周煒清，李 娟，那向明，燕星燃，李 桐，馬光輝,2

(1.中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所生化工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100190；2.中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所生物藥制備與遞送重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)科學(xué)院)，北京 100190；3.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)化工學(xué)院，北京 101408)

我國(guó)是世界上魔芋栽培面積和產(chǎn)量最大的國(guó)家，魔芋的種植面積達(dá)13.53萬(wàn)公頃，每年生產(chǎn)魔芋260萬(wàn)t，加工魔芋粉產(chǎn)量約2萬(wàn)t，占世界總產(chǎn)量的三分之二[1]。自20 世紀(jì)80 年代以來(lái)，受到地方政府開(kāi)發(fā)特色產(chǎn)業(yè)的重視，種植量逐年上升，資源優(yōu)勢(shì)明顯。魔芋葡甘聚糖(konjac glucomannan,KGM)提取自魔芋根莖，自1994年美國(guó)和歐洲相繼立法批準(zhǔn)魔芋葡甘聚糖為健康食品及食品添加劑以來(lái)，國(guó)際市場(chǎng)對(duì)魔芋需求量逐年增加，美國(guó)和歐洲等國(guó)家加強(qiáng)了對(duì)魔芋及其精粉研究，魔芋產(chǎn)品的加工工藝及加工設(shè)備處于國(guó)際領(lǐng)先水平，他們不僅充分開(kāi)發(fā)本國(guó)的資源，還從國(guó)外進(jìn)口原料，其中94%原料從中國(guó)進(jìn)口。相對(duì)而言，我國(guó)只重視魔芋精粉帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)效益而輕視魔芋產(chǎn)品的深度開(kāi)發(fā)，所以魔芋及制品目前仍主要用于食品、食品添加劑或者保鮮劑，處于初級(jí)加工階段，利潤(rùn)微薄。因此，基于魔芋粉開(kāi)發(fā)新的具有高附加值的工業(yè)用途是當(dāng)前魔芋產(chǎn)業(yè)發(fā)展必須重視的問(wèn)題和發(fā)展方向。在我國(guó)，魔芋種植區(qū)主要分布在湖北、湖南、四川、重慶、云南、貴州和陜西等地區(qū)的海拔700～2 300 m的山地和丘陵地區(qū)，這些地區(qū)恰恰是經(jīng)濟(jì)和交通不發(fā)達(dá)的地區(qū)。因此，開(kāi)發(fā)魔芋高附加值產(chǎn)品，發(fā)展特色產(chǎn)業(yè)，對(duì)于帶動(dòng)當(dāng)?shù)剞r(nóng)民致富，振興鄉(xiāng)村經(jīng)濟(jì)也具有重要的作用。

當(dāng)前，生命科學(xué)已成為前沿科學(xué)研究的活躍領(lǐng)域，生物技術(shù)已經(jīng)成為改變?nèi)祟惿睢⒋龠M(jìn)社會(huì)發(fā)展的重要力量。在生物制品的生產(chǎn)過(guò)程中，分離純化介質(zhì)、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)微載體是必不可少的生物工程材料。KGM具備作為理想生物材料的許多特性，如高親水性、與生物分子良好的相容性、富含羥基、易于化學(xué)修飾等。葡甘聚糖的分子結(jié)構(gòu)與葡聚糖相近，而葡聚糖微球作為分離介質(zhì)和細(xì)胞培養(yǎng)微載體已經(jīng)獲得廣泛應(yīng)用，推動(dòng)了生物技術(shù)的發(fā)展。本文綜述魔芋葡甘聚糖微球的制備、結(jié)構(gòu)及表面功能調(diào)控，介紹葡甘聚糖微球作為分離介質(zhì)、細(xì)胞/干細(xì)胞培養(yǎng)微載體的應(yīng)用，為葡甘聚糖的高值化應(yīng)用提供參考。

