袁銘君，李軍德，邢建永，高巍，閆士猛，張?zhí)?

1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心/道地藥材品質(zhì)保障與資源持續(xù)利用全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100700；

2.華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司，廣東 深圳 518110；

3.華潤(rùn)三九（六安）中藥材產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司，安徽 六安 237300

蘋果酸脫氫酶（malate dehydrogenase，MDH）是一類廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物中的氧化還原酶[1]，主要參與三羧酸循環(huán)（TCA）、乙醛酸循環(huán)、蘋果酸-天冬氨酸循環(huán)等代謝途徑，是TCA的關(guān)鍵酶之一[2]，可催化蘋果酸與草酰乙酸之間的可逆轉(zhuǎn)換；此外，MDH 還參與了糖異生、氮同化、氨基酸合成、C4 循環(huán)[3]。目前MDH 已在多個(gè)領(lǐng)域有所應(yīng)用，如亞種鑒定[4]、寄生蟲(chóng)疾病診斷[5]、抑制癌細(xì)胞[6]等。依據(jù)細(xì)胞內(nèi)定位不同，MDH 產(chǎn)生了多種同工酶，常見(jiàn)的有胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶1（MDH1）和線粒體蘋果酸脫氫酶2（MDH2）[7]。李思光等[8]對(duì)泰和烏骨雞肝、腎、眼、肌、腦和心6種組織中的MDH同工酶做了研究，發(fā)現(xiàn)不同組織中酶的分布各不相同，表現(xiàn)出明顯的組織特異性；劉大林等[9]發(fā)現(xiàn)MDH基因可能是影響雞屠宰性狀和繁殖性狀的主效基因；雞肝臟MDH活性與其腹脂沉積、脂肪代謝有關(guān)[10]。本課題組前期對(duì)家雞砂囊內(nèi)壁蛋白質(zhì)組分進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)砂囊內(nèi)壁中含有MDH，豐度較高，且為MDH2，關(guān)于家雞及其他禽類中MDH2的研究較少，其具有何種功能有待進(jìn)一步探索。因此，本研究以家雞砂囊內(nèi)壁互補(bǔ)脫氧核糖核酸（cDNA）為模板，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）克隆家雞MDH2基因序列，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析；同時(shí)，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)研究家雞各組織/器官內(nèi)MDH2基因相對(duì)表達(dá)量的差異；最后構(gòu)建原核表達(dá)載體，以期為后續(xù)研究提供參考。

1 材料

1.1 樣品

選取8 只健康家雞，屠宰后迅速采集新鮮心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、砂囊內(nèi)壁組織，分裝于5 mL凍存管中放入液氮中速凍，隨后轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試藥

RNAprep pure 動(dòng)物組織總核糖核酸（RNA）提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司，批號(hào)：w0206]；Takara Primescript Ⅱ 1ststrand cDNA synthesis kit（批號(hào)：AL61653A）、PrimeSTAR?HS DNA Polymerase（批號(hào)：P10430）均購(gòu)于寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；膠回收試劑盒（賽默飛世爾科技公司，批號(hào)：00965432）；pEASY-Blunt Cloning kit 型載體（批號(hào)：P41202）、2×M5 SuperFastTaq聚合酶（批號(hào)：22CB0801）、2×TranTaqHiFi PCR SuperMix（批號(hào)：Q10211）均購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA 限制性內(nèi)切酶BamHI-HF（批號(hào)：10133331）、HindⅢ-HF（批號(hào)：10119609）均購(gòu)于NEB公司；無(wú)縫克隆試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司，批號(hào)：H907KB1513]；pET 32a（+）（武漢淼靈生物科技有限公司）；考馬斯亮藍(lán)（批號(hào)：415E031）、氨芐青霉素（Amp，批號(hào)：20220429）、磷酸鹽緩沖液（PBS，批號(hào)：20220315）均購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；Plasmid Mini kit Ⅰ質(zhì)粒DNA 小量提取試劑盒Ⅰ（Omega 公司，批號(hào)：D6943020000E19U095）；DH5α感受態(tài)細(xì)胞（批號(hào)：CP0050）、BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞（批號(hào)：WR150）均購(gòu)于華越洋生物科技有限公司。

