王孟虎，許亮，蔣磊，李峰，孫一帆，康廷國，孟祥松，張圣陽，鐘明月，黃文康，石飄柔

1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 大連 116600；

2.亳州學(xué)院，安徽 亳州 236800；

3.亳州市食品藥品檢驗中心，安徽 亳州 236800；

4.亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽 亳州 236800；

5.中國藥科大學(xué)，江蘇 南京 210000

蘄蛇（Agkistrodon）為蝰科尖吻蝮屬動物五步蛇Agkistrodon acutus（Guenther）的干燥體，烏梢蛇（Zaocys）為游蛇科動物烏梢蛇Zaocys dhumnades（Cantor）的干燥體，金錢白花蛇（Bungarus Parvus）為眼鏡蛇科動物銀環(huán)蛇Bungarus multicinctusBlyth的幼蛇干燥體，具有祛風(fēng)、通絡(luò)、止痙的功效，主治風(fēng)濕頑痹、中風(fēng)、麻木拘謹(jǐn)、半身不遂等，均收載于《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020年版[1]。由于野生蛇類資源匱乏，人工養(yǎng)殖規(guī)模還未滿足需求，導(dǎo)致市售蛇類藥材價格較高。市售藥材為不完整個體，常常摻雜有混偽品。為了保證用藥的安全性、維護(hù)蛇類藥材市場的穩(wěn)定性，建立快速、準(zhǔn)確鑒別蘄蛇、烏梢蛇、金錢白花蛇及其易混偽品的方法具有重要意義。

DNA 條形碼由Hebert等[2-3]在2002年提出，陳士林等[4]在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了大量研究，確立了動物類藥材DNA條形碼細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ（COⅠ）基因鑒定體系。由于該方法不受個體、環(huán)境等因素影響，能夠準(zhǔn)確、快速地對物種進(jìn)行鑒定，現(xiàn)已應(yīng)用在各動物類樣品的鑒定及鑒別領(lǐng)域。晁志等[5]基于DNA條形碼COⅠ基因?qū)疱X白花蛇及其8種混偽品進(jìn)行鑒定，顯示各物種均獨立聚為一支，其中游蛇科與眼鏡蛇科為姐妹群。廖倩等[6]基于DNA 條形碼COⅠ基因?qū)?3種蛇類進(jìn)行鑒定，顯示各物種均獨立聚為一支，游蛇科與眼鏡蛇科為姐妹群，鏈蛇屬與白環(huán)蛇屬親緣關(guān)系較近，并支持前人研究中對錦蛇屬的重新劃分（玉斑錦蛇被歸類于麗蛇屬，稱為玉斑麗蛇；三索錦蛇被歸類為頜腔蛇屬，稱為三索頜腔蛇；王錦蛇仍歸屬于錦蛇屬）。黃勇等[7]基于DNA條形碼COⅠ基因?qū)?9 種蛇類進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示灰鼠蛇有可能被錯誤鑒定為烏梢蛇，赤練蛇種內(nèi)遺傳距離差異較大。石林春等[8]基于DNA條形碼COⅠ基因?qū)诿煎\蛇、錦蛇、烏梢蛇蛇蛻進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示該方法能夠準(zhǔn)確鑒定3 種蛇蛻。崔麗娜等[9]基于DNA 條形碼COⅠ基因?qū)疱X白花蛇及4 種偽品進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定?！吨袊幍洹?020 年版利用性狀、特異性引物對蘄蛇、烏梢蛇、金錢白花蛇及其混偽品進(jìn)行鑒別，其中設(shè)計的特異性引物能夠?qū)φ愤M(jìn)行擴(kuò)增并有單一條帶，而偽品則無條帶[1]。雖然，利用該方法能夠準(zhǔn)確鑒定蘄蛇、烏梢蛇、金錢白花蛇，但卻無法對混偽品進(jìn)行鑒定，無法獲知混偽品的基原信息。

在前人研究的基礎(chǔ)上，本課題組收集蘄蛇、烏梢蛇、金錢白花蛇及其混偽品，結(jié)合從GenBank 下載的正品及混偽品COⅠ序列構(gòu)建鄰接（NJ）系統(tǒng)發(fā)育樹，不僅對正品及混偽品進(jìn)行鑒定，也能夠為物種的分類提供一定信息。