1 葡甘聚糖概述

魔芋葡甘聚糖是一種具有良好親水性和生物相容性、可生物降解的天然多糖。魔芋葡甘聚糖的平均分子量一般為(5～20)×105，隨品種、產(chǎn)地、加工技術(shù)和儲(chǔ)存時(shí)間的不同而不同。它的主鏈由D-葡萄糖和D-甘露糖以β-1,4-糖苷鍵連接而成，甘露糖與葡萄糖的摩爾比值為1.5～1.7 (通常為1.6)[2](圖1)；而支鏈結(jié)構(gòu)是以β-1,3 糖苷鍵連接在甘露糖的C3 位置上，且每32 個(gè)糖殘基上就有3 個(gè)支鏈。在主鏈上，平均每19 個(gè)糖殘基連接一個(gè)乙?；鶊F(tuán)，乙酰基的存在能夠維持KGM 的構(gòu)象，使KGM呈有空隙的雙螺旋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，不僅能讓KGM保持大量水分，而且使KGM 擁有良好的溶解性和溶脹倍數(shù)。

圖1 KGM的化學(xué)結(jié)構(gòu)[2]Fig.1 Chemical structure of KGM[2]

葡甘聚糖具有親水性、增稠性、穩(wěn)定性、乳化性、凝膠性和成膜性等特性，可以用作多種食品的添加劑、穩(wěn)定劑和保鮮劑等。葡甘聚糖本身是一種優(yōu)良的膳食纖維，具有調(diào)血脂、抗高血糖、降膽固醇、抗炎、抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫等生物活性[3]。最近，葡甘聚糖的研究集中在腸道微生物菌群、小分子酸以及內(nèi)在免疫機(jī)制等方面[4-6]。葡甘聚糖另一個(gè)重要應(yīng)用是作為皮膚受損后的創(chuàng)面敷料。基于葡甘聚糖的特點(diǎn)，研究者們已經(jīng)開(kāi)發(fā)出多種類型的敷料，如水凝膠、薄膜、納米纖維和多孔海綿等，用于傷口愈合、止血和預(yù)防感染等[7]。目前的研究重點(diǎn)是葡甘聚糖與γ-聚谷氨酸(γ-PGA)、殼聚糖、絲素肽和明膠等組分復(fù)配以提高凝膠的免疫活性、穩(wěn)定性、力學(xué)強(qiáng)度和抗菌性能，以及加速傷口愈合、避免疤痕產(chǎn)生等方面[8-12]。葡甘聚糖凝膠作為藥物遞送材料已經(jīng)有不少成果，特別是經(jīng)羧甲基化、季銨化、酯化、氧化和接枝共聚進(jìn)行改性后，它能夠更好地用作藥物遞送載體，對(duì)藥物實(shí)現(xiàn)較高的包埋率和持續(xù)釋放[13]。同時(shí)，氧化葡甘聚糖與間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體能形成層層組裝結(jié)構(gòu)，可用于潰瘍性結(jié)腸炎的治療[14]，氧化魔芋葡甘聚糖與聚乙烯亞胺(PEI)偶聯(lián)得到的復(fù)合材料，可形成具有自愈合能力和pH敏感的水凝膠，與3D生物打印技術(shù)結(jié)合，用于肌肉和心神經(jīng)的組織再生[15]。

2 葡甘聚糖微球的制備和結(jié)構(gòu)控制

2.1 葡甘聚糖的降解

由于葡甘聚糖的分子量巨大，即使在很低質(zhì)量分?jǐn)?shù)(2%～4%)條件下，溶于水后也會(huì)形成凝膠，難以分散成球，所以必須對(duì)其進(jìn)行降解以得到適宜分子量的產(chǎn)品[16]。葡甘聚糖的降解方法包括化學(xué)降解法、酶降解法和超聲降解法。化學(xué)降解法是將魔芋精粉溶解于水或乙醇溶液中攪拌溶脹后，升溫至80 ℃，再加酸進(jìn)行降解。酸的濃度、酸解時(shí)間與溫度等都會(huì)影響葡甘聚糖的降解程度[16]。酶降解法[17]主要使用纖維素酶、β-甘露糖酶和葡聚糖酶。常規(guī)方法是將魔芋精粉溶于pH緩沖液中，攪拌溶脹，當(dāng)升至適宜溫度后加入酶制劑，酶解一段時(shí)間后提高溫度，使酶失去活性。不同種類的酶對(duì)葡甘聚糖的降解條件和效果不同，其中對(duì)β-甘露糖酶的研究更為廣泛。超聲法[18]降解葡甘聚糖能夠顯著降低葡甘聚糖溶液的黏度和分子量，而不破壞其基本結(jié)構(gòu)，得到的分子量分布也較為均一。關(guān)于超聲降解的機(jī)制，一般有2種觀點(diǎn)：一種認(rèn)為在聲波的作用下，溶劑分子高速運(yùn)動(dòng)對(duì)化學(xué)鍵發(fā)生剪切作用：另一種觀點(diǎn)認(rèn)為是超聲使液體中產(chǎn)生微小的空化氣泡，當(dāng)空泡爆裂時(shí)，釋放的沖擊波能量使聚合物降解[18]。

