蘇巖，褚涵，余坤，潘瑞，3，葉陳娟，3，李軍德，黃曉，5*，張?zhí)?

1.重慶市中藥研究院 重慶市中藥資源學(xué)重點實驗室，重慶 400065；

2.湖北中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖北 武漢 430065；

3.中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心 重慶分中心，重慶 400065；

4.中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心，北京 100700；

5.中藥資源與中藥化學(xué)湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430060

蟾蜍是蟾蜍科動物中華蟾蜍Bufo gargarizansCantor 或黑眶蟾蜍Duttaphrynus melanostictusSchneider 等的全體[1]，《有重要生態(tài)、科學(xué)、社會價值的陸生野生動物名錄（國家林業(yè)和草原局公告2023 年第17 號）》將中華蟾蜍、黑眶蟾蜍列為國家“三有”保護(hù)動物[2]?！吨腥A人民共和國藥典》2020年版規(guī)定，中華蟾蜍是蟾酥、干蟾及蟾皮等蟾蜍類藥材的基原動物之一[3]，因其具有重要的藥用價值，如治療惡性腫瘤、心衰、各種感染性疾病、慢性肝炎、骨髓炎、周圍性面神經(jīng)麻痹，止痛麻醉等而備受關(guān)注[4]?，F(xiàn)代研究表明，蟾蜍二烯羥酸內(nèi)酯類化合物是蟾皮中具有抗腫瘤活性的主要成分，能抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移、抗血管生成、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥等[5]。

腫瘤壞死因子（TNF）是一種可引起腫瘤組織出血壞死的蛋白類物質(zhì)，且能在體外抑制和殺傷腫瘤細(xì)胞[6]。1962 年在黏質(zhì)沙雷氏菌Serratia marcescens的多糖處理小鼠后收集的血清能夠誘導(dǎo)腫瘤出現(xiàn)退行性現(xiàn)象實驗中TNF首次被提出[7]。腫瘤壞死因子受體超家族（TNFRSF）作為一種重要的細(xì)胞因子受體，在皮膚、骨骼和淋巴器官的各種類型細(xì)胞之間提供關(guān)鍵信號，在多種類型的免疫效應(yīng)細(xì)胞上具有獨特的功能，能協(xié)同刺激用于治療癌癥的嵌合抗原受體（CAR）T細(xì)胞[8]。

基于本課題組轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，得到TNFRSF11b、TNFRSF9序列信息，擴(kuò)增其全長互補(bǔ)脫氧核糖核酸（cDNA）片段后，利用生物信息學(xué)分析工具對其序列特征和功能進(jìn)行預(yù)測，為后期TNFRSF11b、TNFRSF9基因功能的驗證及其在TNF 炎癥因子家族調(diào)控機(jī)制的相關(guān)研究提供參考。

1 材料

1.1 實驗動物

生長一致的成體中華蟾蜍3只，購買于安徽華潤金蟾藥業(yè)蟾蜍規(guī)范化養(yǎng)殖基地，經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心李軍德研究員鑒定為中華蟾蜍Bufo gargarizansCantor。對成體蟾蜍實施安死術(shù)（腦脊髓刺毀法）后，即刻采集蟾皮、耳后腺、肝臟等組織于-80 ℃冰箱冷凍保存。

1.2 試劑

RNAprep pure 動物組織總RNA 提取試劑盒（批號：DP431）、瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒（DP219）、2×TaqPCR Master Mix（批號：KT201）均購于北京天根生物科技有限公司；PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號：RR047A）、克隆載體pMD18-T Vector（批號：6011）、PrimerSTAR? Max DNA Polymerase（批號：R045A）、PrimeSTAR? GXL DNA Polymerase（批 號：R050A）、TB Green?Premix ExTaq? Ⅱ（Tli RNase H Plus）試劑盒（批號：RR820A）均購于北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；RNA 保存液（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；無水乙醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；瓊脂糖（Biowest公司）。

1.3 儀器

SW-CJ-1D型超凈臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；Life Pro 型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（杭州博日科技有限公司）；Mupid-2Plus 型瓊脂糖凝膠電泳（日本Mupid 公司）；CT-14RD 型臺式高速冷凍離心機(jī)（上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司）；UPW-50S型超純水機(jī)（北京歷元電子儀器公司）；RAININ Pipet-One 型移液器（美國梅特勒-托利多公司）；Nano Drop 2000 型超微量核酸測量儀（賽默飛世爾科技公司）。

