徐桂萍 陳哲 王曉麗 古文玉

心肌缺血患者的臨床治療通常首選再灌注治療，然而缺血心肌再灌注往往會(huì)引起由氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等造成的心肌細(xì)胞凋亡和壞死，即心肌缺血再灌注損傷（MIRI）[1]，嚴(yán)重影響臨床治療效果及患者預(yù)后。

微小RNA（miRNA）是長(zhǎng)度約為22 個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA 分子，參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控。研究表明，miRNA 廣泛參與調(diào)節(jié)與MIRI有關(guān)的心臟疾病的分子通路[2-3]，在MIRI 的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。miR-27a 在缺血再灌注（I/R）心肌中顯著上調(diào)[4]。miR-27a 過表達(dá)還可導(dǎo)致細(xì)胞活力降低、乳酸脫氫酶（LDH）和肌酸激酶同工酶（CK-MB）分泌增加以及細(xì)胞凋亡率增加[5]。目前對(duì)miR-27a 調(diào)控的下游靶基因研究較少。

核轉(zhuǎn)錄因子紅系2 相關(guān)因子2（Nrf2）為氧化還原感應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞防御的調(diào)節(jié)，介導(dǎo)細(xì)胞修復(fù)或再生，具有抗炎、抗凋亡的作用[6]。研究表明，Nrf2 在減輕MIRI 中起重要作用[7]，其活性受miRNA 調(diào)節(jié)[8]。Narasimhan 等[9]研究表明，miR-144、miR-153、miR27a 和miR142-5p 可通過結(jié)合 Nrf2 的3'非翻譯區(qū)（3'-UTR）抑制內(nèi)源性Nrf2 的mRNA 表達(dá)水平，繼而影響Nrf2 激活，誘發(fā)各種疾病。生物信息學(xué)分析軟件示miR-27a可特異地與Nrf2 的3'-UTR 結(jié)合，本研究探討miR-27a 通過Nrf2 對(duì)大鼠MIRI 的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

AAV9-miR-27a 腺相關(guān)病毒購(gòu)于上海漢恒生物科技有限公司。miR-27a antagomir 購(gòu)于上海誠(chéng)鑫生物科技有限公司，大鼠心肌肌鈣蛋白T（cTn-T）、CK-MB、LDH 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒購(gòu)于中國(guó)Elabscience 公司。谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒購(gòu)于中國(guó)Elabscience 公司?？筃rf2 抗體購(gòu)于美國(guó)Affinity 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

40 只2～3 月齡雄性成年清潔級(jí)SD 大鼠購(gòu)于新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，體質(zhì)量220～280 g，許可證編號(hào)：SCXK（新）2018-0003。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為4 組（每組10 只）：假手術(shù)組（Sham組）、I/R 組、AAV9-miR-27a 過表達(dá)+心肌缺血再灌注組（AAV 組）、miR-27a antagomir+心肌缺血再灌注組（AG 組）。AAV 組于缺血前14 d，尾靜脈單次注射AAV9-miR-27a 腺相關(guān)病毒（2×1011v.g./只大鼠），Sham 組、I/R 組、AG 組尾靜脈單次注射與腺相關(guān)病毒同等容積的生理鹽水。AG 組于缺血前3 d，連續(xù)尾靜脈注射miR-27a antagomir（2～10 mg/kg），Sham 組、I/R 組、AAV 組連續(xù)尾靜脈注射與miR-27a antagomir 同等容積的生理鹽水。

1.3 MIRI動(dòng)物模型的制備

術(shù)前禁食禁水8 h，腹腔注射10%水合氯醛溶液0.33 mL/100 g 進(jìn)行麻醉，左側(cè)胸部脫毛，氣管插管后，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)維持呼吸。將大鼠仰臥，四肢固定于循環(huán)加熱手術(shù)臺(tái)上，連接心電圖。隨后消毒皮膚，在胸骨左側(cè)第3、4 肋間切開皮膚，逐層鈍性分離，充分暴露心臟。經(jīng)心肌表面于心耳下緣1 mm 處用6-0 縫合針結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支。心電圖ST 段抬高提示心肌缺血。缺血30 min 后，松開結(jié)扎線，觀察到左心室恢復(fù)紅潤(rùn)，心電圖ST 段抬高部分回落，提示再灌注成功，再灌注時(shí)間共為120 min。Sham 組穿線后不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈。