2.2 葡甘聚糖微球的制備方法

在得到適宜分子量的葡甘聚糖后，可進(jìn)一步制備葡甘聚糖微球。葡甘聚糖微球早期的制備方法是在堿性條件下，通過(guò)交聯(lián)劑交聯(lián)形成顆粒體，再用乙醇溶液將其表面棱角溶解。但是這種方法得到的微球一般在毫米級(jí)，并且表面粗糙、形狀不規(guī)整[19]。葛佳麗[16]建立了一種表面光滑、形狀圓整、透明的葡甘聚糖微球的制備方法(圖2)：將降解后的小分子葡甘聚糖配成一定濃度的水溶液，分散在油相中反相懸浮成球，再通過(guò)交聯(lián)劑將糖鏈上的羥基進(jìn)行交聯(lián)形成穩(wěn)定的具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的葡甘聚糖微球。攪拌分散法制備的微球粒徑分布較寬，通常在數(shù)十微米到數(shù)百微米范圍內(nèi)，很難制備出小粒徑的微球(<10 μm)。中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程所馬光輝院士團(tuán)隊(duì)在膜乳化技術(shù)的研究中做了大量的創(chuàng)新性工作，包括不同體系尺寸均一微球的制備、均一微球的形成機(jī)制和應(yīng)用等，取得了豐富成果。熊志冬[20]將快速膜乳化技術(shù)用于尺寸均一的葡甘聚糖微球的制備。與傳統(tǒng)方法相比，膜乳化法由于反應(yīng)條件溫和、能耗低、操作簡(jiǎn)單且易于放大等優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)在多個(gè)領(lǐng)域得到應(yīng)用。利用快速膜乳化法制備尺寸均一的小粒徑KGM微球，通過(guò)對(duì)油相組成、表面活性劑用量、不同油水比例等因素的優(yōu)化，得到粒徑分布系數(shù)(span值)為0.9、粒徑小于10 μm的均一小顆粒KGM微球。

圖2 KGM微球的光鏡照片[16]Fig.2 Microscopic photo of KGM microspheres[16]

2.3 葡甘聚糖微球的結(jié)構(gòu)調(diào)控

在KGM微球的粒徑得到有效控制的基礎(chǔ)上，針對(duì)生物大分子分離對(duì)于大孔型分離介質(zhì)的需求，筆者所在團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了反膠團(tuán)溶脹法制備聚合物微球[21-24]，而陳娟[25]在此基礎(chǔ)上發(fā)展了膠團(tuán)溶脹法制備出孔徑達(dá)到百納米以上葡甘聚糖微球。反膠團(tuán)溶脹法制備大孔微球已經(jīng)用于制備超大孔聚苯乙烯(PST)微球[21-22]、超大孔聚甲基丙烯酸縮水甘油酯微球(PGMA)[23-24]，所得微球的平均孔徑為100～800 nm，且孔徑是可調(diào)可控的。與瓊脂糖介質(zhì)相比，超大孔介質(zhì)用于乙肝疫苗的分離純化，在流速提高8倍、動(dòng)態(tài)載量提高8倍的條件下，乙肝疫苗回收率達(dá)到68.33%，純化倍數(shù)達(dá)3.47倍，顯示了突出優(yōu)勢(shì)[26]。但是，將PST聚合物微球和PGMA聚合物微球用于生物大分子的純化時(shí)，需要對(duì)表面進(jìn)行親水覆層。為了一步制備出具有大孔徑的葡甘聚糖微球，陳娟[25]研發(fā)了膠團(tuán)溶脹法，具體原理是在水相中加入較高含量的水溶性表面活性劑，表面活性劑在水相中形成大量的膠團(tuán)聚集體，當(dāng)水相分散到油相后，水相液滴內(nèi)的膠團(tuán)可以自發(fā)從油相中吸收油分而溶脹，形成一種油/表面活性劑/水(O/S/W)乳液；交聯(lián)固化后，內(nèi)部油相和多糖骨架發(fā)生相分離，油相所占據(jù)的部分形成大孔。通過(guò)考察表面活性劑的類型、油相水相比例、助表面活性劑類型、復(fù)合表面活性劑用量和葡甘聚糖溶液濃度等因素對(duì)魔芋葡甘聚糖微球形貌、孔徑及孔結(jié)構(gòu)的影響，進(jìn)行優(yōu)化后得到孔徑達(dá)100 nm的大孔葡甘聚糖微球(圖3)。