2 方法

2.1 總RNA的提取

稱取-80 ℃冷凍保存的蟾皮組織約30 mg，置于裝有液氮的研缽中迅速研磨、粉碎，按操作說明采用RNAsimple 提取總RNA。使用DNase Ⅰ進(jìn)行DNA 消化，以Nano Drop 2000 型超微量核酸測量儀和1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的濃度和純度。提取的蟾皮總RNA于-80 ℃保存。

2.2 cDNA模板合成和BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9基因PCR擴(kuò)增

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中得到的BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9基因，分別于開放閱讀框（ORF）前后約20 bp處設(shè)計特異性引物（表1），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9基因全長擴(kuò)增引物序列信息

以提取的RNA 為模板，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明合成第一鏈cDNA。BbgTNFRSF11b基因PCR 反應(yīng)體系總體積為50 μL：2×TaqPCR Master Mix 25 μL，正反向引物各2 μL，cDNA 4 μL，ddH2O 17 μL。PCR 反應(yīng)條件為98 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性30 s，50 ℃退火15 s，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min；4 ℃冷卻。BbgTNFRSF9基因PCR 反應(yīng)體系總體積為50 μL：5×PrimeSTAR GXL Buffer 10 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol·L-1each）4 μL，GXL DNA Polymerase 1 μL，正反向引物各2 μL，cDNA 4 μL，ddH2O 27 μL。PCR 反應(yīng)條件為98 ℃預(yù)變性5 min，98 ℃變性30 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸90 s，35 個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，4 ℃冷卻。反應(yīng)結(jié)束后，取PCR反應(yīng)產(chǎn)物5 μL經(jīng)1%瓊脂糖電泳鑒定，DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。

2.3 目的基因的克隆測序

將膠回收純化的PCR克隆產(chǎn)物（目的基因）連接在pMD18-T Vector 載體上，取目的基因4.5 μL，pMD18-T Vector 0.5 μL，加入等量的SolutionⅠ 5 μL，16 ℃金屬浴3～8 h。然后將連接產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，LB平板培養(yǎng)后做菌落PCR擴(kuò)增（PCR反應(yīng)條件同2.2項下），利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，選出陽性克隆進(jìn)行菌液培養(yǎng)并測序。

2.4 BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9 基因生物信息學(xué)分析

利用通過NCBI ORF-Finder 在線工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）預(yù)測BbgTNFRSF 11b、BbgTNFRSF9cDNA 的ORF；利用NCBI Blast（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）程序進(jìn)行蛋白同源比對和保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測；用ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）解 析 BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9 蛋白理化性質(zhì)，使用InterProScan（https://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/）在線工具分析BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9基因編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域論等電點和穩(wěn)定性；SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）和 Swiss-model（http://swissmodel.expasy.org/）在線軟件預(yù)測BbgTNFRSF 11b、BbgTNFRSF9 蛋白二級、三級結(jié)構(gòu)；使用SignalP 5.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/）及TMHMM Server 2.0（https://dtu.biolib.com/DeepTMHMM，https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0）進(jìn)行信號肽和跨膜域分析；使用Expasy ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/）及 NetPhos 3.1 Server（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1）在線軟件分析親水性和預(yù)測磷酸化位點；使用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9基因的系統(tǒng)發(fā)育樹，重復(fù)抽樣次數(shù)選擇500 以確保所構(gòu)建進(jìn)化樹分支的穩(wěn)定性。

2.5 中華蟾蜍BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9 的組織表達(dá)分析

根據(jù)中華蟾蜍BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9基因的ORF 序列，使用Premier 5.0 軟件設(shè)計實時熒光定量PCR（RT-qPCR）的特異性引物（表2）。

