金美 巴桑 次仁

(日喀則市人民醫(yī)院,西藏 日喀則 857000)

結(jié)直腸癌是全球第三大常見(jiàn)惡性腫瘤,是導(dǎo)致癌因性死亡的第二大原因[1],對(duì)人類健康造成了極大的影響,我國(guó)近年來(lái)的結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡率均持續(xù)升高,造成了嚴(yán)重的癌癥負(fù)擔(dān)[2-3]。因惡性腫瘤發(fā)生早期無(wú)特異性的癥狀,且受健康檢查意識(shí)薄弱、漏診及結(jié)腸鏡檢查覆蓋不全等綜合因素影響,多數(shù)結(jié)直腸癌患者就診時(shí)已失去最佳手術(shù)時(shí)機(jī),預(yù)后不佳。因此探索結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制,尋找新的治療靶點(diǎn)對(duì)于結(jié)直腸癌的防治有重要意義。多項(xiàng)研究證實(shí),非編碼RNA參與癌癥表型,關(guān)于非編碼RNA的干預(yù)研究為結(jié)直腸癌的治療提供了新的前景[4-6]。環(huán)狀核糖核苷酸(circRNA)作為非編碼RNA,能夠調(diào)節(jié)微小RNA(miRNA)和信使RNA(mRNA),并充當(dāng)miRNAs的分子海綿和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,與RNA結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合翻譯蛋白,影響細(xì)胞的生命活動(dòng)[7]。研究發(fā)現(xiàn)circ_胞質(zhì)分裂作用因子1(Dedicator of cytokinesis 1,circ_DOCK1)在結(jié)直腸癌中表達(dá)異常,且能影響人腦血管平滑肌細(xì)胞的增殖和凋亡[8-9]。miR-122-5p作為小型非編碼RNA已經(jīng)被證實(shí)參與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展[10-11]。肽酰脯氨基順?lè)串悩?gòu)酶B(Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase,PPIB)有肽酰脯氨基順?lè)串悩?gòu)催化活性,在miRNA調(diào)控下能發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用,促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖[12]。故本研究探討circ_DOCK1通過(guò)調(diào)節(jié)miR-122-5p/PPIB軸對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響,以期為結(jié)直腸癌的靶向治療提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本 選取2020年5月—2021年5月收治的經(jīng)病理診斷證實(shí)且術(shù)前未接受化療的30例結(jié)直腸癌患者癌組織與癌旁組織標(biāo)本(距離癌組織5 cm),患者年齡36～80歲,男性18例,女性12例,平均(64.69±10.58)歲;分化程度:高分化4例,中分化15例,低分化11例;TNM分期:I/II期12例,III/IV期18例。研究項(xiàng)目經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),且患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480株(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)),10%胎牛血清、1%雙抗(鏈霉素+青霉素)(南京科佰生物科技有限公司)DMEM培養(yǎng)基,于37 ℃、5% CO2密閉式孵箱內(nèi)培養(yǎng)。Trizol RNA抽提試劑、熒光素酶檢測(cè)試劑盒、LipofectamineTM3000陽(yáng)離子脂質(zhì)體(美國(guó)Invitrogen公司),circ_DOCK1干擾質(zhì)粒(sh-circ_DOCK1),miR-17-5p反義寡核苷酸重組質(zhì)粒(anti-miR-17-5p)和miR-17-5p模擬物(miR-17-5p mimics)(蘇州吉瑪基因股份有限公司);3550UV酶標(biāo)儀、7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、電泳儀、CheniDoc XRS化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(Bio-rad公司),徠卡生物倒置顯微鏡(德國(guó)Leica公司)。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)circ_DOCK1、miR-122-5p、PPIB表達(dá)水平 結(jié)腸癌組織和癌旁組織加入液氮中研磨,以Trizol試劑盒提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA,分別擴(kuò)增circ_DOCK1、miR-122-5p、PPIB和內(nèi)參U6及β-actin基因,引物序列設(shè)計(jì)由上海生工生物工程有限公司合成,制備PCR反應(yīng)體系,2×Sybgreen預(yù)混合物10 μL,cDNA模板8.8 μL,上下游引物各0.6 μL,總體積20 μL,嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,在PCR結(jié)束后直接獲取目的基因相對(duì)表達(dá)水平(本研究細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次)。

1.4 人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480,1×104/孔密度接種于96孔板中,至細(xì)胞融合率達(dá)到70%,按照LipofectamineTM3000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,分別轉(zhuǎn)染sh-circ_DOCK1(sh-circ_DOCK1組)、干擾對(duì)照載體(NC-circ_DOCK1組)和sh-circ_DOCK1+anti-miR-17-5p(挽救組)。

