王娟 王澤 王雪霖 唐煥文

(中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第970醫(yī)院五官科,山東 煙臺(tái) 264000)

青少年鼻咽血管纖維瘤(Juvenile nasopharyngeal angiofibroma,JNA)是一種具有局部侵襲性但組織學(xué)上良性的血管腫瘤,幾乎只發(fā)生于青春期男性,約占所有頭頸部腫瘤的0.5%[1]。JNA呈擴(kuò)張性和破壞性生長,其可以通過孔和裂擴(kuò)散到鄰近的鼻腔、鼻咽、鼻旁竇、眼眶和顱底,常以啞鈴狀延伸至翼腭間隙、咀嚼肌間隙和顳下窩[2]。JNA常見的癥狀包括鼻塞(80%)和鼻出血(60%),而更晚期的腫瘤可以導(dǎo)致面部腫脹和視覺或神經(jīng)障礙。由于JNA的癥狀與包括鼻炎、鼻竇炎和息肉在內(nèi)的其他鼻咽疾病類似,因此存在延誤診斷的可能[3]。熱休克蛋白90(Heat shock protein 90,HSP90)是與癌癥進(jìn)展相關(guān)的最活躍的伴侶蛋白之一[4],其在血管生成、細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移中有重要作用[5]。HSP90在多種癌癥中過度表達(dá),并與其發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),尤其是前列腺癌等許多激素依賴性腫瘤[6]。研究認(rèn)為其發(fā)病可能與雌激素(Estrogen,ER)不足或雄激素(Androgen,AR)相對過多有關(guān)[7]。有研究發(fā)現(xiàn)使用ER拮抗劑可以治療鼻咽血管纖維瘤,如早期使用雌激素可減少JNA術(shù)中失血,且大約50%的侵襲性纖維瘤病對抗雌激素治療有反應(yīng)[8]。新生血管持續(xù)快速形成是腫瘤快速生長的關(guān)鍵因素之一,血管生成因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)是最主要的調(diào)控腫瘤血管發(fā)生主要因子,其對血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及血管構(gòu)建具有重要的特異性的調(diào)節(jié)作用。微血管密度(Microvascular density,MVD),又稱之為微血管計(jì)數(shù),是衡量腫瘤血管生成的活躍程度的指標(biāo)之一。MVD與VEGF表達(dá)水平可以協(xié)同預(yù)測評估良惡性腫瘤生長、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)趨勢[9-10]。HSP90與腫瘤發(fā)生密切相關(guān),有研究顯示HSP90抑制劑可以通過抑制包括Akt/mTOR及HIF-1α/VEGF及激素受體等多個(gè)通路來調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長[11]。目前,在JNA中HSP90與VEGF或激素之間相關(guān)性的研究較少,因此,本研究擬通過使用組織微陣列(TMA)分析JNA樣本中HSP90的表達(dá)水平及其與VEGF與ER的相關(guān)性,從而評估HSP90對JNA預(yù)后的影響,為患者最佳治療方式的選擇提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2018年—2022年在我院接受手術(shù)治療的60例組織學(xué)診斷為JNA的男性患者。所有患者在治療前都提供了關(guān)于臨床信息的知情同意書。從醫(yī)療記錄中回顧性收集臨床數(shù)據(jù)。來自10例男性患者的正常中鼻甲樣本作為對照組;中鼻甲標(biāo)本取自外傷性視神經(jīng)病變、垂體腺瘤或腦脊液鼻漏患者,中位年齡為21.2歲(12～26歲)。接受手術(shù)的JNA患者的中位年齡為16.8歲(10～39歲)。這些患者接受了開放或內(nèi)窺鏡(包括經(jīng)鼻內(nèi)鏡手術(shù)和內(nèi)鏡輔助手術(shù))手術(shù)。使用Radkowski系統(tǒng)進(jìn)行腫瘤分期評估,并通過CT和/或MRI觀察腫瘤的最長直徑以確定腫瘤大小。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號:2018-01007)。

1.2 患者隨訪 平均隨訪時(shí)間為174.5個(gè)月(144～206個(gè)月)。10例患者失訪,18例患者復(fù)發(fā)。將沒有肉眼可見的殘留腫瘤定義為完全切除,并通過組織學(xué)以及術(shù)后CT或MRI進(jìn)一步證實(shí)?；颊咝g(shù)后第一年每3個(gè)月復(fù)查一次,次年每6個(gè)月復(fù)查一次,然后每年復(fù)查一次,直至成年。臨床或放射學(xué)上(內(nèi)窺鏡檢查、CT和/或MRI)在鼻咽區(qū)域、鼻腔或鼻竇中發(fā)現(xiàn)腫瘤的患者為JNA復(fù)發(fā)。

