胡力，陳梓媛，趙玉洋，金艷，張輝，張?zhí)?，仝一丹，袁?，蔣超*

1.安徽中醫(yī)藥大學 藥學院，安徽 合肥 230012；

2.中國中醫(yī)科學院 中藥資源中心，北京 100700；

3.華潤三九現(xiàn)代中藥制藥有限公司，廣東 深圳 518029

五倍子是我國傳統(tǒng)名貴中藥，《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版規(guī)定其為漆樹科植物鹽膚木Rhus chinensisMill.、青麩楊R.potaniniiMaxim.或紅麩楊R.punjabensisStew.var.sinica（Diels）Rehd.et Wils.葉上的蟲癭，主要由五倍子蚜Melaphis chinensis（Bell）Baker 寄生而形成。秋季采摘，置沸水中略煮或蒸至表面呈灰色，殺死蚜蟲，取出，干燥。按外形不同分為肚倍和角倍[1]。早期主要是依據直觀的形態(tài)學分類、倍子形態(tài)及致癭位置等對五倍子進行分類[2-4]。與傳統(tǒng)鑒別方法主觀性較強的特點相比，分子鑒定穩(wěn)定、準確、特異性好、不受生物發(fā)展階段與儲藏加工影響，結果較為客觀，受到研究者的廣泛關注，已建立多種中藥材及飲片的分子鑒定方法[5-15]，也有中成藥分子鑒定的報道[16-21]。特異性聚合酶鏈式反應（PCR）鑒定已廣泛應用于中藥材提取液、中成藥、貴細藥材、配方顆粒的基原鑒定中[22-25]，為配方顆粒專屬性鑒別提供了解決方法，也提高了臨床用藥的安全性。

五倍子經過水煎煮工藝加工為五倍子配方顆粒后，具有療效穩(wěn)定、規(guī)格統(tǒng)一、標準一致的優(yōu)勢，但因配方顆粒不再具備性狀、顯微等鑒別特征，導致基原鑒別更加困難[26]，需要建立針對五倍子配方顆粒合理、科學、快速、簡便的檢驗方法。本研究擬建立五倍子配方顆粒PCR 鑒別方法，為規(guī)范五倍子及其加工產品質量提供檢測工具。

1 材料

1.1 儀器

Veriti ?型PCR 儀、GeneAmp 9700 型PCR 儀（Applied Biosystems 公 司）；PTC-100 型PCR 儀、SYNGENE 型凝膠成像系統(tǒng)（Gene 公司）；TC-512型PCR儀（上海Techne公司）。

1.2 試藥

五倍子藥材、標準湯劑凍干粉、配方顆粒由華潤三九醫(yī)藥股份有限公司公司提供。17 批五倍子藥材（批號為1901001～1904017）經安徽中醫(yī)藥大學劉守金教授鑒定為五倍子蚜Melaphis chinensis（Bell）Baker寄生而形成的蟲癭（表1）。將已鑒定的五倍子藥材，按《中國藥典》2020 年版中五倍子飲片炮制要求敲開外殼，刮凈內部雜質，炮制成相應的17 批五倍子飲片（批號與藥材一致），制備了17 批五倍子標準湯劑凍干粉（批號為1904001Y～1904017Y）、3 批配方顆粒成品（批號為1906001Y～1906003Y）。另收集了五倍子蚜同屬倍蛋蚜寄生形成的5 批蟲癭（批號為DB2111005～DB2111009），經中國中醫(yī)科學院蔣超副研究員鑒定為倍蛋蚜Schlechtendalia peitanTsai et Tang 寄生而成的蟲癭，用于檢測所建立方法的專屬性。五倍子對照藥材購自中國食品藥品檢定研究院（批號：121078-201504）。

表1 17批五倍子藥材信息

Wizard?SV Genomic DNA Purification System（美國Promega 生物公司，批號：A2361）；2×M5 PCR Mix（北京聚合美生物科技公司，批號：MF164）；2×TaqPCR Mix（金百特生物公司，批號：P0195）；SpeedSTAR HSTaqDNA 聚合酶、LATaqHS DNA 聚合酶、6×loading buffer（日本Takara 公司，批號分別為RR070A、RR042A、9156）；Trans2K DNA Marker（北京全式金生物技術有限公司，批號：BM101）；GelRed 核酸染料（北京蘭博利德公司，批號：CR001）。