表2 BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9基因RT-qPCR擴(kuò)增引物序列信息

RT-qPCR 反應(yīng)體系為10 μL：模板1.0 μL，TB Green Premix ExTaqⅡ 5.0 μL，上下游引物各0.5 μL和ddH2O 3.0 μL。反應(yīng)程序設(shè)定為94 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃變性10 s，60 ℃退火34 s，共40 個循環(huán)；溶解曲線為94 ℃ 10 s，60 ℃ 45 s。重復(fù)3 次生物學(xué)試驗，采用2-ΔΔCt方法計算基因的表達(dá)情況。最后利用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 中華蟾蜍BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9 基因克隆與測序

提取的中華蟾蜍蟾皮總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見28SrRNA和18SrRNA條帶清晰明亮（圖1）。超微量核酸測量儀檢測吸光度（A），A260nm/A280nm為1.97，說明總RNA 的完整性好，濃度較高，可用于后續(xù)實驗。

圖1 總RNA瓊脂糖凝膠檢測圖譜

以總RNA 反轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板，用BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9特征性引物進(jìn)行退火溫度梯度考察的PCR 全長擴(kuò)增，將PCR 反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測得到2 條長度約為1300、1100 bp 的特異性條帶，與轉(zhuǎn)錄組測序所得目的條帶片段大小基本一致（圖2）。

圖2 中華蟾蜍BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9基因擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠檢測圖譜

將回收純化后的目的片段連接到PMD-18T 克隆載體上，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，隨機(jī)挑選12個單菌落，進(jìn)行菌落PCR 擴(kuò)增，挑選陽性克隆進(jìn)行菌液培養(yǎng)并測序。

3.2 中華蟾蜍BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9 基因序列分析

利用DNAMAN 7.0 分析所得BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9基因序列后發(fā)現(xiàn)，其與中華蟾蜍轉(zhuǎn)錄組測序所得TNFRSF11b、TNFRSF9基因片段序列基本一致（圖3）。ORF finder 結(jié)果顯示，BbgTNFRSF11b的ORF 長為1233 bp，編碼410 個氨基酸，BbgTNFRSF9的ORF 長為816 bp，編碼274 個氨基酸。BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9的cDNA 序列及編碼蛋白序列見圖3。

圖3 BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9的cDNA序列及編碼蛋白序列

通過NCBI 數(shù)據(jù)庫中的Blastp 程序進(jìn)行蛋白質(zhì)比對，BbgTNFRSF11b序列與林蛙（Rana temporariaL.；XP_040210823.1）、高山倭蛙（Nanorana parkeriStejneger，L.；XP_018408849.1）、非洲爪蟾（Xenopus laevisDaudin；XP_018123714.1）等動物的TNFRSF11b基因序列的同源性較高，其中與林蛙的TNFRSF11b基因序列相似性最高（60.41%），表明TNFRSF11b基因在物種間的相差性較大，同源性較差。利用MEGA 7.0 進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，顯示BbgTNFRSF11b基因與林蛙TNFRSF11b基因在一條進(jìn)化枝上，說明它們的同源關(guān)系較近（圖4）。

通過NCBI 數(shù)據(jù)庫中的Blastp 程序進(jìn)行蛋白質(zhì)比對，BbgTNFRSF9序列與泥鰍（Engystomops pustulosusCantor；KAG8568725.1）、林蛙（XP_040182506.1)、非洲爪蟾（XP_018083418.1）等動物TNFRSF9 蛋白序列的同源性較高，其中與泥鰍的TNFRSF9基因序列相似性最高（65.81%），表明TNFRSF9基因在物種間相差較大。利用MEGA 7.0 進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，顯示BbgTNFRSF9基因與泥鰍TNFRSF9基因在一條進(jìn)化枝上，說明它們的同源關(guān)系較近（圖5）。

3.3 BbgTNFRSF11b基因編碼蛋白質(zhì)的特性分析

運用ProtParam 在線軟件推測BbgTNFRSF11b蛋白質(zhì)分子量為46.97 kDa，理論等電點為8.64，分子式為C2066H3297N563O610S37，總原子數(shù)為6573個，帶負(fù)電荷的殘基[天冬酰胺酸和谷氨酸（Asp+Glu）]總數(shù)為43，帶正電荷的殘基[精氨酸和賴氨酸（Arg+Lys）]總數(shù)為53。不穩(wěn)定系數(shù)53.12，脂肪族指數(shù)為75.83，親水性平均值（GRAVY）為-0.421，BbgTNFRSF9蛋白相對分子質(zhì)量為67.874 kDa，理論等電點為5.12，分子式為C2490H4153N829O1035S175，總原子數(shù)為8682 個，帶負(fù)電荷的殘基（Asp+Glu）總數(shù)為0，帶正電荷的殘基（Arg+Lys）總數(shù)為0。不穩(wěn)定系數(shù)46.58，脂肪族指數(shù)為29.79，GRAVY為0.793。

