李映東 王鐵延 歐琴 章書銘 李文仿

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院1.乳腺甲狀腺中心;2.病理科,湖北 十堰 442000)

乳腺癌被分為luminal A,luminal B,人表皮生長因子受體2(HER-2)和三陰性乳腺癌(Triple negative breast cancer,TNBC)等不同分子亞型[1]。TNBC以ER、PgR、HER2的缺失為特征,表現(xiàn)出相對的侵襲性表型,治療抵抗和預(yù)后不良特征。TNBC富含癌干細(xì)胞(Cancer Stem Cells,CSCs)和上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)特征,特征是上皮標(biāo)志物的下調(diào)和出現(xiàn)具有間充質(zhì)表型的高侵襲、遷移能力[2]。羧肽酶A4(CPA4)催化釋放羧基端氨基酸,其過表達(dá)有與肝癌、肺癌的等癌癥發(fā)展有關(guān)[3]。最近研究表明CPA4與p53表達(dá)呈負(fù)相關(guān),抑制CPA4可減少具有干細(xì)胞特征的乳腺癌細(xì)胞數(shù)量,可能是TNBC治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)[4]。然而,很少有研究探討CPA4在TNBC患者的表達(dá)及臨床病理因素關(guān)系。本研究的目的是闡明TNBC中CPA4表達(dá)與干性及EMT的關(guān)系,為此進(jìn)行免疫組化評估TNBC中CPA4表達(dá)與臨床病理標(biāo)志物,包括干性蛋白醛脫氫酶1(ALDH1)、NANOG,EMT相關(guān)蛋白e-鈣粘蛋白(E-cadherin)、Vimentin、EGFR等表達(dá)關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集我院2019年1月-2021年10月手術(shù)切除經(jīng)臨床病理診斷確診的TNBC早期患者168例,同期非TNBC共40例,同期乳腺包塊切除后診斷乳腺增生組織20例。其中年齡29～73歲,平均(52.28±4.12)歲,腫瘤<2 cm者53例,腫瘤≥2 cm者115例,年齡≤50歲共107例,年齡>50共61例。納入標(biāo)準(zhǔn):①患者經(jīng)穿刺病理活檢確診為乳腺癌。②患者病理標(biāo)本檢測均顯示ER、PgR及HER-2表達(dá)陰性。③男性乳腺癌除外。④患者入院前未接受任何形式的手術(shù)治療、放療或化療。⑤所有患者確診時(shí)均經(jīng)肺部及顱腦CT、骨掃描、肝膽B(tài)超等排除遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并存在其他嚴(yán)重器質(zhì)性病變或臟器功能不足。②合并存在其他惡性腫瘤。③精神疾病患者,無法有效配合研究的開展。腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級情況,是否新輔助化療等情況根據(jù)病理資料及患者病歷記載資料。

1.2 設(shè)備與試劑 采用免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)(Streptavidin-perosidase,SP)法檢測相對蛋白表達(dá)。CPA4(貨號:RMA-0807)、EGFR抗體(貨號:RMA-0804)均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司,E-cadherin(貨號:ab1416)抗體購自Abcam公司,ALDH1A1(貨號:54135S)、NANOG(貨號:4903S)、Vimentin(貨號:46173SF)購自Cell Signal公司。SP試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine,DAB)試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化染色方法 采集患者腫瘤組織部位標(biāo)本,應(yīng)用10%甲醛溶液進(jìn)行石蠟包埋處理后連續(xù)切片。對切片標(biāo)本進(jìn)行脫蠟水化處理和微波修復(fù)抗原處理,參照諾丁漢聯(lián)合組織學(xué)分級標(biāo)準(zhǔn)[5],將TNBC分為1、2、3級[6]。