圖3 大孔KGM微球的電鏡照片[25]Fig.3 SEM image of macroporous KGM microspheres[25]

3 葡甘聚糖微球作為分離介質(zhì)的應(yīng)用

凝膠過(guò)濾層析是各種柱層析中最溫和的分離方式，是利用凝膠介質(zhì)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，根據(jù)分子的尺寸大小進(jìn)行分離。分子尺寸不同的樣品進(jìn)入層析柱后，產(chǎn)生擴(kuò)散效應(yīng)：較小的分子擴(kuò)散進(jìn)入凝膠填料孔隙內(nèi)部，流動(dòng)緩慢；而較大的分子不會(huì)進(jìn)入載體內(nèi)部，與流動(dòng)相同時(shí)流出層析柱。這種利用顆粒內(nèi)部擴(kuò)散的作用，使樣品組分從層析柱內(nèi)按照從大到小的順序依次流出，達(dá)到分離的目的。這就要求凝膠介質(zhì)應(yīng)由惰性成分組成，帶有盡量少的帶電基團(tuán)，以避免非特異性吸附。葡甘聚糖是一種中性分子，非常符合凝膠過(guò)濾層析介質(zhì)對(duì)基質(zhì)材料的要求。熊志冬[20]將葡甘聚糖制備成微球后發(fā)現(xiàn)：內(nèi)部孔徑分布均勻，粒徑均一性良好；通過(guò)調(diào)控糖濃度和交聯(lián)度，得到分子量可調(diào)控的微球(1～10)×103(GM-1250微球)或(4～30)×103(GM-1225微球)，對(duì)于GM-1250來(lái)說(shuō)，任何分子量小于1.0×104的蛋白質(zhì)分子都可以進(jìn)行脫鹽或溶液置換。Xiong等[27]利用KGM凝膠柱對(duì)百日咳絲狀血凝素蛋白(FHA)溶液進(jìn)行脫鹽，F(xiàn)HA的回收率超過(guò)95%，脫鹽效果與Sephadex G25相當(dāng)(圖4)。KGM微球具有優(yōu)良的物理化學(xué)穩(wěn)定性，能夠耐受寬的pH(1～14)和高濃度的鹽酸胍和脲，易于清洗、消毒以及再生，介質(zhì)的使用壽命長(zhǎng)。離子交換介質(zhì)是應(yīng)用最為廣泛的一種介質(zhì)類型，葛佳麗等[28]將KGM微球進(jìn)行了DEAE化學(xué)修飾，通過(guò)正交試驗(yàn)確定了最佳反應(yīng)參數(shù)，得到功能基密度適宜、偶聯(lián)工藝穩(wěn)定的陰離子交換介質(zhì)；將該介質(zhì)用于牛血紅蛋白的吸附，蛋白吸附率高達(dá)126.84 mg/mL，蛋白洗脫率達(dá)到90.42%，分離純化效果良好。

圖4 Sephadex G25 以及GM-1250 對(duì)百日咳絲狀血凝素蛋白(FHA)的脫鹽效果[27]Fig.4 Desalting effects of Sephadex G25 and GM-1250 on FHA[27]

