胡超揚(yáng), 曹曉華, 劉格良, 2, 李 淵, 2, 齊榮暄, 2,張 豪, 于 琦, 2, 孫 焱

(1. 山西醫(yī)科大學(xué)管理學(xué)院, 山西 太原, 030600;2. 山西省臨床決策研究大數(shù)據(jù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山西 太原, 030600)

卵巢癌(OC)是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一[1], 病死率居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之首[2], 嚴(yán)重威脅女性的生命健康[3]。近年來,隨著轉(zhuǎn)錄組和計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展,長鏈非編碼RNA(lncRNA)作為癌基因或腫瘤抑制因子在癌癥發(fā)生及發(fā)展中的作用被逐步揭示[4]。有學(xué)者[5-7]從銅死亡相關(guān)lncRNA、缺氧相關(guān)lncRNA、甲基化與免疫相關(guān)lncRNA等角度構(gòu)建了OC預(yù)后模型。研究[8]表明,唾液酸化相關(guān)lncRNA與許多癌癥病理情況相關(guān),例如ST8 α-N-乙酰神經(jīng)酰胺α-2, 8-?；D(zhuǎn)移酶6反義1(ST8SIA6-AS1)過表達(dá)時(shí), OC患者的總體生存率(OS)顯著下降,加速乳腺癌、肺癌、胰腺癌等細(xì)胞周期進(jìn)程,促進(jìn)增殖并抑制化療誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡; lncRNA母系表達(dá)基因3(MEG3)高表達(dá)時(shí),腎癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力顯著增強(qiáng)[9]。

一直以來,以鉑類藥物為基礎(chǔ)的治療方式在OC中表現(xiàn)出原發(fā)性耐藥,其化療反應(yīng)率僅為11%～56%, 患者5年生存率約為60%[10], 需要在新型抗癌藥物方面取得突破。近年來,免疫療法以其高效性、持久性、個(gè)體化、毒副作用小等優(yōu)勢,在惡性腫瘤治療中顯現(xiàn)出良好效果[11]。本研究基于唾液酸化相關(guān)lncRNA構(gòu)建OC預(yù)后模型,分析OC患者預(yù)后的免疫反應(yīng)和抗癌藥物敏感性,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取

從MSigDB數(shù)據(jù)庫(http://www.gsea-msigdb.org)獲取19個(gè)唾液酸化基因集數(shù)據(jù),見表1。從癌癥基因圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov)獲取420個(gè)OC樣本的基因表達(dá)數(shù)據(jù)(其中已包含研究所需的唾液酸化基因表達(dá)數(shù)據(jù)與lncRNA表達(dá)數(shù)據(jù))及臨床數(shù)據(jù)。

表1 唾液酸化基因列表

1.2 篩選OC唾液酸化相關(guān)lncRNA

采用R包"stat(4.2.1)"對lncRNA和唾液酸化基因進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析,以r>0.4且P<0.001為篩選閾值。采用R包"ggalluvial(0.12.3)"與"ggplot2(3.4.0)"對獲得的唾液酸化基因與lncRNA的共表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化展示。

1.3 篩選OC生存相關(guān)唾液酸化lncRNA

將OC唾液酸化相關(guān)的lncRNA表達(dá)數(shù)據(jù)與OC生存數(shù)據(jù)進(jìn)行合并,以1∶1的比例隨機(jī)分為訓(xùn)練組(n=210)和驗(yàn)證組(n=210),采用卡方檢驗(yàn)評價(jià)訓(xùn)練組與驗(yàn)證組臨床特征的差異,以P>0.05為篩選閾值。訓(xùn)練組采用單因素Cox回歸與Lasso回歸的10倍交叉驗(yàn)證明確預(yù)后顯著的唾液酸化lncRNA, 以P<0.05為篩選閾值。對獲取的預(yù)后唾液酸化lncRNA進(jìn)行偏似然比算法與向前逐步回歸的多因素Cox分析(以進(jìn)入P=0.05、除去P=0.10為閾值),篩選卵巢癌生存相關(guān)的唾液酸化lncRNA(OCSS lncRNA)。驗(yàn)證組則驗(yàn)證OCSS lncRNA的準(zhǔn)確性。