1.4 心肌梗死面積測(cè)定

再灌注120 min 后，每組隨機(jī)取5 只大鼠，立即處死并取出心臟，沖洗后-20 ℃冰箱保存120 min，沿心臟長(zhǎng)軸方向?qū)⑿募∏谐珊穸燃s2 mm 的薄片，2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色后，37 ℃避光孵育15 min，中性甲醛固定15 min。染色后，心肌梗死區(qū)呈灰白色，缺血區(qū)呈紅色，非缺血區(qū)呈藍(lán)色。采用ImageJ 圖像軟件分析，心肌梗死面積百分比＝心肌梗死區(qū)面積÷缺血區(qū)面積×100%[10]。

1.5 血清cTnT、CK-MB和LDH水平測(cè)定

再灌注120 min 后，隨機(jī)取5 只大鼠，經(jīng)腹主動(dòng)脈穿刺取血，4 ℃、3 500 轉(zhuǎn)/min 離心15 min，離心半徑5 cm，離心后取上清液。采用ELISA 法測(cè)定血清cTnT、CK-MB 和LDH 水平。

1.6 心肌組織GSH、SOD和MDA水平測(cè)定

穿刺取血后，取大鼠心肌缺血再灌注組織120 mg，離心后取上清液。采用ELISA 法測(cè)定GSH、SOD 和MDA 水平。

1.7 缺血心肌組織miR-27a表達(dá)水平測(cè)定

穿刺取血后，取大鼠心肌缺血再灌注組織100 mg，加入1 mL Trizol 溶液提取組織中的總RNA。將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)法進(jìn)行擴(kuò)增，以U6 作為內(nèi)參。miR-27a 上游引物：5'-CGGCCTCAGTGAGCGA-3'；下游引物：5'-AGGAACCCCTAGTGATG-3'。擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。使用2-ΔΔCT公式計(jì)算miR-27a 的相對(duì)表達(dá)水平。

1.8 Western blot法測(cè)定心肌組織Nrf2的表達(dá)

取少量左心室組織，提取總蛋白，進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。取60 μg 總蛋白進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜，用含5%脫脂奶粉的TBST 封閉2 h。加入抗Nrf2 抗體（1 ∶1 000，美國(guó)Affinity 公司），4 ℃孵育過夜。洗滌后加入二抗（稀釋1 ∶10 000，美國(guó)Santa Cruz 公司），室溫孵育2 h。ECL 顯影，用ImageJ 軟件測(cè)定條帶灰度值。目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平為目的蛋白與內(nèi)參GAPDH 條帶灰度值的比值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 26.0 軟件和GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較使用單因素方差分析，2 組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠心肌梗死面積及血清cTnT、CK-MB和LDH水平比較

與Sham 組比較，I/R 組心肌梗死面積百分比及血清cTnT、CK-MB 和LDH 水平均升高（P均＜0.05）；與I/R 組比較，AAV 組心肌梗死面積百分比及血清cTnT、CK-MB 和LDH 水平均升高（P均＜0.05）；與AAV 組比較，AG 組心肌梗死面積百分比及血清cTnT、CK-MB 和LDH 水平均降低（P均＜0.05）。見表1。

表1 4組大鼠心肌梗死面積及血清cTn-T、CK-MB和LDH水平比較（n＝5）

2.2 4組心肌組織GSH、SOD和MDA水平比較

與Sham 組比較，I/R 組心肌組織GSH、SOD水平降低，MDA 水平升高（P均＜0.05）；與I/R組比較，AAV 組心肌組織GSH、SOD 水平降低，MDA 水平升高（P均＜0.05）；與AAV 組比較，AG 組心肌組織GSH、SOD 水平升高，MDA 水平降低（P均＜0.05）。見表2。