1.3.2 免疫組化染色結(jié)果判讀 石蠟切片厚4 μL,切片二甲苯脫蠟,枸櫞酸鈉溶液抗原修復(fù)液98 ℃持續(xù)15 min修復(fù)抗原,兔抗人CPA4單克隆抗體(1∶100)4 ℃過夜,切片用PBS沖洗,與辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗孵育,DAB檢測,蘇木素染色,最后由兩名專業(yè)病理學(xué)家進(jìn)行評估。記錄染色強(qiáng)度為陰性至強(qiáng)(0～3),陰性(0分),弱陽性(1分),中等陽性(2分),強(qiáng)陽性(3分)。染色陽性面積評分0分(<10%);1分(10%～25%);2分(26%～50%);3分(51%～75%);4分(>76%)。染色面積評分×染色強(qiáng)度評分為最終得分,得分≥4判斷陽性,<4判斷陰性[7]。NANOG,E-cadherin,Vimentin參考CPA4染色方法判斷[7]。ALDH1主要定位于細(xì)胞漿,染色細(xì)胞總數(shù)>10%判斷陽性[8]。EGFR腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)或胞膜著色即判為陽性(+),否則判為陰性(-)[5]。

1.4 si-CPA4轉(zhuǎn)染 設(shè)空白對照組、無效干擾組及si-CPA4組。設(shè)計(jì)小分子靶向CPA4的核苷酸序列siRNA:5′-GCAGCACGGC AGTCTTTGAGT-3′,序列由上海生工合成,無效干擾RNA為不靶向作用任何mRNA的小分子核苷酸序列(siRNA NC),序列為:5′-UUCUCCGAACGU GUCACGU-3′。CPA4的siRNA按照轉(zhuǎn)染Lipofection 200說明,轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231。

1.5 MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) MDA-MB-231細(xì)胞在96孔板上,實(shí)驗(yàn)分為空白對照組,無效干擾組及si-CPA4組,轉(zhuǎn)染24 h后每孔6.0×103細(xì)胞在37 ℃,5% CO2條件下培養(yǎng)在10%胎牛血清的DMEM中。用無菌3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)20 μL(5mg/ml;Sigma, USA),在37 ℃下放置4 h,然后去除培養(yǎng)基,加入150 μL的二甲亞砜(DMSO),充分混合10 min,測量490 nm處的光譜吸光度。每組在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)3個(gè)重復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。用490 nm處的吸光度隨時(shí)間變化繪制了生長曲線。

1.6 細(xì)胞克隆形成 乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231培養(yǎng)在6孔板,按最終濃度為100 nM的CPA4組或siRNA NC組及空白對照組,轉(zhuǎn)染24 h后,96孔板每孔接種1000個(gè)細(xì)胞,連續(xù)培養(yǎng)10 d,結(jié)晶紫染色,計(jì)算克隆數(shù)。

1.7 細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn) 實(shí)驗(yàn)分為空白對照組、無效干擾組及si-CPA4組,轉(zhuǎn)染24 h后以2000細(xì)胞/孔種植24孔板,用含B27(A1895601,Thermo Fisher Scientific),20 ng/mL EGFR (PV4289,Thermo Fisher Scientific),20 ng/mL FGF (PHG 6015,Thermo Fisher Scientific)的DMEM/F12培養(yǎng)10 d,計(jì)數(shù)細(xì)胞成球數(shù)目。

1.8 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分為空白對照組、無效干擾組及CPA4組。將MDA-MB-231細(xì)胞無血清培養(yǎng)24 h,在6孔板中每孔鋪1×106個(gè)細(xì)胞。按照轉(zhuǎn)染Lipofection 2000說明,轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231,48 h后用10 μL無菌槍頭劃痕,24 h后觀察細(xì)胞遷移,計(jì)算每組細(xì)胞遷移距離。

