為89.9%，口腔癌中p53 的陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于癌前病變與癌周正常組織。得到結(jié)論：p53 基因的表達(dá)抑制在癌癥病變的過程中具有重要意義。

基于KEGG 通路富集分析可知，PI3K-Akt 是口腔癌的發(fā)生發(fā)展的重要干預(yù)通路，多個(gè)研究亦證實(shí)其作為關(guān)鍵靶點(diǎn)的意義及價(jià)值。王璞等［17］探討細(xì)胞周期蛋白B1 基因?qū)谇话┰鲋?，侵襲和遷移的影響及作用機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)敲低細(xì)胞周期蛋白B1 表達(dá)的細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力及MMP-2、MMP-9、PI3K、p-Akt 蛋白表達(dá)均明顯低于對(duì)照組（P＜0.05），兩組間Akt 蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。獲得結(jié)論：口腔癌的干預(yù)和發(fā)展的作用機(jī)制可能與抑制PI3K/Akt 信號(hào)通路的激活有關(guān)。

綜上所述，OSF 是一種口腔潛在惡性疾患，這意味著患者需要長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展情況，進(jìn)行定期隨訪以預(yù)防癌變的發(fā)生，或盡早發(fā)現(xiàn)癌變和治療癌變。患者初診時(shí)須根據(jù)病變范圍、嚴(yán)重程度等因素選擇適宜部位取活檢，明確組織病理學(xué)診斷，對(duì)于伴發(fā)口腔鱗狀細(xì)胞癌者應(yīng)早期采取外科治療。綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的模式，預(yù)測(cè)了檳榔的活性成分及相應(yīng)的作用靶點(diǎn)，對(duì)其促進(jìn)誘導(dǎo)OSF 轉(zhuǎn)化成癌的潛在分子機(jī)制進(jìn)行了分析。檳榔對(duì)OSF 的作用是多靶點(diǎn)、多途徑、多化合物共同作用的結(jié)果。將來的研究中，本人會(huì)更深入探究檳榔中不同化學(xué)成分的代謝機(jī)制和相互協(xié)同作用，為揭示檳榔致病機(jī)制提供科學(xué)的參考，為治療OSF 疾病提供可靠的理論基礎(chǔ)。