表2 4組大鼠心肌組織GSH、SOD和MDA水平比較（n＝5）

2.3 4組大鼠心肌組織中miR-27a及Nrf2表達(dá)水平比較

與Sham 組（0.70±0.57）比較，I/R 組miR-27a 表達(dá)水平（1.28±0.43）升高；與I/R 組比較，AAV 組miR-27a 表達(dá)水平（1.57±0.27）升高；與AAV 組比較，AG 組miR-27a 表達(dá)水平（1.01±0.37）降低（P均＜0.05）。

與Sham 組比較，I/R 組Nrf2 的蛋白表達(dá)水平明顯降低；與I/R 組比較，AAV 組Nrf2 的蛋白表達(dá)水平明顯降低；與AAV 組比，AG 組Nrf2 的蛋白表達(dá)水平明顯升高（P均＜0.05）。見圖1。

圖1 4組大鼠心肌組織Nrf2的蛋白表達(dá)情況

3 討論

心肌缺血后，心肌組織血液供應(yīng)減少或中斷，恢復(fù)缺血梗死區(qū)血供是治療缺血性心肌病的主要手段。然而心肌血流恢復(fù)可能加重心肌細(xì)胞的損傷，引起心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激加重和細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致心力衰竭[11]。Liu 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在I/R 小鼠的心肌中miR-27a 的表達(dá)明顯增加，且下調(diào)miR-27a抑制了胸段硬膜外高位阻滯對(duì)小鼠MIRI 的保護(hù)作用。Bao 等[13]的研究表明，miR-27a 通過靶向三磷酸腺苷酶家族蛋白3A（ATAD3A），調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）從線粒體到細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而促進(jìn)MIRI。Lin 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miR-27 和miR-195 在缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，可抑制部分轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，而抑制miR-27 和miR-195可部分逆轉(zhuǎn)這些轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。上述研究均表明，miR-27a 在MIRI 過程中發(fā)揮著重要作用。

Liu 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)沉默Nrf2基因時(shí)，缺氧對(duì)miR-27a 的抑制作用被逆轉(zhuǎn)。Wang 等[16]通過小鼠六價(jià)鉻[Cr(VI)]模型，證實(shí)Nrf2是miR-27a/b的直接靶標(biāo)，抑制miR-27a/b 使小鼠在Cr(VI)暴露的早期和晚期出現(xiàn)Nrf2上調(diào)。Teimouri 等[17]研究表明，miR-27a 的過表達(dá)可抑制Nrf2及其下游抗氧化基因的表達(dá)并增加活性氧的產(chǎn)生，而抑制miR-27a的表達(dá)逆轉(zhuǎn)了這些作用。因此，Nrf2可能是miR-27a潛在的下游靶點(diǎn)。

本研究結(jié)果表明，MIRI 大鼠心肌組織中miR-27a的表達(dá)水平顯著增高，通過感染miR-27a 腺相關(guān)病毒使miR-27a 過表達(dá)，大鼠心肌梗死面積及血清cTn-T、CK-MB 和LDH 水平增加，心肌組織GSH、SOD 水平降低，MDA 水平增加，表明缺血心肌損傷加重，氧化應(yīng)激水平增強(qiáng)。而抑制miR-27a 的表達(dá)則可顯著改善心肌損傷及氧化應(yīng)激水平，提示miR-27a 加重大鼠MIRI。為探究miR-27a 加重大鼠MIRI 的分子機(jī)制，即miR-27a 潛在的下游靶點(diǎn)，本研究通過Western blot 檢測(cè)相關(guān)蛋白，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-27a 可抑制Nrf2的表達(dá)，這與我們?cè)赥argetscan 軟件中預(yù)測(cè)miR-27a 可特異性與Nrf2的3'-UTR 結(jié)合、抑制Nrf2表達(dá)一致。

以上研究表明，miR-27a 可能通過抑制Nrf2表達(dá)，增強(qiáng)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，從而加重MIRI。