1.9 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 將MDA-MB-231細(xì)胞無血清培養(yǎng)24 h,實(shí)驗(yàn)分為空白對照組、無效干擾組及si-CPA4組。轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞,48 h后用Matrigel涂布8 mm孔的Transwell小室,將5×105個(gè)細(xì)胞鋪到細(xì)胞小室中,在下面的孔板上加入含有10% FBS的培養(yǎng)基,在24 h后用棉簽將沒有侵襲的細(xì)胞輕輕刮走,4%多聚甲醛固定,結(jié)晶紫染色,對染色的細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.10 蛋白質(zhì)印跡法檢測ALDH1A1、NANOG、E-cadherin、Vimentin蛋白 利用RIPA裂解液獲得MDA-MB-231細(xì)胞的蛋白,吸取50 μg蛋白進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,將其轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,經(jīng)5%脫脂牛奶封閉1 h。4 ℃加入CPA4、ALDH1A1、NANOG、E-cadherin、Vimentin蛋白抗體(均為1∶1 000 稀釋)孵育,次日加入二抗孵育2 h,顯影,以GAPDH為內(nèi)參,分析蛋白條帶灰度值。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,乳腺癌及乳腺增生組織中CPA4表達(dá)差異采用四格表χ2檢驗(yàn),CPA4表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征關(guān)系采用四格表χ2檢驗(yàn)。MDA-MB-231細(xì)胞克隆形成,細(xì)胞成球及侵襲、遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用t檢驗(yàn),P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TNBC中CPA4表達(dá)臨床特點(diǎn) CPA4陽性表達(dá)表現(xiàn)為在細(xì)胞膜中見棕黃色顆粒,168例TNBC患者中CPA4陽性表達(dá)率為57.14%(96/168),見圖1A、B。非TNBC乳腺癌組織中表達(dá)陽性率為37.5%(15/40),而在乳腺增生組織中表達(dá)陽性率為20%(4/20),見圖1C、D。TNBC組織中CPA4表達(dá)明顯高于非TNBC,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),TNBC中CPA4表達(dá)明顯高于乳腺增生組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

圖1 TNBC、乳腺增生組織中CPA4的免疫組織化學(xué)圖(200×)

表1 TNBC、Non-TNBC及乳腺增生組織中CPA4表達(dá)[n(×10-2)]

2.2 CPA4表達(dá)在TNBC中與患者臨床病理特征的關(guān)系 168例TNBC中CPA4表達(dá)與患者年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、脈管浸潤、腫瘤大小、組織學(xué)分級、TNM分期差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。CPA4陽性組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為59.4%,CPA4陰性組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為38.9%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.005)。CPA4陽性組Ki-67為84.4%,而CPA4陰性組Ki-67為70.8%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 CPA4表達(dá)與三陰性乳腺癌臨床病理特征關(guān)系[n(×10-2)]

2.3 TNBC中CPA4表達(dá)與干性及EMT標(biāo)志的關(guān)系 TNBC中干性標(biāo)志ALDH1表達(dá)陽性率16.68%(28/168),NANOG表達(dá)陽性率32.14%(54/168),見圖2。而EMT相關(guān)標(biāo)志E-cadherin陽性率為50.0%(84/168),Vimentin陽性率為45.83%(77/168),EGFR陽性率為65.48%(110/168),見圖3。168例TNBC中CPA4表達(dá)與患者ALDH1無關(guān)(P>0.05),但與NANOG、E-cadherin、Vimentin、EGFR差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表3。

圖2 TNBC中ALDH1、NANOG的免疫組織化學(xué)圖(200×)

圖3 TNBC中E-cadherin、Vimentin的免疫組織化學(xué)圖(200×)

表3 TNBC中CPA4表達(dá)與干性及EMT標(biāo)志的關(guān)系[n(×10-2)]

2.4 siRNA沉默CPA4抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、克隆形成及干性成球 siRNA沉默乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中CPA4表達(dá),Q-PCR及Western Blot顯示si-CPA4明顯抑制MDA-MB-231中CPA4的mRNA及蛋白表達(dá),見圖4A、B。MTT實(shí)驗(yàn)提示細(xì)胞增殖受到抑制?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)提示CPA4沉默組細(xì)胞克隆形成能力降低,細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)顯示CPA4沉默組細(xì)胞成球能力降低,見圖4D、E。

圖4 siRNA沉默CPA4抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、克隆形成及干性成球

2.5 siRNA沉默CPA4抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲、遷移、干性及EMT相關(guān)蛋白表達(dá) 劃痕實(shí)驗(yàn)提示si-CPA4抑制MDA-MB-231遷移,細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)提示si-CPA4抑制MDA-MB-231侵襲。Western Blot提示si-CPA4抑制干性蛋白ALDH1、NANOG表達(dá),并抑制EMT相關(guān)蛋白Vimentin表達(dá),促進(jìn)E-cadherin表達(dá)。見圖5。