2 方法

2.1 DNA提取

使 用Wizard?SV Genomic DNA Purification System 試劑盒依據說明書步驟提取。樣品模板DNA溶液提取完成后，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 引物設計

通過對比五倍子蚜蟲及同屬近源種倍蛋蚜蟲的細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ（COⅠ）序列選擇特異性片段設計五倍子特異性PCR鑒別引物，其中上游引物序列WBZ-F 為5?-CCCCCTCAATTATTTGATCTAT AG-3?,下游引物序列WBZ-R 為5?-GGACATAATGAA AATGAGCAACTAC-3?。PCR產物長度為138 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

2.3 PCR擴增條件

取五倍子飲片、標準湯劑凍干粉、配方顆粒及混偽品DNA，考察以下方面對PCR 鑒別結果穩(wěn)定性的影響：1）退火溫度分別為51、53、55、57 ℃；2）PCR 循環(huán)次數(shù)分別為36、38、40、42 個循環(huán)；3）Taq酶種類為2×TaqPCR Mix、SpeedSTAR HSTaq、2×M5 PCR Mix和LATaqHS；4）DNA 模板量分別為30、15、6、3 ng。篩選出最適鑒別條件，對五倍子配方顆粒進行位點特異性PCR 鑒別。PCR 產物使用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

3 結果與分析

3.1 PCR鑒別條件的確定與耐用性考察

3.1.1 退火溫度 使用五倍子特異性鑒別引物進行PCR 擴增，分別設置退火溫度51、53、55、57 ℃，結果表明退火溫度為51～55 ℃時，五倍子飲片、標準湯劑凍干粉、配方顆粒能擴增得約138 bp 的亮帶（圖1），混偽品在55～57 ℃時出現(xiàn)弱擴增與雜帶，產生假陽性條帶，57 ℃時出現(xiàn)配方顆粒條帶缺失。選擇PCR退火溫度為53 ℃。

圖1 退火溫度對五倍子配方顆粒鑒別結果的影響

3.1.2 循環(huán)次數(shù) 分別選用36、38、40、42個循環(huán)進行考察，結果表明在36～42 個循環(huán)時五倍子（角倍）飲片、標準湯劑凍干粉、配方顆粒能擴增得約138 bp的亮帶，均能得到正確鑒別結果，40～42個循環(huán)時混偽品和陰性對照出現(xiàn)擴增（圖2）。為保證結果的穩(wěn)定性和準確性，避免混偽品假陽性結果，選擇36個循環(huán)進行PCR反應。

圖2 PCR循環(huán)次數(shù)對五倍子配方顆粒鑒別結果的影響

3.1.3 不同Taq酶 為測試不同種類的Taq酶對五倍子及其混偽品鑒別結果的影響，分別使用2×M5 PCR Mix、2×TaqPCR Mix、SpeedSTAR HSTaqDNA、LATaqHS DNA 聚合酶進行實驗，結果顯示由于活力不同，不同Taq酶的擴增條帶亮度存在差異，且使用SpeedSTAR HSTaqDNA 聚合酶的部分偽品產生了假陽性條帶（圖3，泳道7、8），使用LATaqHS 聚合酶也出現(xiàn)假陽性條帶（圖3，泳道4、5）。使用其他2 種DNA 聚合酶對擴增產物的條帶強弱雖存在差別，但不影響對結果的判讀，其中使用2×M5 PCR Mix 可獲得更明亮條帶，故選擇2×M5 PCR Mix作為最優(yōu)的Taq酶。

圖3 不同Taq DNA聚合酶對五倍子配方顆粒鑒別結果的影響

3.1.4 DNA 模板量 對25 μL PCR 反應體系中的模板DNA 用量進行了考察，調整DNA 質量濃度為約6 ng·μL-1，分別設置3、6、15、30 ng 的DNA 模板（DNA 用量分別為0.5、1.0、2.5、5.0 μL），結果表明當模板量為1.0～5.0 μL 時均能獲得擴增產物，而質量濃度過高會導致假陽性條帶的出現(xiàn)，見圖4。為防止模板質量濃度過高產生假陽性或過低產生假陰性的錯誤鑒別結果，選擇在25 μL 的PCR體系中加入模板DNA 1 μL（6 ng·μL-1）。