1.4 OC預(yù)后模型構(gòu)建與驗(yàn)證

基于OCSS lncRNA構(gòu)建預(yù)后模型,計(jì)算每例OC患者的風(fēng)險(xiǎn)評分。風(fēng)險(xiǎn)評分=Coef(i)×Expr(i), 公式中的Coef(i)代表回歸系數(shù), Expr(i)代表lncRNA的表達(dá)水平。將訓(xùn)練組風(fēng)險(xiǎn)評分中位數(shù)作為分界點(diǎn),把涵蓋OC的樣本分為高、低風(fēng)險(xiǎn)組,并繪制風(fēng)險(xiǎn)評分圖、患者生存狀態(tài)散點(diǎn)圖與基因表達(dá)熱圖。采用R包"survival(3.4.0)"分析總數(shù)據(jù)集、訓(xùn)練組和驗(yàn)證組OC患者高、低風(fēng)險(xiǎn)OS的差異,以及總數(shù)據(jù)集高、低風(fēng)險(xiǎn)組無進(jìn)展生存期OS的差異。采用R包"timeROC(0.4)"繪制受試者工作特征(ROC)曲線,用于驗(yàn)證模型效能。

1.5 OC預(yù)后模型臨床價(jià)值分析

采用單因素和多因素Cox回歸分析篩選OC的獨(dú)立預(yù)后因素?；陲L(fēng)險(xiǎn)評分與臨床特征數(shù)據(jù),采用R包"rms(6.3.0)" "nomogramEx(1.0)" "regplot(1.1)"繪制預(yù)測OC患者OS的列線圖,并構(gòu)建校正曲線驗(yàn)證列線圖準(zhǔn)確性。

1.6 免疫細(xì)胞浸潤與免疫治療分析

采用"CIBERSORT"算法分析不同風(fēng)險(xiǎn)人群22種免疫細(xì)胞含量的差異,在腫瘤免疫功能障礙和排斥(TIDE)網(wǎng)站檢索OC的TIDE數(shù)據(jù)(http://tide.dfci.harvard.edu), 分析不同風(fēng)險(xiǎn)人群對免疫治療敏感性的差異,以P<0.05為篩選閾值。

1.7 藥物敏感性分析

從癌癥藥物敏感性基因組學(xué)(CDSG)數(shù)據(jù)庫(https://www.cancerrxgene.org)獲取治療OC的潛在藥物數(shù)據(jù),計(jì)算藥物的半數(shù)有效抑制濃度(IC50),并分析不同風(fēng)險(xiǎn)人群的藥物敏感性差異,以P<0.01為篩選閾值。本研究采用的R軟件版本是4.2.1。

2 結(jié) 果

2.1 OC唾液酸化相關(guān)lncRNA

通過Pearson相關(guān)性分析獲得了1 568個(gè)OC唾液酸化相關(guān)lncRNA, 見圖1。

圖1 卵巢癌唾液酸化相關(guān)lncRNA

2.2 OC預(yù)后模型構(gòu)建

分組臨床統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,總數(shù)據(jù)集、訓(xùn)練組和驗(yàn)證組的OC患者在年齡、腫瘤分級和腫瘤分期方面比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 見表2。基于訓(xùn)練組的單因素Cox與Lasso回歸的10倍交叉驗(yàn)證分析篩選出21個(gè)預(yù)后顯著的OC唾液酸化lncRNA,見圖2。通過偏似然比算法與向前逐步回歸的多因素Cox分析最終確定7個(gè)OCSS lncRNA納入預(yù)后模型,見表3。風(fēng)險(xiǎn)評分=(-0.437×AC015 802.4)+(0.070×AC008 982.2)+(0.063×AC125 807.2)+(-0.704×AC002 306.1)+(0.236×PTPRD-AS1)+(0.111×AC010 834.3)+(-0.293×AL590 133.1)。

表2 訓(xùn)練組與驗(yàn)證組臨床資料比較[n(%)]

