夏航彪 趙界 王述紅

(遂寧市中心醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,四川 遂寧 629000)

肺癌是發(fā)病率與死亡率最高的惡性腫瘤,其中主要病理類型為非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC),約占肺癌患者85%以上,盡管肺癌的治療手段取得一定進(jìn)步,仍有部分患者發(fā)生耐藥、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等問題,因此研究肺癌的發(fā)生發(fā)展與轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制具有重要意義[1-2]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)為內(nèi)源性非編碼RNA,研究顯示,多種lncRNA在肺癌中異常表達(dá),與肺癌患者預(yù)后及臨床病理特征、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)[3-5]。LncRNA TUC338為新發(fā)現(xiàn)的lncRNA,研究顯示,它在前列腺癌、肺癌、宮頸癌等多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)[6-8],發(fā)揮促癌基因的作用,但LncRNA TUC338在NSCLC中的作用機(jī)制尚不清楚。表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor,EGFR)可調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖,在肺癌中高表達(dá),與腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)[9],且EGFR高表達(dá)可激活磷酸肌醇3激酶/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Phosphoinositide 3-kinase/serine/threonine protein kinase,PI3K/AKT)通路,在腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移等過程中發(fā)揮重要作用[10-11]。本研究將探討LncRNA TUC338對肺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響及其作用機(jī)制,現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 病例 收集2019年7月—2021年6月我院胸外科手術(shù)切除的37例NSCLC患者肺癌組織與癌旁組織標(biāo)本,均為肺腺癌,患者手術(shù)前未經(jīng)任何抗腫瘤治療,其中男性15例,女性22例,年齡32～75歲。取得標(biāo)本在液氮罐中長期保存,本研究得到本院倫理委員會的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號:1905-04),患者知情同意并簽署受試者簽署的知情同意書。

1.1.2 主要材料 人肺腺癌細(xì)胞系NCI-H157、A549、NCI-H1299、HCC827及正常肺上皮細(xì)胞系BEAS-2B(中國科學(xué)院細(xì)胞庫);RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco公司);FBS、DMSO(北京Solarbio公司);Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑(Sigma-Aldrich公司);抑制lncRNA TUC338表達(dá)(si-TUC338)及陰性對照(si-NC)質(zhì)粒,lncRNA TUC338過表達(dá)(pcDNA-TUC338)及陰性對照(pcDNA-NC)質(zhì)粒、以及RT-qPCR引物(GenePharma公司);EGFR與PI3K雙重抑制劑MTX-211(百奧萊博);CCK-8檢測試劑盒、ECL試劑、RIPA裂解液(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司);兔抗人cyclin D1(ab16663)、MMP-2(ab92536)、β-actin抗體(ab8227)、MMP-9(ab76003)、p-EGFR(ab40815)、EGFR(ab52894)、p-PI3K(ab278545)、PI3K(ab32089)、p-AKT(ab38449)、AKT(ab8805)單克隆抗體(英國Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分組及處理 取對數(shù)增殖期的NCI-H157細(xì)胞,以每孔2×105個細(xì)胞接種于6孔板中,細(xì)胞匯合約85%時,將NCI-H157細(xì)胞分為對照(control)組、si-TUC338組、si-NC組、pcDNA-TUC338、pcDNA-NC組、MTX-211組及pcDNA-TUC338+MTX-211組,進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,RT-qPCR檢測各組NCI-H157細(xì)胞中l(wèi)ncRNA TUC338表達(dá),鑒定是否轉(zhuǎn)染成功。

1.2.2 RT-qPCR檢測lncRNA TUC338水平 RNA提取試劑提取總RNA,紫外分光光度計測量RNA純度及含量,以RNA作為模板,合成cDNA后,采用RT-qPCR檢測lncRNA TUC338相對表達(dá)量,以GAPDH為內(nèi)參,采用2-△△Ct法計算lncRNA TUC338相對表達(dá)量。LncRNA TUC338上游引物(5′-3′):GGTGAGAGGGGATGTTCAGT,下游引物(5′-3′):TGGGTGAAATGAGGTTG;GAPDH上游引物(5′-3′):CTGGGCTACACTGAGCACC,下游引物(5′-3′):AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG。

1.2.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞按照每孔1×105個細(xì)胞接種于96孔板中,分別培養(yǎng)24、48和72 h后,每孔加入適量的CCK-8溶液避光孵育2h,于酶標(biāo)儀450 nm處檢測吸光度(A)值。