1.3 儀器

SHA-C 型恒溫水浴振蕩器（常州潤(rùn)華電器有限公司）；Veriti?型PCR 儀、NanoDrop 2000 型微量核酸定量分析儀（美國(guó)Thermo 公司）；QL-901 Vortex型漩渦震蕩儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；G:BOX F3 SYNGENE 型凝膠成像系統(tǒng)（Syngene 公司）；Centrifuge 5810R 型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司）；HWS-28型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；SCIENTZ08-Ⅱ型超聲破碎儀（寧波新芝生物科技有限公司）；CEBO-24 型高通量組織研磨儀（上海測(cè)博生物科技發(fā)展中心）；Microfuge 20R 型臺(tái)式冷凍離心機(jī)（德國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司）；BSC-IIA2 型生物安全柜（北京東聯(lián)哈爾儀器有限公司）；JP-300 型電熱恒溫培養(yǎng)箱（武漢市武昌實(shí)驗(yàn)儀器廠）；DYY-6C 型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；Bio-Rad 型電泳儀（美國(guó)安諾倫生物公司）；PowerLook 2100XLUSB 型蛋白凝膠成像系統(tǒng)[世群國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司]。

2 方法

2.1 引物設(shè)計(jì)與合成

參照GenBank（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）中的家雞MDH2的mRNA 序列（登錄號(hào)：XM_040687148），使用Primer Premier 6.0 軟件設(shè)計(jì)引物，引物詳細(xì)信息見(jiàn)表1，引物均由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。

表1 MDH2引物及內(nèi)參引物序列信息

2.2 基因克隆

2.2.1 總RNA 提取與cDNA 合成 取新鮮組織50～100 mg，加入液氮中充分研磨。按照RNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取RNA。使用NanoDrop 2000 型微量核酸定量分析儀和1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 質(zhì)量。按 照Takara Primescript Ⅱ 1ststrand cDNA synthesis kit 說(shuō)明書(shū)，以RNA 為模板，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，產(chǎn)物于-20 ℃冰箱中保存。

2.2.2 PCR 擴(kuò)增 以cDNA 為模板，使用引物MDH2-F1 和MDH2-R1 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)體系（50 μL）：cDNA模板1 μL，上下游引物各2 μL，5×PrimeSTAR Buffer 10 μL，dNTP Mixture 4 μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5 μL，水30.5 μL。PCR 反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性30 s，50 ℃退火15 s，72 ℃延伸90 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，按照膠回收試劑盒純化獲取目的片段，測(cè)序。

2.2.3 pEasy-MDH2 重組質(zhì)粒的克隆與鑒定 將2.2.2項(xiàng)下所得回收目的片段與pEASY-Blunt克隆載體在25 ℃金屬浴下連接15 min。連接體系（5 μL）：膠回收產(chǎn)物4 μL，pEASY-Blunt 克隆載體1 μL。取連接產(chǎn)物5 μL 轉(zhuǎn)化至Trans-T1 感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30 min，42 ℃熱激30 s，加入450 μL 的LB 液體培養(yǎng)基（不含抗生素）37 ℃，200 r·min-1活化1 h。1500×g離心1 min，棄部分上清液，留200 μL 吹打混勻，涂布于LB 固體培養(yǎng)基（含Amp）上，37 ℃培養(yǎng)12 h 后挑取菌落，放入具有Amp 抗性的LB 液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。利用菌液PCR 方法鑒定分析pEasy-MDH2 陽(yáng)性克隆，并測(cè)序鑒定，提取質(zhì)粒DNA，-20 ℃冰箱保存。

2.3 生物信息學(xué)分析

2.3.1 同源性分析 從美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI，https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)下載其他物種的MDH2 蛋白序列，使用MEGA-X 軟件以Neighbor-Joining 法構(gòu)建MDH2 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2.3.2 理化性質(zhì)分析 使用ExPASy ProtParam tool在線軟件（https://web.expasy.org/protparam/）對(duì)家雞MDH2 蛋白的多項(xiàng)理化性質(zhì)進(jìn)行分析，包括原子數(shù)、相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、不穩(wěn)定指數(shù)、脂肪指數(shù)和親水性平均值等。

2.3.3 親/疏水性、磷酸化位點(diǎn)分析 使用ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/）在線軟件對(duì)家雞MDH2 蛋白的親/疏水性進(jìn)行計(jì)算和分析，采用NetPhos 3.1 Server 在線軟件（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1）預(yù)測(cè)家雞MDH2 蛋白的絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸殘基上的磷酸化位點(diǎn)。