通過InterPro 和Blastp 對BbgTNFRSF11b 蛋白結(jié)構(gòu)域分析顯示，BbgTNFRSF11b編碼的蛋白具有TNFR/NGFR、TNFRSF特征結(jié)構(gòu)域和CRD1，2區(qū)段的單體小分子多肽，不存在保守結(jié)構(gòu)域（圖6）。

InterPro 和Blastp 對BbgTNFRSF9 蛋白 結(jié)構(gòu)域分析顯示，BbgTNFRSF9編碼的蛋白具有TNFR/NGFR、TNFR 特征結(jié)構(gòu)，不存在保守結(jié)構(gòu)域（圖7）。

利用DNAMAN V6 將中華蟾蜍與林蛙（XP_040210823.1）、高山倭蛙（XP_018408849.1）、非洲爪蟾（XP_018123714.1）、雙條吻蚓（Rhinatrema bivittatumGuérin Méneville；XP_029447794.1）、熱帶爪蟾（Xenopus tropicalisGray；XP_002938025.2）5種動物TNFRSF11b蛋白序列多序列比對（圖8），表明中華蟾蜍BbgTNFRSF11b序列同其他動物相似度不高，TNFRSF11b基因的保守性較低。

用 DNAMAN V6 將中華蟾蜍與泥鰍（KAG8568725.1）、林蛙（XP_040182506.1）、縞鬣狗（Hyaena hyaenaLinnaeus；XP_039090911.1）、非洲爪蟾（XP_018083418.1）、馬來亞穿山甲（Manis javanicaDesmarest；XP_036855680.1）、長鰭領(lǐng)航鯨（Globicephala melasTraill；XP_030721651.1）5 種動物TNFRSF9蛋白序列多序列比對（圖9），表明中華蟾蜍BbgTNFRSF9蛋白序列同其他動物相似度不高，TNFRSF9基因的保守性較低。

圖9 中華蟾蜍BbgTNFRSF9蛋白與其他動物TNFRSF9蛋白的多序列比對分析結(jié)果

利用SignalP 4.0 Server 進(jìn)行信號肽預(yù)測，SP 測得為“NO”，說明BbgTNFRSF11b 蛋白結(jié)構(gòu)中不含信號肽。采用ProtScale 程序?qū)Υ司幋a蛋白進(jìn)行疏水性/親水性分析，該蛋白整條肽鏈預(yù)測值為負(fù)值的氨基酸數(shù)量略高，其中第349 個氨基酸的親水性最強(qiáng)，預(yù)測值為-2.756；第24個氨基酸的疏水性最強(qiáng)，預(yù)測值為2.467，結(jié)果顯示蟾蜍BbgTNFRSF11b蛋白為親水性蛋白（圖10A）。采用TMHMM Server 2.0 對BbgTNFRSF11b 蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測，結(jié)果顯示該蛋白位于膜外部的概率接近1，說明BbgTNFRSF11b 蛋白不存在跨膜區(qū)（圖10B）。BbgTNFRSF11b 蛋白的磷酸化位點預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白含有Ser 位點、Thr 位點、Tyr 位點分別為15、16、4個（圖10C）。

圖10 BbgTNFRSF11b蛋白親水性/疏水性、蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域、蛋白磷酸化分析預(yù)測

檢測BbgTNFRSF9的序列，信號肽I（SPI）測得為“0.985 8”，說明BbgTNFRSF9 蛋白含有信號肽，位點在23、24，采用ProtScale 程序?qū)Υ司幋a蛋白進(jìn)行疏水性/親水性分析，該蛋白整條肽鏈預(yù)測值為正值的氨基酸數(shù)量略高，結(jié)果顯示蟾蜍BbgTNFRSF9 蛋白為疏水性蛋白（圖11A）。采用TMHMM Server 2.0 對BbgTNFRSF9 蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測，結(jié)果顯示該蛋白位于膜外部的概率接近1，說明BbgTNFRSF9 蛋白不存在跨膜區(qū)（圖11B）。BbgTNFRSF9 蛋白的磷酸化位點預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白含有Thr位點（圖11C）。