表3 多因素Cox回歸納入模型的OCSS lncRNA

2.3 OC預(yù)后模型效能檢驗(yàn)

總數(shù)據(jù)集、訓(xùn)練組與驗(yàn)證組的風(fēng)險(xiǎn)評分圖與患者生存狀態(tài)散點(diǎn)圖顯示,高風(fēng)險(xiǎn)組的風(fēng)險(xiǎn)值較高,并且隨著風(fēng)險(xiǎn)值的升高,患者的生存時(shí)間縮短,死亡例數(shù)增加; 總數(shù)據(jù)集、訓(xùn)練組與驗(yàn)證組的基因表達(dá)熱圖顯示, 7個(gè)OCSS lncRNA在高、低風(fēng)險(xiǎn)組中的表達(dá)情況一致。見圖3。Kaplan-Meier(K-M)生存曲線顯示,高風(fēng)險(xiǎn)較低風(fēng)險(xiǎn)患者的OS下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01), 見圖4。此外,預(yù)后模型1、3、5年的ROC曲線與不同臨床特征比較的ROC曲線顯示,模型預(yù)測患者OS具有較高的準(zhǔn)確性,見圖5。

A: 單因素COX篩選的預(yù)后顯著的唾液酸化lncRNA, 圖中綠色表示保護(hù)因素,紅色表示危險(xiǎn)因素; B: Lasso回歸中的Coef系數(shù)剖面圖; C: Lasso回歸中調(diào)整參數(shù)進(jìn)行10倍交叉驗(yàn)證(2條虛線之間的區(qū)域表示合理值)。圖2 卵巢癌預(yù)后顯著的唾液酸化lncRNA

2.4 OC預(yù)后模型的臨床價(jià)值

本研究納入年齡、腫瘤分級、腫瘤分期、風(fēng)險(xiǎn)評分為協(xié)變量,構(gòu)建Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型,評估上述臨床特征預(yù)測預(yù)后的潛力。單因素Cox回歸分析顯示,年齡的大小、腫瘤分期的早晚和風(fēng)險(xiǎn)評分的高低是影響OC患者OS的危險(xiǎn)因素(P<0.05); 多因素Cox回歸分析顯示,年齡的大小和風(fēng)險(xiǎn)評分的高低是影響OC患者OS的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見圖6。因此,年齡和風(fēng)險(xiǎn)評分是影響OC患者OS的獨(dú)立預(yù)后因素。列線圖可以對OC患者1、3、5年的OS進(jìn)行預(yù)測,校正曲線顯示預(yù)測結(jié)果與患者實(shí)際結(jié)果的重合度較好,見圖7。

2.5 免疫細(xì)胞浸潤與免疫治療分析

考慮到免疫浸潤在免疫治療中的作用,本研究比較了高、低風(fēng)險(xiǎn)組中的免疫細(xì)胞浸潤差異,結(jié)果顯示,高風(fēng)險(xiǎn)組的γδT細(xì)胞和M1巨噬細(xì)胞含量高于低風(fēng)險(xiǎn)組(P<0.05或P<0.01); 免疫治療敏感性分析結(jié)果顯示,高風(fēng)險(xiǎn)組的TIDE評分總體高于低風(fēng)險(xiǎn)組(P<0.05)。見圖8。

2.6 藥物敏感性分析

為探尋治療OC的潛在藥物,本研究比較了高、低風(fēng)險(xiǎn)組的藥物敏感性差異,共獲得藥物9種(ERK_2440、ERK_6604、GSK269962A、PD0325901、SCH772984、VX-11e、Selumetinib、Staurosporine、Ulixertinib), 且高風(fēng)險(xiǎn)組的IC50值均低于低風(fēng)險(xiǎn)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說明上述藥物可能對高風(fēng)險(xiǎn)OC患者具有較高的治療價(jià)值。見圖9。

3 討 論

唾液酸化是一種翻譯后修飾,由唾液酸轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和神經(jīng)氨酸酶家族控制的生物學(xué)過程[12]。這一過程與許多病理情況有關(guān),例如癌癥、胚胎致死和免疫系統(tǒng)異常[13]。研究[14]表明,唾液酸化相關(guān)lncRNA不但可以調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的增殖、分化,還可調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的代謝重編程,在癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中有至關(guān)重要的作用。有學(xué)者[15]從唾液酸化相關(guān)lncRNA角度構(gòu)建了結(jié)直腸癌預(yù)后模型。由于化療藥物的耐藥性,探索新型免疫治療方式與開發(fā)新型抗癌藥物一直是研究者關(guān)注的焦點(diǎn)。本研究基于唾液酸化相關(guān)lncRNA構(gòu)建OC預(yù)后模型,并進(jìn)一步分析患者預(yù)后免疫反應(yīng)與藥物敏感性,以期為OC患者的精準(zhǔn)醫(yī)療以及免疫與藥物治療提供依據(jù)。