1 材料

1.1 儀器

T100 型PCR 擴(kuò)增儀[伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司]；DYY-7C 型電泳系統(tǒng)（北京六一生物科技有限公司）；JXFSTPRP-CL 型全自動樣品冷凍研磨儀、JS-2000 型紫外凝膠成像儀（上海培清科技有限公司）；QH07058 型微量移液器（賽默飛世爾科技公司）；WZB-32AF/S 型制冰機(jī)（寧波惠康國際工業(yè)有限公司）；LC-JSY-1 型恒溫金屬浴、LCMini-12KSP 型離心機(jī)（上海力辰儀器科技有限公司）；SPEED×10 型混勻儀（群安實驗儀器有限公司）；P70F23P-G5（B0）型微波爐（格蘭仕集團(tuán)）。

1.2 試藥

Ezup 柱式動物基因組DNA 抽提試劑盒（批號：B518251-0301）、GelRed（批號：H902KA1483）、Marker DL 2000（批 號：B500350-0500）、5×TBE buffer（批號：B548102-0500）、雙蒸水（批號：A500197-0500）、1×TE buffer（批 號：B548106-0500）均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；瓊脂糖（批號：1110GR100，德國Biofroxx 公司）；2×TaqMaster Mix（批號：L/N 017E2201CB，南京諾唯贊生物科技股份有限公司）。

1.3 樣品

蘄蛇、烏梢蛇、金錢白花蛇的混偽品較多，通過查閱《常用中藥材及混偽品種整理》[10]、《中藥材市場常見易混品種鑒別圖集》[11]、《中國中藥材真?zhèn)舞b別圖典1（常用貴重藥材、進(jìn)口藥材分冊）》[12]、《實用中藥材品種鑒別》[13]、《易混淆中藥鑒別》[14]等書籍發(fā)現(xiàn)，蘄蛇、烏梢蛇、金錢白花蛇的混偽品數(shù)量分別有16、19、11種。同時，參考《中國動物志·爬行綱（第三卷）》[15]及在線網(wǎng)站iNaturalistGT（https://guatemala.inaturalist.org/taxa/85553-Serpentes）對各物種的分類學(xué)信息進(jìn)行分析，最終確定各物種拉丁學(xué)名并在GenBank下載各物種COⅠ堿基序列。將記載蘄蛇、烏梢蛇、金錢白花蛇各自對應(yīng)的混偽品進(jìn)行統(tǒng)計（表1）。分別從安徽亳州、河北安國、成都荷花池藥材市場購買金錢白花蛇、蘄蛇、烏梢蛇及其混偽品，所有樣品均經(jīng)亳州學(xué)院孟祥松主任中藥師鑒定，存放在亳州學(xué)院冷庫內(nèi)，樣品信息見表2。

表1 蘄蛇、烏梢蛇、金錢白花蛇的混偽品

表2 蘄蛇、烏梢蛇、金錢白花蛇及其混偽品

2 方法

2.1 DNA提取

取樣品蛇肌肉組織，用75%乙醇擦拭滅菌后用手術(shù)剪剪碎，低溫冷凍研磨儀研磨，取粉末約20 mg，使用Ezup 柱式動物基因組DNA 抽提試劑盒提取總DNA，具體操作步驟按試劑盒操作說明進(jìn)行。

2.2 PCR擴(kuò)增和電泳條件

擴(kuò)增的序列的引物為動物COⅠ基因通用引物，正向引物：LCO1490 5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′，反向引物：HCO21985′-TAAACTTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′。PCR 反應(yīng)體系為50 μL，體系內(nèi)含引物對各1.0 μL（10 μmol·L-1），2×TaqMaster Mix 25 μL，模板1 μL，加雙蒸水補(bǔ)足至50 μL。擴(kuò)增程序參考《中國藥典》2020年版（四部）[16]，為95 ℃，3 min；94 ℃，40 s，45 ℃，30 s，72 ℃，30 s，30個循環(huán)；72 ℃，10 min。4 ℃短期保存，-20 ℃長期保存。