1.2.4 Transwell小室法檢測細(xì)胞遷移與侵襲能力 使用無血清培養(yǎng)基制備NCI-H157細(xì)胞懸液,以每孔2×104個細(xì)胞接種于Transwell上室中,遷移實驗使用常規(guī)Transwell小室的上室,侵襲實驗使用Matrigel基質(zhì)膠包被Transwell小室的上室,下室為含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h后,使用4%多聚甲醛固定,0.1%結(jié)晶紫染色,顯微鏡下隨機(jī)選取6個視野觀察穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 Western blot檢測cyclin D1、MMP-2、MMP-9、p-EGFR、p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá) 提取各組細(xì)胞總蛋白,BCA法進(jìn)行蛋白濃度定量后,取30 μg蛋白煮沸后進(jìn)行SDS-PAGE并轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉封閉2 h,加入cyclin D1、MMP-2、MMP-9、p-EGFR、EGFR、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT一抗,在4 ℃孵育過夜,加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗室溫孵育2 h,ECL試劑顯影,以β-actin為內(nèi)參,用Quantity One 4.6軟件分析圖像,分析目的蛋白相對表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA TUC338在肺癌組織與細(xì)胞中表達(dá)上調(diào) LncRNA TUC338在肺癌組織表達(dá)水平顯著高于癌旁組織(t=41.799,P<0.05)。LncRNA TUC338在人NSCLC細(xì)胞系NCI-H157、A549、NCI-H1299、HCC827中表達(dá)水平顯著高于BEAS-2B細(xì)胞(t=10.431、11.023、20.762、12.928,P<0.05),其中在NCI-H157細(xì)胞中表達(dá)水平最高,選擇NCI-H157細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗,見圖1。

圖1 LncRNA TUC338在肺癌組織與細(xì)胞中表達(dá)

2.2 各組NCI-H157細(xì)胞中 lncRNA TUC338的表達(dá) 與si-NC組相比,si-TUC338組lncRNA TUC338表達(dá)水平顯著降低;與pcDNA-NC組相比,pcDNA-TUC338組lncRNA TUC338表達(dá)水平顯著升高(均P<0.05);control組與MTX-211組、pcDNA-TUC338與pcDNA-TUC338+MTX-211組之間lncRNA TUC338表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 各組NCI-H157細(xì)胞中l(wèi)ncRNA TUC338的表達(dá)情況

2.3 各組NCI-H157細(xì)胞增殖活性 與對照組相比,MTX-211組細(xì)胞增殖活性顯著降低;與si-NC組相比,si-TUC338組細(xì)胞增殖活性顯著降低(均P<0.05);與pcDNA-NC組相比,pcDNA-TUC338組細(xì)胞增殖活性顯著升高;與pcDNA-TUC338組相比,pcDNA-TUC338+MTX-211組細(xì)胞增殖活性顯著降低(均P<0.05)。見圖3。

圖3 各組NCI-H157細(xì)胞增殖活性比較

2.4 各組NCI-H157細(xì)胞遷移與侵襲能力 與對照組相比,MTX-211組細(xì)胞遷移與侵襲數(shù)顯著降低;與si-NC組相比,si-TUC338組細(xì)胞遷移與侵襲數(shù)顯著降低(均P<0.05);與pcDNA-NC組相比,pcDNA-TUC338組細(xì)胞遷移與侵襲數(shù)顯著升高;與pcDNA-TUC338組相比,pcDNA-TUC338+MTX-211組細(xì)胞遷移與侵襲數(shù)顯著降低(均P<0.05)。見圖4。

圖4 各組NCI-H157細(xì)胞遷移、侵襲(結(jié)晶紫染色,200×)

2.5 各組NCI-H157細(xì)胞cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá) 與對照組相比,MTX-211組細(xì)胞cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平顯著降低;與si-NC組相比,si-TUC338組細(xì)胞cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平顯著降低(均P<0.05);與pcDNA-NC組相比,pcDNA-TUC338組細(xì)胞cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平顯著升高;與pcDNA-TUC338組相比,pcDNA-TUC338+MTX-211組細(xì)胞cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平顯著降低(均P<0.05)。見圖5。

圖5 各組NCI-H157細(xì)胞中cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)

2.6 各組NCI-H157細(xì)胞EGFR/PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達(dá) 與對照組相比,MTX-211組細(xì)胞p-EGFR/EGFR、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表達(dá)水平顯著降低;與si-NC組相比,si-TUC338組細(xì)胞p-EGFR/EGFR、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表達(dá)水平顯著降低(均P<0.05);與pcDNA-NC組相比,pcDNA-TUC338組細(xì)胞p-EGFR/EGFR、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表達(dá)水平顯著升高;與pcDNA-TUC338組相比,pcDNA-TUC338+MTX-211組細(xì)胞p-EGFR/EGFR、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表達(dá)水平顯著降低(均P<0.05)。見圖6。