2.3.4 信號(hào)肽、跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和分析 使用SignalP 4.1 在線軟件（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-4.1）預(yù)測(cè)信號(hào)肽，用TMHMM 在線軟件（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0）預(yù)測(cè)蛋白跨膜區(qū)。

2.3.5 二級(jí)結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和分析 用SOPMA 在線軟件（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）分析家雞MDH2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，InterProScan（https://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/）分 析MDH2 的結(jié)構(gòu)域，在SWISS-MODEL 在線軟件（https://swissmodel.expasy.org/interactive）中對(duì)家雞MDH2蛋白進(jìn)行建模。

2.4 家雞MDH2基因在各組織中的表達(dá)分析

以家雞6個(gè)組織cDNA為模板，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)MDH2基因的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增體系（總體積為10 μL）：TB Green Premix ExTaqⅡ 5 μL，上下游引物各0.5 μL，模板1 μL，ddH2O 3 μL。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃變性10 s，60 ℃退火34 s，共40 個(gè)循環(huán)；熔解曲線為94 ℃ 10 s，60 ℃45 s。重復(fù)3 次，以2-ΔΔCt法計(jì)算各組織中MDH2基因的相對(duì)表達(dá)量。最后利用GraphPad Prism 9.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 構(gòu)建原核表達(dá)載體

2.5.1 PCR 擴(kuò)增及膠回收 以2.2.3 項(xiàng)下所提質(zhì)粒DNA 稀釋4 倍后作為模板，使用含酶切位點(diǎn)的引物30-MDH2-F1/R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系（50 μL）：質(zhì)粒DNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，2×TranTaqHiFi PCR SuperMix 25 μL，Nuclease-free water 22 μL。PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸70 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，膠回收純化獲取目的片段。

2.5.2 PET 32a（+）載體雙酶切及回收純化 取PET 32a（+）載體8.4 μL，依次加入10×NEBuffer 5 μL，Nuclease-free water 34.6 μL，BamHI-HF 和Hind Ⅲ-HF 各1 μL，37 ℃酶切3 h。按照OMEGA Cycle Pure kit 試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化，使用2.0%瓊脂糖凝膠和NanoDrop 2000 型微量核酸定量分析儀進(jìn)行檢測(cè)，純化產(chǎn)物-20 ℃冰箱保存。

2.5.3 同源重組及轉(zhuǎn)化 取2×Seamless cloning Master Mix 10 μL，2.4.2 項(xiàng)下所得線性化載體100.4 μL，2.4.1 項(xiàng)下所得膠回收產(chǎn)物0.56 μL，Sterilized ddH2O 補(bǔ)足至20 μL。50 ℃反應(yīng)20 min，反應(yīng)結(jié)束后立即置于冰上冷卻2 min。取反應(yīng)液4 μL至50 μL 的DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30 min，42 ℃熱激45 s 后冰上靜置3 min。加入LB 液體培養(yǎng)基（不含抗生素）450 μL，于37 ℃，200 r·min-1活化1 h。1500×g離心1 min，棄部分上清，留200 μL吹打混勻，涂布于LB 固體培養(yǎng)基（含Amp）上，37 ℃培養(yǎng)12 h 后挑取菌落，放入具有Amp 抗性的LB液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。利用菌液PCR方法鑒定分析pET32a（+）-MDH2 陽(yáng)性克隆，并測(cè)序鑒定，提取質(zhì)粒DNA，-20 ℃冰箱保存。

2.5.4 MDH2 蛋白誘導(dǎo)表達(dá) 將測(cè)序正確的pET32a（+）-MDH2 陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化至BL21（DE3），涂布于具有Amp 抗性的LB 固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜。挑取含有pET32a（+）-MDH2 重組質(zhì)粒的BL21（DE3）陽(yáng)性菌，在含有氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)至600 nm處吸光度（A600nm）為0.6時(shí)，取部分菌液作為對(duì)照組，余下菌液加入1 mmol·L-1IPTG，在16 ℃、200 r·min-1搖床中誘導(dǎo)12 h。取出少量菌液，離心后去上清，沉淀用PBS 重懸后加人等體積的上樣緩沖液，沸水中煮5 min，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），之后用考馬斯亮藍(lán)染色初步鑒定MDH2蛋白是否表達(dá)。