1.3 組織微陣列 根據(jù)已報(bào)道的既定方案生成組織微陣列(TMA)[7]。將1組60個(gè)JNA(每個(gè)直徑為1.5 mm)在載玻片上隔開,并選擇來自10例男性患者的正常中鼻甲樣本作為正常對照。從每個(gè)代表性組織中取出2個(gè)核心,并將所有組織核心(直徑1.5 mm)放入可以覆蓋多達(dá)160個(gè)核心的TMA塊中。

1.4 免疫組織化學(xué)分析 采用多克隆抗HSP90(1∶100,Abcam,UK)作為一抗,GTVsion III檢測系統(tǒng)(GK500705,Gene Tec,Shanghai,China)作為二抗和彩色底物溶液。此外,本研究還檢測了VEGF、CD105和ER-α(1∶500,Abcam,UK)蛋白,并根據(jù)先前描述的方法計(jì)算了微血管密度(MVD)。對組織切片進(jìn)行脫蠟和復(fù)水,抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性,經(jīng)過洗滌和抗原修復(fù)后,在非免疫血清中封閉切片,再將切片與一抗孵育,然后二抗和彩色底物溶液孵育,最后用蘇木精對切片進(jìn)行復(fù)染、洗滌、脫水和封片。以相同方式處理陰性對照,但不添加一抗。

1.5 染色分?jǐn)?shù) 由兩名對臨床數(shù)據(jù)不知情的獨(dú)立研究人員,通過光學(xué)顯微鏡半定量估計(jì)免疫染色的強(qiáng)度和陽性細(xì)胞的百分比。將HSP90表達(dá)>5%的樣本作為陽性樣本[9]。免疫反應(yīng)評分如下:0(無染色);1(與陽性細(xì)胞百分比無關(guān)的弱免疫反應(yīng));2(<75% 的細(xì)胞有中度免疫反應(yīng)性或<25%的細(xì)胞有強(qiáng)免疫反應(yīng)性);3(75%的細(xì)胞具有中度免疫反應(yīng)性或25%的細(xì)胞具有強(qiáng)免疫反應(yīng)性)。每個(gè)樣品對應(yīng)兩個(gè)染色缸,對每個(gè)染色缸進(jìn)行評分,最終采用兩個(gè)染色缸的平均得分。為了進(jìn)一步分析,將患者分為低(評分0～1)和高(評分2～3)HSP90表達(dá)組兩組。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 26.0軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。通過卡方檢驗(yàn)分析免疫反應(yīng)標(biāo)志物與臨床病理學(xué)變量的關(guān)聯(lián)。采用Spearman相關(guān)檢驗(yàn)分析不同標(biāo)記分子表達(dá)水平的相關(guān)性。通過Kaplan-Meier方法檢查復(fù)發(fā)時(shí)間(TTR),并通過對數(shù)秩檢驗(yàn)評估TTR的差異。將本研究中達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義并在以前的研究中具有顯著價(jià)值的因素輸入Cox回歸模型進(jìn)行多變量分析。繪制(ROC)曲線以確定各種參數(shù)的預(yù)測值。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)分析檢測JNA中HSP90的表達(dá)模式 JNA的病理特征包括不規(guī)則血管和間質(zhì)成分,其中血管可分為較大的血管、正弦型血管和較小的毛細(xì)血管。TMA的免疫組織化學(xué)分析顯示HSP90位于基質(zhì)成分中成纖維細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中,在正弦型血管和較小的毛細(xì)血管中有明顯的HSP90表達(dá),在成熟的大血管內(nèi)皮細(xì)胞中僅觀察到微弱的HSP90信號。對照組(取自男性患者的10個(gè)正常中鼻甲樣本)中僅檢測到HSP90弱表達(dá),見圖1。

圖1 HSP90染色的微陣列組織(400×)

2.2 臨床病理學(xué)特征與HSP90表達(dá)的關(guān)聯(lián) 評估了HSP90表達(dá)與JNA基本臨床特征的相關(guān)性后發(fā)現(xiàn)HSP90與患者年齡相關(guān)(P<0.05),但與任何其他基線臨床特征無關(guān):包括腫瘤分期、JNA手術(shù)史、手術(shù)方法和手術(shù)期間出血(P>0.05),見表1。

表1 JNA患者HSP90表達(dá)的基本臨床特征的Pearson卡方檢驗(yàn)分析

2.3 HSP90水平與病理特征的關(guān)聯(lián) 結(jié)果表明,MVD、ER-a和VEGF與JNA患者的HSP90表達(dá)顯著相關(guān)(P<0.05),見表2。

表2 JNA患者病理特征與HSP90表達(dá)的Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)分析