圖6 各組NCI-H157細(xì)胞中EGFR/PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討論

LncRNA在肺癌的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用,參與調(diào)控肺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲、細(xì)胞周期、血管生成等過程[12]。有研究顯示,LncRNA TUC338在肝癌、前列腺癌中上調(diào)表達(dá)并介導(dǎo)腫瘤的惡性進(jìn)展[13-14]。已有研究顯示,LncRNA TUC338在肺癌組織中高表達(dá),與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和患者總生存率有關(guān),抑制LncRNA TUC338表達(dá)可抑制肺癌細(xì)胞增殖與侵襲能力,而過表達(dá)LncRNA TUC338則可增加肺癌細(xì)胞增殖與侵襲能力[7]。為進(jìn)一步研究LncRNA TUC338在肺癌中的具體作用機(jī)制,本研究分別檢測肺癌組織及癌旁組織和NCI-H157、A549、NCI-H1299、HCC827細(xì)胞中LncRNA TUC338表達(dá)情況,結(jié)果顯示LncRNA TUC338在人肺癌組織中上調(diào)表達(dá),且在NCI-H157細(xì)胞中表達(dá)水平最高,選擇NCI-H157細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。Qian等[15]研究表明,在食管癌細(xì)胞中下調(diào)lncRNA TUC338表達(dá)可抑制食管癌細(xì)胞的遷移和侵襲。本研究在NCI-H157細(xì)胞中抑制lncRNA TUC338表達(dá)后,NCI-H157細(xì)胞增殖活性、遷移與侵襲數(shù)、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9表達(dá)水平顯著降低,表明抑制lncRNA TUC338表達(dá)可顯著抑制NCI-H157細(xì)胞增殖、遷移與侵襲。而在NCI-H157細(xì)胞中過表達(dá)lncRNA TUC338后,NCI-H157細(xì)胞增殖活性、遷移與侵襲數(shù)、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9表達(dá)水平顯著升高,表明lncRNA TUC338在肺癌中發(fā)揮促癌基因的作用,這與Zhang等[7]研究結(jié)果一致,然而其具體作用機(jī)制尚不清楚。

EGFR在多數(shù)腫瘤中上調(diào)表達(dá),EGFR成為腫瘤治療的重要分子靶標(biāo)[16-17]。EGFR與相應(yīng)配體特異性結(jié)合后,引起受體酪氨酸激酶的磷酸化,激活PI3K/AKT途徑,PI3K/AKT信號通路可參與調(diào)控細(xì)胞的分裂和增殖及血管的形成,還與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)[18-19]。激活EGFR/PI3K/AKT通路可促進(jìn)腫瘤的惡性特征[20-22]。研究表明,LINC00520可通過下調(diào)EGFR,使PI3K/AKT信號通路失活,從而阻止皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、遷移[23]。本研究中,NCI-H157細(xì)胞中抑制lncRNA TUC338表達(dá)后,細(xì)胞p-EGFR、p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平顯著降低,與加入EGFR/PI3K/AKT通路抑制劑MTX-211結(jié)果類似,表明抑制lncRNA TUC338表達(dá)可顯著抑制EGFR/PI3K/AKT通路激活。而在NCI-H157細(xì)胞中過表達(dá)lncRNA TUC338后NCI-H157細(xì)胞p-EGFR、p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平顯著升高,且加入MTX-211后可逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象,提示過表達(dá)lncRNA TUC338可激活EGFR/PI3K/AKT通路。Li等[24]研究表明,lncRNA TUC338通過抑制miR-28-5p表達(dá)激活EGFR/PI3K/AKT通路促進(jìn)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞增殖,本研究與此結(jié)果類似,因此推測lncRNA TUC338通過激活EGFR/PI3K/AKT通路,促進(jìn)NCI-H157細(xì)胞增殖、遷移與侵襲。

4 結(jié)論

綜上所述,lncRNA TUC338在肺癌組織中上調(diào)表達(dá),lncRNA TUC338可通過激活EGFR/PI3K/AKT信號通路,促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲。但本研究僅選擇一種細(xì)胞系進(jìn)行研究,后續(xù)仍需選擇多種細(xì)胞系對此通路進(jìn)行驗證。