A～C: 總數(shù)據(jù)集、訓(xùn)練組與驗(yàn)證組的風(fēng)險(xiǎn)評分圖; D～F: 總數(shù)據(jù)集、訓(xùn)練組與驗(yàn)證組的患者生存狀態(tài)散點(diǎn)圖; G～I(xiàn): 7個(gè)OCSS lncRNA在總數(shù)據(jù)集、訓(xùn)練組與驗(yàn)證組中的基因表達(dá)情況。圖3 總數(shù)據(jù)集、訓(xùn)練組與驗(yàn)證組的風(fēng)險(xiǎn)評分圖、患者生存狀態(tài)散點(diǎn)圖及基因表達(dá)熱圖

A: 總數(shù)據(jù)集的K-M生存曲線; B: 訓(xùn)練組的K-M生存曲線; C: 驗(yàn)證組的K-M生存曲線; D: 總數(shù)據(jù)集無進(jìn)展生存期的K-M生存曲線。圖4 總數(shù)據(jù)集、訓(xùn)練組、驗(yàn)證組的K-M生存曲線

A: 預(yù)后模型的ROC曲線; B: 預(yù)后模型與不同臨床特征比較的ROC曲線。圖5 預(yù)后模型的ROC曲線

A: 單因素Cox回歸的獨(dú)立預(yù)后分析; B: 多因素Cox回歸的獨(dú)立預(yù)后分析。圖6 不同臨床特征的獨(dú)立預(yù)后分析

A: 列線圖; B: 列線圖的校正曲線。圖7 預(yù)后模型的列線圖與校正曲線

A: 高、低風(fēng)險(xiǎn)組的免疫細(xì)胞浸潤分析結(jié)果; B: 高、低風(fēng)險(xiǎn)組的免疫治療敏感性分析結(jié)果。圖8 高、低風(fēng)險(xiǎn)組的免疫細(xì)胞浸潤與免疫治療敏感性

本研究通過分析獲取了1 568個(gè)與OC唾液酸化相關(guān)的lncRNA, 再通過單因素Cox、Lasso和多因素Cox回歸分析最終確定了7個(gè)OCSS lncRNA, 并基于此構(gòu)建了OC預(yù)后模型(AC015802.4、AC008982.2、AC125807.2、AC002306.1、PTPRD-AS1、AC010834.3與AL590133.1)。單因素和多因素Cox回歸分析顯示,年齡和風(fēng)險(xiǎn)評分是OC患者高危的獨(dú)立預(yù)后因素。列線圖可以較為準(zhǔn)確地預(yù)測OC患者各階段的OS。

7個(gè)OCSS lncRNA中,已有2個(gè)被報(bào)道與OC密切相關(guān)。AC008982.2被認(rèn)為是一種新型致癌基因,可以促進(jìn)OC細(xì)胞增殖、遷移,與OC患者OS密切相關(guān),并可能作為OC的新型治療靶點(diǎn)[16]。以PTPRD-AS1構(gòu)建的預(yù)后模型不僅可以預(yù)測OC患者預(yù)后,還與多囊卵巢綜合征顯著相關(guān)[17]。剩余的5個(gè)OCSS lncRNA未見與OC相關(guān)的報(bào)道。然而,研究[18]發(fā)現(xiàn)AC002306.1的低表達(dá)與前列腺癌患者的預(yù)后惡化顯著相關(guān), AC015802.4是預(yù)測膀胱癌患者OS的關(guān)鍵lncRNA。此外, AC125807.2被證實(shí)是肺腺癌預(yù)后模型的重要成員[19],其在肺腺癌細(xì)胞中呈高表達(dá),這種高表達(dá)與肺腺癌的不良預(yù)后密切相關(guān),當(dāng)下調(diào)AC125807.2表達(dá)時(shí),肺腺癌的進(jìn)展被抑制[20]。因此,進(jìn)一步研究上述lncRNA在OC中的作用,可以作為對OC認(rèn)識的一個(gè)新維度,可能有助于預(yù)測OC患者的預(yù)后。