2.3 序列測序及數(shù)據(jù)處理

取PCR 產(chǎn)物5 μL，用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳電壓為100 V，電泳時間為35 min，Marker 為DL2000，將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行雙向測序，得到正、反堿基序列，利用CodonCodeAligner 11.0.1查看峰圖并進(jìn)行雙向拼接，去除低質(zhì)量區(qū)及引物區(qū)，獲得目標(biāo)堿基序列。從GenBank下載32種蛇類COⅠ基因序列，為保證下載堿基序準(zhǔn)確性，所有下載堿基均經(jīng)Blast 檢索和BOLD 平臺驗證，鑒定率均達(dá)到99%以上（表3）。

表3 蘄蛇、烏梢蛇、金錢白花蛇及其混偽品的GenBank登錄號

2.4 種間信息位點

利用MEGA 11.0 軟件對蘄蛇、烏梢蛇、金錢白花蛇測序獲得的COⅠ基因序列進(jìn)行比對分析，獲得三者的簡約信息位點。將實驗測得蘄蛇、烏梢蛇、金錢白花蛇與混偽品種堿基序列和表3 中堿基序列進(jìn)行比對，分別獲得蘄蛇、烏梢蛇、金錢白花蛇與其各自對應(yīng)混偽品的簡約信息位點。

2.5 種間遺傳距離

利用MEGA 11.0 軟件將所測物種的COⅠ序列與從GenBank 下載的堿基序列進(jìn)行遺傳距離比對分析，獲得各物種種間、種內(nèi)遺傳距離。

2.6 構(gòu)建NJ系統(tǒng)聚類樹

利用MEGA 11.0 軟件將所測物種的COⅠ序列與從GenBank 下載的堿基序列構(gòu)建NJ 系統(tǒng)聚類樹，同時以自舉檢驗法（Bootstrap）檢驗聚類樹各分支的支持率，自展次數(shù)設(shè)置為1000次。

3 結(jié)果

3.1 種間信息位點

將測序獲得的蘄蛇、烏梢蛇、金錢白花蛇COⅠ基因序列進(jìn)行比對分析，蘄蛇與烏梢蛇、金錢白花蛇分別有134、135 個信息位點，烏梢蛇與金錢白花蛇有117個信息位點，三者共有189個信息位點；蘄蛇、烏梢蛇、金錢白花蛇與其對應(yīng)的混偽品分別有253、265、233 個信息位點，三者種內(nèi)信息位點分別有27、28、13個。

3.2 遺傳距離分析

將測序獲得的COⅠ堿基序列與從GenBank下載的堿基序列進(jìn)行比對分析，由于物種數(shù)量較多，表3 的序號對應(yīng)的物種只展示種間遺傳距離及種內(nèi)平均遺傳距離，各物種種間遺傳距離均大于0.100，種內(nèi)遺傳距離均小于0.056，蘄蛇、烏梢蛇、金錢白花蛇及其混偽品物種平均種內(nèi)、種間遺傳距離見增強(qiáng)出版附加材料。

3.3 NJ系統(tǒng)聚類樹

將所測樣本序列與從GenBank 下載的堿基序列進(jìn)行比對分析并構(gòu)建NJ 系統(tǒng)聚類樹，如圖1 所示，蘄蛇、金錢白花蛇、烏梢蛇均獨立聚為一支，三者分別歸屬于蝰科、眼鏡蛇科、游蛇科，與科內(nèi)其他混偽品種均獨立聚為一支，說明基于COⅠ序列不僅能夠鑒別蘄蛇、金錢白花蛇、烏梢蛇，還能夠鑒別可能科內(nèi)其他物種。所有的樣品均為蝰科、眼鏡蛇科、游蛇科科內(nèi)物種，但基于3 科物種的NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹顯示并未聚為三大支，其中游蛇科有14 屬21種，科內(nèi)物種并未聚為一支，華游蛇屬（赤鏈華游蛇、環(huán)紋華游蛇）及腹鏈蛇屬（草腹鏈蛇）與蝰科聚為一大支；林蛇屬（黃環(huán)林蛇）及頸棱蛇屬（頸棱蛇）與眼鏡蛇科聚為一大支；水蛇屬（寬吻水蛇）、鉛色蛇屬（鉛色水蛇）、沼蛇屬（中國沼蛇）、漁游蛇屬（漁游蛇）并未與其他游蛇科物種聚為一大支；錦蛇屬玉斑錦蛇、百花錦蛇、黑眉錦蛇并未聚為一支，而是玉斑錦蛇與滯卵蛇屬聚為一小支，百花錦蛇與黑眉錦蛇并未聚為一小支。