3 討論

TNBC有高轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā),預(yù)后較差的臨床特點(diǎn),缺乏內(nèi)分泌治療及靶向治療點(diǎn),臨床治療面臨較大困難[9]。本研究發(fā)現(xiàn)CPA4在TNBC中表達(dá)率為57.14%,但CPA4在非TNBC乳腺癌及乳腺增生組織中的表達(dá)顯著減少。CPA4與TNBC患者干性蛋白NANOG干性標(biāo)志物高表達(dá)有關(guān),CPA4在TNBC組織中與低E-cadherin表達(dá),但與Vimentin、EGFR高表達(dá)有關(guān),表明TNBC中CPA4可能與腫瘤干性進(jìn)展及EMT相關(guān),是重要的CSCs和EMT調(diào)節(jié)因子。

腫瘤組織中極少量致瘤性細(xì)胞亞群具有無限增殖的潛能,在啟動(dòng)腫瘤形成和維持生長中起決定性作用,是腫瘤形成的起始細(xì)胞,也稱為腫瘤起始細(xì)胞(tumor initiating cells,TICs)[10]。CSCs處于休眠狀態(tài),卻在腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]。CPA4促進(jìn)了肝癌干性蛋白CD133、ALDH1及CD44表達(dá),食管癌中CPA4也可調(diào)控ALDH1表達(dá),表明CPA4在惡性腫瘤干性中發(fā)揮一定作用[12-13]。TNBC富含干細(xì)胞,是其容易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的重要原因,ALDH1參與了乳腺癌干性進(jìn)展[14]。本研究發(fā)現(xiàn)TNBC中CPA4陽性組有更高的ALDH1表達(dá),可能參與TNBC干性調(diào)控。NANOG是癌細(xì)胞干細(xì)胞樣相關(guān)蛋白,導(dǎo)致腫瘤生長擴(kuò)張、自我更新、轉(zhuǎn)移形成和腫瘤復(fù)發(fā)[15]。本組研究發(fā)現(xiàn)TNBC中CPA4表達(dá)與NANOG相關(guān),CPA4陽性組有更高的NANOG表達(dá)。沉默CPA4抑制TNBC細(xì)胞干性成球,抑制干性蛋白ALDH1及NANOG表達(dá),進(jìn)一步表明CPA4可能參與TNBC干性調(diào)控。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是細(xì)胞可塑性發(fā)展、分化、癌細(xì)胞遷移和腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟之一[16]。EMT是上皮細(xì)胞獲得遷移能力的有效方式,也是占成體惡性腫瘤90%的上皮腺癌浸潤和轉(zhuǎn)移的重要途徑[17]。EMT型細(xì)胞具有浸入基底膜能力和細(xì)胞骨架改變便于細(xì)胞移動(dòng)等變化,增加細(xì)胞浸潤和移動(dòng)能力、增加抗凋亡信號,成為循環(huán)腫瘤細(xì)胞(Circulating tumor cells,CTCs),獲得轉(zhuǎn)移和浸潤能力[18]。腫瘤細(xì)胞經(jīng)歷EMT獲得浸潤特性,易于浸入細(xì)胞基質(zhì),有利于腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[19]。本研究表明CPA4與低E-cadherin、高Vimentin表達(dá)有關(guān),沉默CPA4抑制MDA-MB-231的Vimentin表達(dá),表明CPA4參與TNBC的EMT調(diào)控。最近,EGFR通路參與TNBC侵襲、轉(zhuǎn)移及干性進(jìn)展中逐步受到重視,可能作為TNBC新的有效的輔助治療靶點(diǎn)[20]。本組研究表明CPA4與TNBC中EGFR相關(guān),可能協(xié)同促進(jìn)TNBC惡性進(jìn)展。

另外,本研究表明沉默CPA4的顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖,抑制克隆形成。以往的數(shù)據(jù)也表明CPA4通過調(diào)控AKT/c-MYC通路,激活STAT3及ERK中發(fā)揮一定作用,參與調(diào)控非小細(xì)胞肺癌等腫瘤增殖[21-22]。

4 結(jié)論

本研究表明CPA4在TNBC干性進(jìn)展及EMT轉(zhuǎn)換過程中可能發(fā)揮一定作用,在TNBC增殖、轉(zhuǎn)移、干性進(jìn)展等方面具有一定價(jià)值,需要進(jìn)一步闡明TNBC中CPA4分子機(jī)制。