圖4 DNA模板量對五倍子配方顆粒鑒別結果的影響

根據以上結果，確定五倍子配方顆粒PCR鑒別的條件為反應體系包括2×M5 PCR Mix 12.5 μL，五倍子配方顆粒鑒別引物（10 μmol·L-1）各0.4 μL，DNA模板2.5 μL，無菌雙蒸水9.2 μL。PCR反應參數(shù)：95 ℃預變性5 min，循環(huán)反應36次（94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），72 ℃延伸5 min。4～10 ℃保存。

3.1.5 不同PCR 儀 為測試不同PCR 儀對五倍子配方顆粒及其混偽品鑒別結果的影響，分別使用4 種PCR 儀進行擴增，結果表明Veriti ?型、GeneAmp 9700 型、TC-512 型、PTC-100 型PCR 儀均可獲得正確的鑒定結果，而GeneAmp 9700 型PCR 儀部分偽品出現(xiàn)微弱擴增條帶，表明進行五倍子配方顆粒PCR 鑒別時應對PCR 擴增溫度進行微調，并進行方法確認（圖5）。

圖5 不同PCR儀對五倍子配方顆粒鑒別結果的影響

3.1.6 不同引物量 為測試不同引物濃度對五倍子配方顆粒及其混偽品鑒別結果的影響，分別使用4個引物濃度進行擴增，使用的引物濃度為10 μmol·L-1，結果表明引物量為0.6 μL 以下時均可獲得正確的鑒定結果，而引物量為0.8 μL時偽品及空白出現(xiàn)假陽性條帶，為了防止引物量過高導致假陽性條帶產生，出現(xiàn)錯誤鑒別結果。選擇五倍子配方顆粒PCR鑒別時引物量為0.4 μL（10 μmol·L-1），見圖6。

圖6 不同引物量對五倍子配方顆粒鑒別結果的影響

3.2 專屬性考察

用本研究建立的五倍子配方顆粒PCR 鑒定方法對五倍子藥材、標準湯劑凍干粉和配方顆粒及其混偽品進行鑒定，結果五倍子藥材、標準湯劑凍干粉和配方顆粒均能擴增出與對照藥材一致的特異性鑒別條帶，混偽品及偽品標準湯劑凍干粉、配方顆粒均無條帶（圖7、圖8）。

圖7 使用五倍子配方顆粒鑒別方法鑒別五倍子及其混偽品

圖8 使用五倍子配方顆粒鑒別方法鑒別五倍子及其加工混偽品

3.3 適用性考察

使用本方法對17 批固定五倍子藥材、17 批五倍子標準湯劑凍干粉和3 批五倍子配方顆粒成品進行鑒定，以驗證本方法的適用性，結果表明所有樣本PCR 供試品與五倍子對照藥材的電泳圖譜相應的位置上均可擴增獲得約138 bp 單一特異性鑒別條帶，空白對照無條帶（圖9）。

圖9 五倍子配方顆粒適用性考察

4 討論

《中國藥典》2020 年版收載了51 味動物藥，其中五倍子和冬蟲夏草都是通過寄生這一途徑產生的。相比于冬蟲夏草，五倍子是五倍子蚜蟲在多個寄主植物上寄生而形成的蟲癭?！吨袊幍洹?020 年版中對五倍子的鑒別主要是依靠傳統(tǒng)性狀鑒別及薄層色譜鑒別等方式，對于經加工處理后失去了性狀特征的五倍子制品，如提取物、配方顆粒等，需要建立一個準確、簡便、快速的鑒定方法，專屬性鑒定五倍子中的五倍子蚜源性成分是建立五倍子配方顆粒鑒別方法的關鍵。

五倍子配方顆粒經過了高溫水煮、干燥、制粒等一系列制備工藝，DNA 高度降解，成品中留存DNA 片段較短、含量較低。使用本研究建立的特異性PCR 方法對多批五倍子藥材、標準湯劑凍干粉及配方顆粒等進行檢驗，結果顯示，37 批樣品均在100～250 bp 見單一特異性鑒別條帶。以上結果表明本研究建立的五倍子特異性鑒別方法對配方顆粒具有良好的適用性，可為五倍子藥材及其配方顆粒等加工產品提供相應的檢測工具，完善了五倍子的質量控制體系，為其臨床應用提供了保障，也可為其他中藥品種的配方顆粒鑒別提供參考。