1.5 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)0 h、24 h、48 h和72 h時(shí)分別在培養(yǎng)孔中加入10 μL的CCK-8工作液,37 ℃孵育2 h,酶標(biāo)儀檢450 nm處的吸光度(A)值,繪制生長(zhǎng)曲線。

1.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以1×104/孔密度接種于6孔板中,24 h待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后以10 μL移液槍頭在培養(yǎng)板中劃直線,更換為含10%血清的新鮮培養(yǎng)液,37 ℃、5%CO2環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng),48 h后倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞1×105個(gè)接種于Transwell小室上室,加入200 μL無(wú)血清培養(yǎng)液,下室加入500 μL的DMEM培養(yǎng)基,孵育箱培養(yǎng)48 h,去除上室細(xì)胞,4%多聚甲醛固定,0.1%結(jié)晶紫染色15 min,晾干后拍照計(jì)算穿模細(xì)胞數(shù)。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 細(xì)胞接種于24孔板,貼壁后待轉(zhuǎn)染,將含有miR-122-5p潛在結(jié)合位點(diǎn)的circ_DOCK13′非翻譯區(qū)(3′-untranslated region,3′UTR)和UPF1 3′-UTR熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒(PmirGLO)和結(jié)合位點(diǎn)突變的熒光素酶質(zhì)粒與anti-miR-17-5p、miR-17-5p mimics共轉(zhuǎn)染至人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480,孵育48 h,按照熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 臨床標(biāo)本circ_DOCK1、miR-122-5p、PPIB表達(dá)水平比較 與癌旁組織比較,癌組織的circ_DOCK1、PPIB mRNA表達(dá)量升高,miR-122-5P表達(dá)量下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖1、2。

圖1 癌組織與癌旁組織circ_DOCK1、PPIB mRNA表達(dá)量比較

圖2 癌組織與癌旁組織circ_DOCK1、miR-122-5p、PPIB mRNA表達(dá)電泳圖

2.2 人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480 circ_DOCK1、miR-122-5p、PPIB表達(dá)水平比較 與挽救組和NC-circ_DOCK1組比較,sh-circ_DOCK1組的circ_DOCK1和PPIB mRNA表達(dá)量下降,miR-122-5p表達(dá)量升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);挽救組和NC-circ_DOCK1組的circ_DOCK1、miR-122-5p及PPIB mRNA表達(dá)量比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)圖3、4。

圖3 Circ_DOCK1、miR-122-5p、PPIB表達(dá)水平比較

2.3 人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480增殖情況比較 3組轉(zhuǎn)染后0 h、24 h的A值比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),sh-circ_DOCK1組的48 h和72 h的A值低于挽救組和NC-circ_DOCK1組(P<0.05),挽救組和NC-circ_DOCK1的A值比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖5。

圖4 人結(jié)直腸癌細(xì)胞circ_DOCK1、miR-122-5p、PPIB mRNA表達(dá)電泳圖

圖5 人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480增殖情況比較

2.4 人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480遷移和侵襲情況比較sh-circ_DOCK1組的細(xì)胞遷移率和穿膜細(xì)胞數(shù)均低于挽救組和NC-circ_DOCK1組(P<0.05),挽救組和NC-circ_DOCK1的細(xì)胞遷移率和穿膜細(xì)胞數(shù)比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表1、圖6、7。

表1 人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480遷移和侵襲情況比較

圖6 細(xì)胞遷移情況

圖7 細(xì)胞侵襲情況

2.5 circ_DOCK1與miR-122-5p的靶向關(guān)系驗(yàn)證 利用生物信息學(xué)軟件TargetScan、miRwalk初步預(yù)測(cè)circ_DOCK1與miR-122-5p 3′UTR的結(jié)合位點(diǎn),顯示circ_DOCK1序列中含有與miR-122-5p互補(bǔ)的核苷酸序列,見(jiàn)圖8。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示,轉(zhuǎn)染miR-122-5p mimics后,circ_DOCK1的野生型熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒相對(duì)活性降低,轉(zhuǎn)染anti-miR-122-5p后,circ_DOCK1的野生型熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒相對(duì)轉(zhuǎn)錄活性增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),轉(zhuǎn)染miR-122-5p mimics、anti-miR-122-5p的circ_DOCK1突變型熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒相對(duì)活性值無(wú)明顯變化(P>0.05)。見(jiàn)表2。