2.4 JNA復(fù)發(fā)患者HSP90水平與臨床病理特征的相關(guān)性 50例患者中,18例復(fù)發(fā)(5年復(fù)發(fā)率為36.0%),平均復(fù)發(fā)時(shí)間為20.18個(gè)月(2～92個(gè)月),基于50例患者復(fù)發(fā)的臨床病理學(xué)特征,見表3。與根治性切除后HSP90低表達(dá)的患者(20.00%)相比,高HSP90表達(dá)的患者復(fù)發(fā)率(52.00%)升高。晚期腫瘤、MVD較高、出血更明顯,且高ER-α水平患者的復(fù)發(fā)率顯著較高(P<0.05)。此外,HSP90和ER-α表達(dá)的組合也與疾病復(fù)發(fā)顯著相關(guān)(P<0.05)。而其他臨床病理學(xué)特征如JNA手術(shù)史、手術(shù)方式等方面與腫瘤復(fù)發(fā)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這表明,高HSP90和/或ER-α水平高、MVD水平高、晚瘤分期更晚和手術(shù)期間出血更明顯的患者更有可能表現(xiàn)出侵襲性特征。

表3 JNA患者復(fù)發(fā)臨床病理特征的Pearson卡方檢驗(yàn)分析

2.5 JNA患者的高HSP90表達(dá)與早期疾病復(fù)發(fā)相關(guān)性 在最后一次隨訪中,發(fā)現(xiàn)18例患者復(fù)發(fā)(36.0%)。HSP90高表達(dá)的JNA患者1年、3年和5年復(fù)發(fā)率分別為32.1%、52.8%和57.4%,而HSP90低表達(dá)的患者分別為7.5%、16.1%和18.2%。最后,通過Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行單變量和多變量分析,以評估HSP90和臨床病理因素對JNA患者復(fù)發(fā)時(shí)間(TTR)的影響,見表4。在單變量分析中結(jié)果顯示,HSP90表達(dá)顯著影響TTR。此外影響TTR的其他因素包括MVD、術(shù)中出血、腫瘤分期和年齡。而后本研究又在多變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)分析中進(jìn)一步評估了單變量分析中篩選出的的重要因素。結(jié)果顯示HSP90、MVD和腫瘤分期是TTR的獨(dú)立預(yù)后因素。此外在所有臨床病理學(xué)特征中,HSP90高表達(dá)是預(yù)測預(yù)后的獨(dú)立因素,見表5。

表4 JNA患者復(fù)發(fā)時(shí)間(TTR)的單變量Cox回歸分析

表5 JNA患者復(fù)發(fā)時(shí)間(TTR)的多變量Cox回歸分析

3 討論

JNA復(fù)發(fā)率相對較高,目前主要的治療方式仍以內(nèi)鏡切除為主,預(yù)防JNA復(fù)發(fā),提高患者的預(yù)后仍然是外科醫(yī)生面臨的主要挑戰(zhàn)。探討JNA發(fā)病的機(jī)制及評估影響其復(fù)發(fā)的因素具有重要意義。

目前JNA的發(fā)病機(jī)制尚有爭議,有研究提出JNA患者體內(nèi)性激素不平衡學(xué)說。后續(xù)發(fā)現(xiàn)應(yīng)用雌激素治療兩例JNA患者后腫塊縮小,基于此有研究提出JNA發(fā)病可能與患者體內(nèi)性激素水平失去平衡有關(guān),即患者體內(nèi)雌激素(ER)、孕激素(PR)不足,促進(jìn)促性腺激素釋放,進(jìn)而導(dǎo)致JNA組織增生[12]。

JNA復(fù)發(fā)與VEGF高表達(dá)有關(guān)。JNA具有良性腫瘤的形態(tài)學(xué)特征和惡性腫瘤的生物學(xué)特征,研究JNA生長的調(diào)節(jié)因素對于全面了其發(fā)病機(jī)制與提高患者預(yù)后具有重要的價(jià)值。腫瘤中血管增殖活躍程度與其生物學(xué)行為密切相關(guān),如腫瘤的生長、浸潤、轉(zhuǎn)移均與血管生成密切相關(guān),腫瘤內(nèi)VEGF與MVD水平是重要的反應(yīng)良惡性腫瘤增殖狀況的指標(biāo)。與其他具有廣泛作用的成纖維細(xì)胞生長因子(Fibroblast growth factor,FGF)、血小板衍生生長因子(Platelet derived growth factor,PDGF)等不同的是,VEGF是唯一對血管形成具有特異性促進(jìn)增殖作用的因子。因此有必要進(jìn)一步評估JNA與VEGF的臨床相關(guān)性。過往研究顯示JNA本質(zhì)為真性血管瘤,其組織內(nèi)血管處于過度增殖狀態(tài),而VEGF在JNA中有較高表達(dá),對有較強(qiáng)的促血管生成作用[13]。此外在JNA中TGF-β、HIF-1α表達(dá)異常增高、進(jìn)而調(diào)控VEGF表達(dá)增高,促進(jìn)瘤體血管生成。