圖11 BbgTNFRSF9蛋白親水性/疏水性、蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域、蛋白磷酸化分析預(yù)測

利用在線分析工具SPOMA 進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果表明 BbgTNFRSF11b 蛋白由α螺旋（41.46%）、延伸鏈（10.98%）、β轉(zhuǎn)角（5.12%）和不規(guī)則卷曲（42.44%）組成，其中，α螺旋和不規(guī)則卷曲是BbgTNFRSF11b 蛋白中最主要的結(jié)構(gòu)元件（圖12）。

圖12 中華蟾蜍BbgTNFRSF11b二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用在線分析工具SPOMA 進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果表明BbgTNFRSF9蛋白由α螺旋（16.36%）、延伸鏈（12.00%）、β轉(zhuǎn)角（5.45%）和不規(guī)則卷曲（66.18%）組成，其中不規(guī)則卷曲是BbgTNFRSF9蛋白中最主要的結(jié)構(gòu)元件（圖13）。

圖13 中華蟾蜍BbgTNFRSF9二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

使用SWISS-MPDEL 程序進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)同源模建，對BbgTNFRSF11b（圖14A）、BbgTNFRSF9（圖14B）基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行空間結(jié)構(gòu)預(yù)測，從三級結(jié)構(gòu)可以看出BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9均由α-螺旋與延伸鏈構(gòu)成，這與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果基本一致。

圖14 中華蟾蜍BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9三級結(jié)構(gòu)同源模建

3.4 BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9 基因的組織表達(dá)分析

使用RT-qPCR 技術(shù)分析1 年齡期中華蟾蜍不同組織中BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9基因的表達(dá)特征，結(jié)果顯示，BbgTNFRSF11b基因在中華蟾蜍不同組織中均有表達(dá)，BbgTNFRSF9在肺和心中沒有表達(dá)，表達(dá)量存在差異；2 個基因在耳后腺中表達(dá)量較高，其次是腹部皮膚；在肌肉中也有一定表達(dá)（圖15）。

圖15 BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9基因組織表達(dá)（,n=3）

4 討論

以往研究表明，兩棲動物的分泌物中含有多種活性物質(zhì)，并具有多種相應(yīng)的藥理活性，例如抗炎、鎮(zhèn)痛等[4]。本研究根據(jù)高通量測序得到中華蟾蜍轉(zhuǎn)錄組文庫，成功克隆了中華蟾蜍TNF 家族的核心基因BbgTNFRSF11b和BbgTNFRSF9。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，BbgTNFRSF11b基因編碼氨基酸序列含有TNFR/NGFR、TNFRSF的特征結(jié)構(gòu)域和CRD1，2區(qū)段的單體小分子多肽[9]，在同源性研究過程中發(fā)現(xiàn)與林蛙的同源性最高，為60.41%，而BbgTNFRSF9在同源性研究者與泥鰍的同源性最高，為65.81%，說明TNFRSF11b、TNFRSF9在物種間的差異較大。與已知其他動物TNFRSF11b、TNFRSF9蛋白的基本特性相比，中華蟾蜍TNFRSF11b 蛋白結(jié)構(gòu)不含信號肽，TNFRSF9 蛋白結(jié)構(gòu)則含信號肽，2 個基因都不存在跨膜區(qū)，BbgTNFRSF11b 為疏水性蛋白，BbgTNFRSF9 為親水性蛋白，二級結(jié)構(gòu)預(yù)測中α螺旋和不規(guī)則卷曲是主結(jié)構(gòu)類型。RT-qPCR結(jié)果顯示，BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9基因在耳后腺中表達(dá)量最高，其次是腹部皮膚。