圖8 circ_DOCK1與miR-122-5p的結(jié)合位點(diǎn)

表2 circ_DOCK1熒光素酶活性

3 討論

隨著基因檢測(cè)、篩查等技術(shù)的進(jìn)步,尋找惡性腫瘤的基因治療靶點(diǎn)成為研究熱點(diǎn)。circRNA作為新型的內(nèi)源性非編碼RNA,是由前mRNA和非編碼RNA的非規(guī)范反向剪接產(chǎn)生的單鏈RNA的共價(jià)環(huán),較線性的RNA更為穩(wěn)定,在真核細(xì)胞中廣泛存在,參與控制細(xì)胞周期、腫瘤發(fā)生和化學(xué)抗性[13-14]。有研究證實(shí),circRNA調(diào)節(jié)的主要機(jī)制之一是作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA或RBP分子海綿調(diào)控靶基因的表達(dá),影響惡性腫瘤的進(jìn)展[15]。

DOCK1屬于胞質(zhì)分裂貢獻(xiàn)因子家族成員,具有鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子活性,而DOCK1異常是多種免疫缺陷疾病的重要原因。DOCK1在甲狀腺癌、肝癌、骨肉瘤等多種惡性腫瘤中具有促癌基因?qū)傩?參與腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)來(lái)自circRNA的DOCK1能過(guò)抑制甲狀腺細(xì)胞中的miR-124的表達(dá),阻斷anus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子/腺苷5′-單磷酸活化蛋白激酶信號(hào)通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),并參與通過(guò)下調(diào)miR-124導(dǎo)致甲狀腺癌的發(fā)生;還可通過(guò)miR-654-5p/SMAD同源物2軸抑制肝癌的進(jìn)展,并能調(diào)節(jié)miR-339-3p/胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體軸促進(jìn)成骨肉瘤的腫瘤發(fā)生和順鉑耐藥[16-18]。一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),miR-122-5p能通過(guò)細(xì)胞分裂周期和細(xì)胞凋亡調(diào)控因子1增強(qiáng)腸上皮細(xì)胞放射敏感性,加重小鼠放射性直腸損傷[19]。Yin等[20]一項(xiàng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,miR-122-5p亦能受circ_0007142的調(diào)節(jié),啟動(dòng)下游CDC25A促進(jìn)結(jié)直腸癌的進(jìn)展。以上研究說(shuō)明一種circRNA可調(diào)控多種靶基因,而一個(gè)靶基因受多種circRNA的調(diào)控。PPIB具有肽酰脯氨基順?lè)串悩?gòu)催化活性,當(dāng)其順?lè)串悩?gòu)的催化活性被阻斷,則作為細(xì)胞外基質(zhì)主要成分的膠原蛋白成熟被延遲,而細(xì)胞外基質(zhì)是癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移需要突破的第一道屏障[21]。在本研究中發(fā)現(xiàn)circ_DOCK1、PPIB mRNA在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá),miR-122-5p低表達(dá);在SW480細(xì)胞中抑制circ_DOCK1的表達(dá),而miR-122-5p表達(dá)升高,PPIB mRNA表達(dá)下降,且SW480細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲能力下降,說(shuō)明circ_DOCK1和PPIB在結(jié)直腸癌中高表達(dá),而miR-122-5p低表達(dá),敲低circ_DOCK1能影響miR-122-5p和PPIB表達(dá),并抑制結(jié)直腸癌的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。

本研究為了評(píng)估circ_DOCK1在SW480細(xì)胞能夠由miR-122-5p介導(dǎo),將敲低circ_DOCK1的細(xì)胞共轉(zhuǎn)染anti-miR-17-5p,結(jié)果逆轉(zhuǎn)了敲低circ_DOCK1的作用效應(yīng)。此外通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-122-5p mimics后,circ_DOCK1的野生型熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒相對(duì)活性降低,轉(zhuǎn)染anti-miR-122-5p后circ_DOCK1的野生型熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒相對(duì)轉(zhuǎn)錄活性增加,說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-122-5p能結(jié)合circ_DOCK1抑制報(bào)告基因熒光素酶活性,證明了兩者的靶向關(guān)系,即circ_DOCK1在結(jié)直腸癌中充當(dāng)miR-122-5p的分子海綿,競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-122-5p,調(diào)節(jié)PPIB,影響結(jié)直腸癌的進(jìn)展。

4 結(jié)論

綜上所述,circ_DOCK1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)異常升高,并可通過(guò)調(diào)節(jié)miR-122-5p/PPIB軸影響結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。