A: ERK_6604敏感性; B: GSK269962A敏感性; C: ERK_2440敏感性; D: Selumetinib敏感性; E: SCH772984敏感性; F: PD0325901敏感性; G: VX-11e敏感性; H: Ulixertinib敏感性; I: Staurosporine敏感性。圖9 高、低風(fēng)險(xiǎn)組的藥物敏感性

本研究對OC低風(fēng)險(xiǎn)和高風(fēng)險(xiǎn)人群的免疫細(xì)胞浸潤進(jìn)行分析,結(jié)果顯示γδT細(xì)胞和M1巨噬細(xì)胞的含量在低風(fēng)險(xiǎn)組較高。γδT細(xì)胞具有識別熱休克蛋白和超級抗原的重要功能,是人體抵御病原體的首道防線[21]。研究[22]證實(shí), γδT細(xì)胞浸潤到腫瘤中與OC患者OS增加有關(guān),促進(jìn)γδT細(xì)胞反應(yīng)可能是OC的治療選擇。巨噬細(xì)胞的主要免疫系統(tǒng)功能依賴于其吞噬功能,即在感染環(huán)境中吞噬各種細(xì)胞底物的過程[23]。M1巨噬細(xì)胞表現(xiàn)為促炎、抗感染狀態(tài),是一種激活的抗腫瘤狀態(tài)[24]。研究[25]表明, M1巨噬細(xì)胞通過誘導(dǎo)型一氧化氮合酶優(yōu)先產(chǎn)生一氧化氮,一氧化氮是一種自由基氣體,對癌細(xì)胞和各種病原體都有直接的細(xì)胞毒性。結(jié)合本研究結(jié)果,抑制γδT細(xì)胞和M1巨噬細(xì)胞反應(yīng)可能是引起OC進(jìn)展的因素之一。本研究使用TIDE評分分析患者的免疫治療敏感性,高風(fēng)險(xiǎn)組TIDE評分顯著高于低風(fēng)險(xiǎn)組,提示存在高免疫逃逸傾向,表明高風(fēng)險(xiǎn)組患者不太可能從免疫治療中獲益。

本研究通過比較高、低風(fēng)險(xiǎn)組的藥物敏感性差異,獲得了9種對高風(fēng)險(xiǎn)OC患者具有較高治療價(jià)值的藥物(ERK_2440、ERK_6604、GSK269962A、PD0325901、SCH772984、VX-11e、Selumetinib、Staurosporine、Ulixertinib), 上述藥物大多具有抑制細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)活性或阻斷ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用[26-29]。ERK1/2是一種參與ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)的絲氨酸/蘇氨酸激酶,其活化后進(jìn)入OC細(xì)胞核作用于各種轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而影響OC細(xì)胞的生長發(fā)育及增殖分化[30]。研究[31]表明,高表達(dá)的唾液酸化基因ST6Gal1可通過ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,增強(qiáng)OC細(xì)胞凋亡抗性,促進(jìn)OC細(xì)胞在富含腫瘤壞死因子的腫瘤微環(huán)境中存活。因此,將上述藥物應(yīng)用于治療高風(fēng)險(xiǎn)OC患者可能具有廣闊的前景。作為前瞻性研究,本研究依然存在一定的局限性,所用數(shù)據(jù)均來源于在線數(shù)據(jù)庫,仍需進(jìn)一步結(jié)合大量臨床標(biāo)本及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來驗(yàn)證其臨床應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述, 7個(gè)OCSS lncRNA構(gòu)建的OC預(yù)后模型有助于預(yù)測OC患者預(yù)后,而基于模型結(jié)果的免疫分析表明,抑制γδT細(xì)胞和M1巨噬細(xì)胞生長可能是引起OC進(jìn)展的因素之一。藥物敏感性分析獲取了9種可能對高風(fēng)險(xiǎn)患者具有治療價(jià)值的抗癌藥物。