3 結(jié)果與分析

3.1 家雞MDH2基因克隆與測(cè)序

用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 質(zhì)量，可見(jiàn)28S 和18S 兩條明顯條帶，且A260nm/A280nm為1.9～2.0，表明RNA 質(zhì)量較好，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得1 條約1000 bp的特異性條帶（圖1）。切膠回收該片段，進(jìn)行平端克隆與轉(zhuǎn)化，最后進(jìn)行菌落PCR 驗(yàn)證，選取陽(yáng)性克隆測(cè)序，拼接測(cè)序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)MDH2基因cDNA 序列長(zhǎng)度為1120 bp，符合預(yù)期長(zhǎng)度。通過(guò)NCBI ORF-Finder 工具，發(fā)現(xiàn)家雞MDH2基因序列含1 個(gè)完整開(kāi)放閱讀框（ORF），其長(zhǎng)度為1014 bp，編碼337個(gè)氨基酸。

圖1 MDH2基因電泳圖

3.2 家雞MDH2蛋白生物信息學(xué)分析結(jié)果

3.2.1 家雞MDH2 蛋白同源性分析 提交12 個(gè)物種的MDH2 蛋白序列至MEGA-X 軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，并根據(jù)比對(duì)結(jié)果構(gòu)建相應(yīng)的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2 可知，家雞與環(huán)頸雉進(jìn)化距離最短，親緣關(guān)系最近；與黑天鵝、綠頭鴨、日本鵪鶉進(jìn)化距離較小，親緣關(guān)系較近，與大蟾蜍、斑馬魚(yú)、文昌魚(yú)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，而與豬、大家鼠、小家鼠、人的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

圖2 MDH2蛋白的氨基酸序列同源性分析

3.2.2 家雞MDH2 蛋白理化性質(zhì)分析 通過(guò)Prot Param tool分析MDH2蛋白理化性質(zhì)，結(jié)果顯示蛋白分子式為C1592H2630N445O464S17，原子總數(shù)為5121，相對(duì)分子質(zhì)量為35.95 kDa，等電點(diǎn)（pI）為9.17，偏堿性，為堿性蛋白。該基因編碼的337 個(gè)氨基酸中涵蓋了氨基酸的20 個(gè)種類，分別為丙氨酸（Ala，37 個(gè)，11.0%）、亮氨酸（Leu，30 個(gè)，8.9%）、甘氨酸（Gly，28 個(gè)，8.3%）、纈氨酸（Val，28 個(gè)，8.3%）、賴氨酸（Lys，24 個(gè)，7.1%）、異亮氨酸（Ile，22 個(gè)，6.5%）、蘇氨酸（Thr，21 個(gè)，6.2%）、絲氨酸（Ser，20 個(gè)，5.9%）、脯氨酸（Pro，19 個(gè)，5.6%）、谷氨酸（GLU，19 個(gè)，5.6%）、精氨酸（Arg，16 個(gè)，4.7%）、天冬酰胺（Asn，14 個(gè)，4.2%）、苯丙氨酸（Phe，12 個(gè)，3.6%）、天冬氨酸（Asp，11 個(gè)，3.3%）、半胱氨酸（Cys，9 個(gè)，2.7%）、蛋氨酸（Met，8 個(gè)，2.4%）、組氨酸（His，7 個(gè)，2.1%）、谷氨酰胺（Gln，7 個(gè)，2.1%）、酪氨酸（Tyr，4個(gè)，1.2%）、色氨酸（Trp，1 個(gè)，0.3%），不穩(wěn)定指數(shù)=34.19<40，屬于穩(wěn)定蛋白；脂肪指數(shù)為95.25，親水性平均值=0.07>0，為疏水性蛋白。

3.2.3 家雞MDH2 蛋白親/疏水性、磷酸化位點(diǎn)分析結(jié)果 應(yīng)用ProtScale 在線軟件進(jìn)一步分析MDH2蛋白的親/疏水性，結(jié)果見(jiàn)圖3。家雞MDH2 親水性最強(qiáng)的位點(diǎn)位于第282 位的Arg，得分為-2.711；疏水性最強(qiáng)的位點(diǎn)是位于第98 位的Ala，得分為2.167。家雞MDH2蛋白的疏水性氨基酸多于親水性氨基酸，總體屬于疏水蛋白。應(yīng)用NetPhos 3.1 在線軟件預(yù)測(cè)家雞MDH2 蛋白的磷酸化位點(diǎn)，見(jiàn)圖4，共有25個(gè)潛在磷酸化位點(diǎn)（閾值>0.5），其中Ser位點(diǎn)13 個(gè)、Thr位點(diǎn)12 個(gè)、Tyr位點(diǎn)0 個(gè)。但在該蛋白序列中，Thr-60、Ser-118、Ser-145、Ser-249、Ser-287 位點(diǎn)的得分接近閾值（0.5），表明這些位點(diǎn)被磷酸化修飾的置信度非常低，因此，家雞MDH2 蛋白可能的磷酸化位點(diǎn)有25個(gè)。