圖1 蘄蛇、烏梢蛇、金錢白花蛇NJ系統(tǒng)聚類樹

4 討論

根據(jù)NJ系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，除沼蛇屬中國沼蛇未聚為一支外，其余各物種均獨立聚為一支。中國沼蛇種內(nèi)遺傳距離為0.018，而赤鏈蛇、山烙鐵頭、王錦蛇、中介蝮種內(nèi)遺傳距離分別為0.022、0.056、0.019、0.018，均不小于0.018 且均聚為一支，這可能是由于中國沼蛇位于聚類樹外圍導(dǎo)致的。蝰科與游蛇科華游蛇屬、腹鏈蛇屬聚為一支，且游蛇科華游蛇屬、腹鏈蛇屬與游蛇科其他屬相距較遠(yuǎn)，顯示華游蛇屬（赤鏈華游蛇、環(huán)紋華游蛇）、腹鏈蛇屬（草腹鏈蛇）與蝰科更近的親緣關(guān)系。眼鏡蛇科與游蛇科（林蛇屬、頸棱蛇屬）聚為一支并與游蛇科、蝰科并列聚類，顯示了林蛇屬黃環(huán)林蛇、頸棱蛇屬頸棱蛇與眼鏡蛇科有更近的親緣關(guān)系。眼鏡蛇科與蝰科為姐妹群，說明眼鏡蛇科與蝰科親緣關(guān)系較近?！吨袊鴦游镏尽づ佬芯V（第三卷）》將紅紋滯卵蛇、玉斑錦蛇、王錦蛇、百花錦蛇、黑眉錦蛇都?xì)w屬為錦蛇屬[15]，而根據(jù)在線網(wǎng)站可知紅紋滯卵蛇歸屬為滯卵蛇屬，王錦蛇歸屬為玉斑蛇屬，玉斑錦蛇、百花錦蛇、黑眉錦蛇歸為錦蛇屬，NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹支持該物種在線網(wǎng)站中的最新歸屬，但錦蛇屬內(nèi)玉斑錦蛇、百花錦蛇、黑眉錦蛇并未聚為一支?！吨袊鴦游镏尽づ佬芯V（第三卷）》將烏梢蛇歸屬為烏梢蛇屬，白環(huán)蛇歸屬為白環(huán)蛇屬，赤鏈蛇歸屬為赤鏈蛇屬，黑背白環(huán)蛇及雙全白環(huán)蛇歸屬為白環(huán)蛇屬[15]，在線網(wǎng)站將烏梢蛇歸屬為鼠蛇屬，白環(huán)蛇、赤鏈蛇、黑背白環(huán)蛇、雙全白環(huán)蛇歸屬為白環(huán)蛇屬，NJ 系統(tǒng)聚類樹均支持在線網(wǎng)站中的最新物種歸屬。

以上說明，基于DNA 條形碼COⅠ基因能夠?qū)?2 種蛇類進(jìn)行鑒定，赤鏈華游蛇、環(huán)紋華游蛇、草腹鏈蛇歸屬為蝰科和黃環(huán)林蛇、頸棱蛇歸屬為眼鏡蛇科有待進(jìn)一步研究；錦蛇屬玉斑錦蛇、百花錦蛇、黑眉錦蛇歸屬有待一進(jìn)步研究；蝰科、眼鏡蛇科、游蛇科聚為一大支，與寬吻水蛇、鉛色水蛇、中國沼蛇、漁游蛇并列聚類，這4 個物種獨立于蝰科、眼鏡蛇科、游蛇科，其種屬分類有待進(jìn)一步研究。