TNF 在機(jī)體內(nèi)可由多種細(xì)胞產(chǎn)生，如單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞等，具有多種生物學(xué)效應(yīng)，包括殺傷腫瘤細(xì)胞、調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)、促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖等[6]。TNFRSF是通常含有TNF同源結(jié)構(gòu)域的Ⅱ型跨膜蛋白的蛋白超家族。TNFRSF 的成員作為細(xì)胞因子發(fā)揮作用，通過與TNFRSF 受體結(jié)合，調(diào)節(jié)多種生物學(xué)過程，包括免疫反應(yīng)、增殖、分化、凋亡和胚胎發(fā)生。在巨噬細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞中TNFRSF 的物質(zhì)與細(xì)胞膜的BAFF/APRIL、LIGHT、GITRL、FasL、TWEAK 和CD137L（4-1BBL）結(jié)合[8]，啟動反向信號傳導(dǎo)來抑制細(xì)胞增殖。TNFRSF11b 蛋白是1997 年新發(fā)現(xiàn)的TNFRSF 的一個新成員，被稱為破骨細(xì)胞形成抑制因子（OCIF 或OPG），是一種可以抑制骨的破壞和吸收的分泌型糖蛋白[10]。TNFRSF11b 能夠與核轉(zhuǎn)錄因子（NF）-κB受體激活劑結(jié)合，抑制破骨細(xì)胞形成、分化、存活并誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡，是體內(nèi)成骨細(xì)胞骨形成與破骨細(xì)胞骨吸收動態(tài)平衡的重要調(diào)節(jié)因子，能促進(jìn)骨代謝的穩(wěn)態(tài)，參與骨密度的調(diào)節(jié)[7]。TNFRSF9 與TITegs 的激活有關(guān)，并且它們的抑制可能通過降低腫瘤中Tregs的免疫抑制功能來促進(jìn)包括肺癌免疫治療在內(nèi)的抗癌治療。TNFRSF9也能作為CD8+T細(xì)胞的共刺激受體，因此，TNFRSF9 的激動性抗體已經(jīng)在臨床試驗中[11]。

現(xiàn)有研究表明，TNFRSF11b 蛋白是RANKRANKL-OPG[12]系統(tǒng)的核心一員，在骨質(zhì)疏松癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨癌等骨失調(diào)類疾病的發(fā)病機(jī)制方面起著中心作用。TNFRSF11b所具有的CRD1，2區(qū)段的單體小分子多肽可以靈活地與RANKL 競爭性結(jié)合[13]，阻止RANKL與RANK的結(jié)合，具體表現(xiàn)為成骨細(xì)胞及骨髓基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的RANKL，與破骨細(xì)胞或破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表面上的RANK 結(jié)合后，能夠促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化，增強(qiáng)骨吸收活性[14]。成骨細(xì)胞系的多種細(xì)胞分泌表達(dá)OPG，與RANKL 競爭性結(jié)合，阻止RANKL 與RANK 的結(jié)合，從而阻止破骨細(xì)胞活化及抑制骨吸收[15]。TNFRSF9與TI-Tegs的激活有關(guān)，并且它們的抑制可能通過降低腫瘤中Tregs的免疫抑制功能來促進(jìn)包括肺癌免疫治療在內(nèi)的抗癌治療。TNFRSF9也能作為CD8+T細(xì)胞的共刺激受體。本研究成功克隆了BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9基因，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為蟾蜍抗腫瘤機(jī)制研究及進(jìn)一步揭示TNFRSF11b 在RANK-RANKL-OPG 系統(tǒng)中的功能奠定基礎(chǔ)，也為骨質(zhì)疏松癥患者帶來福音[11]。同時，可以看到肌肉作為非藥用部位表達(dá)量較高的組織，為開發(fā)蟾蜍新的藥用部位提供了科學(xué)依據(jù)。

5 結(jié)論

從中華蟾蜍中克隆到BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9兩個TNFSF家族的基因，BbgTNFRSF11b基因的全長cDNA 序列為1233 bp，編碼410 個氨基酸，BbgTNFRSF9基因的全長cDNA 序列為829 bp，編碼247個氨基酸，進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)BbgTNFRSF11b和BbgTNFRSF9基因與其他動物同源性不高，組織表達(dá)分析顯示，BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9基因在耳后腺中表達(dá)顯著高于其他部位，同時在肌肉中均有表達(dá)，為開發(fā)藥用動物新資源提供數(shù)據(jù)支持。