圖3 家雞MDH2蛋白親/疏水性分析預(yù)測(cè)結(jié)果

圖4 家雞MDH2磷酸化位點(diǎn)

3.2.4 家雞MDH2 蛋白信號(hào)肽、跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和分析結(jié)果 經(jīng)SingnalP 5.0 預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，家雞MDH2 蛋白無(wú)信號(hào)肽。通過(guò)TMHMM Server 2.0 在線軟件分析發(fā)現(xiàn)MDH2 蛋白不含跨結(jié)構(gòu)域，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 家雞MDH2蛋白跨膜結(jié)構(gòu)與預(yù)測(cè)

3.2.5 家雞MDH2蛋白結(jié)構(gòu)域、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和分析 使用InterProScan 軟件分析，發(fā)現(xiàn)MDH2 蛋白屬于MDH 家族，MDH2 蛋白序列的25～167 位氨基酸可形成輔酶Ⅰ（NAD）結(jié)合域，169～332 位可形 成α/βC 端結(jié)合域。通 過(guò)SOPMA 預(yù)測(cè)MDH2 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖6，發(fā)現(xiàn)MDH2 蛋白由4種二級(jí)結(jié)構(gòu)組成，分別為無(wú)規(guī)則卷曲（35.01%）、α-螺旋（40.95%）、β-轉(zhuǎn)角（5.34%）、延伸鏈（18.69%），表明該蛋白質(zhì)的氨基酸處在部分有序的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，利于其功能的正常發(fā)揮，最后利用SWISS-MODEL 對(duì)該蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行建模預(yù)測(cè)，其GMQE 得分為0.90，QMEAN 得分為0.90，結(jié)構(gòu)中存在2 x MLT配體，見(jiàn)圖7。

圖6 SOPMA預(yù)測(cè)MDH2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)

圖7 SWISS-MODE預(yù)測(cè)LMDH2蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)

3.3 MDH2基因的組織表達(dá)分析

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)家雞6 個(gè)組織中MDH2的表達(dá)水平，結(jié)果表明MDH2在6 個(gè)組織中都有表達(dá)，但表達(dá)量存在顯著性差異，脾臟、肺臟組織中幾乎不表達(dá)，在心臟中顯著高于其他組織（圖8）。

圖8 MDH2基因組織表達(dá)分析差異性（,n=8）

3.4 MDH2原核表達(dá)

SDS-PAGE 結(jié)果顯示，誘導(dǎo)的pET-32a(+)-MDH2 重組質(zhì)粒在53 kDa 處有一條特異蛋白條帶（圖9），與預(yù)期大小基本一致。上清和沉淀中均有MDH2 原核表達(dá)，但沉淀中表達(dá)較多，說(shuō)明該重組蛋白主要是以包涵體的形式存在。