HSP90與腫瘤促生成因子VEGF及激素如ER之間具有復(fù)雜的交叉調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。HSP90分子伴侶是一個(gè)普遍存在的蛋白質(zhì)家族,其通過調(diào)節(jié)大型多蛋白復(fù)合物和配體蛋白的折疊和/或組裝來參與多種細(xì)胞功能,直接或間接地調(diào)節(jié)包括適應(yīng)壓力、細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和血管生成在內(nèi)的多種細(xì)胞過程[14]。HSP90下游大概約200多種靶蛋白,其中大部分與腫瘤發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移密切相關(guān),是腫瘤號通路的一個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)[15]。有研究顯示HSP90-ERK-VEGF信號通路在腸癌所致血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和管狀生成中發(fā)揮重要作用[16]。也有研究顯示抑制HSP90活性是治療胰腺癌的有效方式,抑制HSP90可中斷對吉西他濱和5-FU耐藥的胰腺癌細(xì)胞中包括VEGF信號通路在內(nèi)的多個(gè)關(guān)鍵致癌信號級聯(lián)反應(yīng),進(jìn)而有效的抑制癌細(xì)胞抗凋亡和增殖[17]。此外最近的研究表明,HSP90與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān),其中包括許多激素依賴性腫瘤[18]。從機(jī)制上來講HSP90可以通過與ER、PR和糖皮質(zhì)激素等游離類固醇激素受體結(jié)合來維持激素的穩(wěn)定和失活狀態(tài)進(jìn)一步調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展。此外還有研究顯示激素受體和VEGF之間的相互作用可能參與JNA的發(fā)生和發(fā)展[19]。

本研究評估了HSP90的表達(dá)并評估了其與JNA臨床病理學(xué)變量之間的關(guān)聯(lián),發(fā)現(xiàn)JNA中HSP90的高表達(dá)與原發(fā)腫瘤切除后的高復(fù)發(fā)率相關(guān)。這與之前的研究結(jié)果一致,即HSP90的高表達(dá)是多種癌癥預(yù)后不良的標(biāo)志物[20]。此外本研究還發(fā)現(xiàn)HSP90的表達(dá)與MVD和VEGF等腫瘤血管生成相關(guān)因子顯著正相關(guān)。這些結(jié)果預(yù)示著HSP90可能是阻斷JNA術(shù)后復(fù)發(fā)的有效分子靶點(diǎn)之一。

目前已知的HSP90抑制劑主要有格爾德霉素及其衍生物、根赤殼菌素、新生霉素以及以嘌呤結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的化合物4大類[21-24]。這些抑制劑可以通過抑制HSP90功能來破壞分子伴侶復(fù)合物結(jié)構(gòu),推動(dòng)下游蛋白酶體降解,進(jìn)一步增加腫瘤細(xì)胞對治療的敏感性并優(yōu)化藥物功效。此外更多的HSP90抑制劑正在進(jìn)行藥物試驗(yàn)中,考慮到JNA的惡性腫瘤的生物學(xué)特征,進(jìn)一步評估HSP90抑制劑在JNA治療中的價(jià)值對于防治JNA及改善JNA患者預(yù)后是有必要的。本研究尚存在一些局限性,由于JNA是一種侵犯顱底孔、神經(jīng)和血管的腫瘤,臨床實(shí)踐中存在難以準(zhǔn)確評估邊緣狀態(tài)的困難。目前尚缺乏HPS90在JNA中的分子機(jī)制研究。因此,多中心、前瞻性研究及進(jìn)一步深入的機(jī)制研究是必須的,這有助于進(jìn)一步闡明HSP90在JNA復(fù)發(fā)中的功能及意義,從而為臨床防治JNA及改善預(yù)后提供有益參考價(jià)值。

4 結(jié)論

本研究表明HSP90高表達(dá)與JNA復(fù)發(fā)相關(guān),HSP90可能通過穩(wěn)定雌激素受體及血管生成因子來發(fā)揮促JNA復(fù)發(fā)作用。此外本研究從臨床角度強(qiáng)調(diào)了應(yīng)用HSP90抑制劑是預(yù)防JNA術(shù)后復(fù)發(fā)、改善JNA患者預(yù)后的潛在的有效方法之一。