圖9 重組MDH2蛋白SDS-PAGE電泳圖

4 小結(jié)與討論

本研究成功克隆了家雞MDH2基因序列，全長(zhǎng)1120 bp，ORF 1014 bp，共編碼337個(gè)氨基酸。同源性分析發(fā)現(xiàn)，家雞MDH2 與環(huán)頸雉親緣關(guān)系最近，與黑天鵝、綠頭鴨、日本鵪鶉親緣關(guān)系較近，與大蟾蜍、斑馬魚(yú)、文昌魚(yú)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，而與豬、大家鼠、小家鼠、人的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，說(shuō)明不同物種間該基因相對(duì)不保守。家雞MDH2 蛋白理化性質(zhì)分析表明，家雞MDH2 相對(duì)分子質(zhì)量為35.95 kDa，pI 9.17，偏堿性，據(jù)報(bào)道蘋果酸脫氫酶MDHs 相對(duì)分子質(zhì)量為30～35 kDa[11]，最適pH 偏堿性（8.0 左右）[1]，家雞MDH2 相對(duì)分子質(zhì)量與理論等電點(diǎn)與文獻(xiàn)報(bào)道范圍接近。ProtParam tool 在線軟件分析結(jié)果還顯示，家雞MDH2 蛋白為穩(wěn)定蛋白，MDH2 蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性在一定程度上取決于分子內(nèi)部的疏水作用，家雞MDH2 蛋白疏水性氨基酸數(shù)量多于親水性氨基酸，該蛋白整體表現(xiàn)為疏水性，所以該蛋白穩(wěn)定性較好。同時(shí)，蛋白磷酸化會(huì)降低該蛋白的穩(wěn)定性，MDH2 的蛋白磷酸化位點(diǎn)僅有25 個(gè)，故再次驗(yàn)證了該蛋白的穩(wěn)定性。Signal1P-4.1在線工具分析結(jié)果表明該蛋白質(zhì)無(wú)信號(hào)肽，說(shuō)明其不是分泌蛋白，該蛋白質(zhì)形成后會(huì)在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用并降解。

MDH2 是三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶之一，MDH2基因在家雞心、肝、脾、肺、腎及雞內(nèi)金中均有表達(dá)，其中，其在心臟內(nèi)的相對(duì)表達(dá)量最高。雞心在雞的生長(zhǎng)代謝中起重要作用，由此推測(cè)MDH2與家雞生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)。MDH2基因在砂囊內(nèi)壁及腎臟組織中的相對(duì)表達(dá)量次于心臟，MDH 廣泛分布于植物、動(dòng)物、微生物，因編碼基因不同而產(chǎn)生了多種同工酶。許多同工酶在一個(gè)物種內(nèi)表現(xiàn)出獨(dú)特的空間和時(shí)間個(gè)體發(fā)生趨勢(shì)，這種趨勢(shì)在許多類群的各種同工酶中得到了證實(shí)，蜜蜂各發(fā)育階段MDH2 酶活性存在差異[12]；不同發(fā)育階段日本沼蝦MDH 同工酶條帶數(shù)目不一致，MDH2只在第2期出現(xiàn)[13]，目前市售雞內(nèi)金主要來(lái)源于家雞，全國(guó)各地均有飼養(yǎng)。家雞根據(jù)用途不同可分為肉用雞、蛋用雞、肉蛋兼用雞，不同用途雞種生長(zhǎng)年限不同，不同生長(zhǎng)年限的MDH2是否會(huì)發(fā)生變化有待進(jìn)一步研究。

MDH還在一些動(dòng)物的品種/亞系鑒定中有所應(yīng)用。據(jù)報(bào)道，西方蜜蜂亞種MDH2基因座3 個(gè)等位基因頻率不同[14]，Nunamaker 等[15]分析了10 個(gè)國(guó)家蜜蜂的血統(tǒng)，進(jìn)一步驗(yàn)證MDH作為區(qū)分蜜蜂品種的可靠性，李舉杯等[16]的研究證實(shí)了意大利蜂、卡尼鄂拉蜂、喀爾巴阡蜂的MDH2基因頻率、基因型頻率、雜合純合度存在差異。關(guān)洪英等[17]發(fā)現(xiàn)雞MD基因5′側(cè)翼區(qū)具有多態(tài)性，俞亞波等[18]根據(jù)雞MDH基因5′側(cè)翼區(qū)單核苷酸多態(tài)性建立了檢測(cè)方法，能夠從分子遺傳學(xué)上快速的對(duì)種質(zhì)資源進(jìn)行分型。家雞品種豐富，包括地方品種（北京油雞、清遠(yuǎn)麻雞、仙居雞等），培育品種（鄭州紅雞、北京白雞、海江黃雞等），引入品種（白萊航雞、白洛克雞等）在內(nèi)的上百個(gè)雞種，造成了雞內(nèi)金來(lái)源復(fù)雜的現(xiàn)狀。由此推測(cè)，使用MDH2 鑒別不同雞種來(lái)源雞內(nèi)金具有一定可行性。另外，研究報(bào)道，硬骨魚(yú)類MDH同工酶系統(tǒng)具有明顯的組織特異性和物種特異性[19]；同時(shí)同源性分析顯示，家雞與綠頭鴨MDH2 蛋白氨基酸序列親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，提示MDH同工酶系統(tǒng)鑒定雞內(nèi)金真?zhèn)我簿哂幸欢尚行浴?/p>