4 葡甘聚糖微球作為細(xì)胞培養(yǎng)微載體的應(yīng)用

自荷蘭學(xué)者van Wezel[29]于1967年創(chuàng)立了微載體細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)以來(lái)，動(dòng)物細(xì)胞微載體規(guī)模培養(yǎng)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)疫苗和基因工程產(chǎn)品等，有力推動(dòng)了現(xiàn)代生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。微載體是指適用于貼壁依賴性細(xì)胞在其表面貼附生長(zhǎng)的可懸浮微球，一般直徑為60～250 μm。微載體培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合了懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，不僅可提供大的比表面積，還有效提高細(xì)胞擴(kuò)增數(shù)量和反應(yīng)器及培養(yǎng)基的利用率。目前，利用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)的生物制品已占世界生物高技術(shù)產(chǎn)品市場(chǎng)份額的50%左右[20]。由于微載體在細(xì)胞規(guī)模培養(yǎng)中的重要作用，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)開(kāi)發(fā)出多種商品化微載體，典型代表包括電荷型微載體Cytodex-1、膠原覆層型微載體Cytodex-3和大孔可降解微載體Cultispher等[20]。前2種都是以葡聚糖微球?yàn)榛|(zhì)材料開(kāi)發(fā)的，在市場(chǎng)上處于壟斷地位。由于進(jìn)口微載體價(jià)格昂貴，限制了其在很多國(guó)內(nèi)企業(yè)的大規(guī)模應(yīng)用。有些企業(yè)為降低成本會(huì)多次重復(fù)使用，而重復(fù)使用的微載體含有大量細(xì)胞培養(yǎng)的殘留物，很難清除，最終會(huì)影響細(xì)胞培養(yǎng)的穩(wěn)定性和安全性。因此，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)微載體的國(guó)產(chǎn)化具有重要意義和應(yīng)用價(jià)值。

4.1 電荷型微載體

電荷型微載體是一種普適型微載體，已用于50多種細(xì)胞系的培養(yǎng)。熊志冬[20]制備了具有不同KGM濃度、不同交聯(lián)度和不同粒徑大小的KGM微球，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當(dāng)KGM偶聯(lián)DEAE后，得到電荷型微載體，它的水分含量控制在87%～92%，電荷密度控制在1.2～3.0 mmol/g(以1 g干球計(jì))；利用響應(yīng)曲面法考察各因素對(duì)微載體上細(xì)胞生長(zhǎng)的影響后發(fā)現(xiàn)，骨架密度、粒徑大小和交聯(lián)度對(duì)Vero細(xì)胞在KGM微載體上的生長(zhǎng)具有顯著的影響，且各影響因素與響應(yīng)值之間不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，各因素之間的交互作用顯著影響細(xì)胞的生長(zhǎng)(粒徑與配基添加量、粒徑與交聯(lián)度、配基添加量與交聯(lián)度)；將最優(yōu)條件下制備的KGM微載體用于Vero細(xì)胞培養(yǎng)并與進(jìn)口微載體進(jìn)行對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞能夠更快地黏附和增殖，展現(xiàn)了更好的生長(zhǎng)狀態(tài)和細(xì)胞活力(圖5)。Sun等[30]考察Vero、CHO-K1、MDCK、Wish以及L929細(xì)胞在KGM微載體和Cytodex-1上的生長(zhǎng)和代謝水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)4～5 d后，除L929細(xì)胞外所有細(xì)胞增殖密度均超過(guò)1.0×106個(gè)/mL；Vero、CHO-K1、MDCK、L929細(xì)胞在KGM微載體上的生長(zhǎng)速率更高，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，而Wish細(xì)胞在2種微載體上沒(méi)有明顯區(qū)別。

圖5 葡甘聚糖(KGM)與Cytodex-1微載體上培養(yǎng)Vero 細(xì)胞的結(jié)果[20]Fig.5 Results of Vero cells on KGM microcarrier and Cytodex-1[20]

4.2 膠原覆層型微載體

膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成部分，具有促進(jìn)細(xì)胞黏附與增殖的作用。將膠原包覆于KGM微球表面，更適用于培養(yǎng)難以生長(zhǎng)的細(xì)胞以及細(xì)胞作為產(chǎn)物的情況。膠原層能夠被胰蛋白酶和膠原酶消化，能夠?qū)崿F(xiàn)微載體上細(xì)胞的快速解離，并維持細(xì)胞的活性、功能和完整性?？弟Q耀等[31]以直徑為 160～212 μm、粒徑均一的 KGM 微球?yàn)榛|(zhì)，建立兩步偶聯(lián)膠原的微載體制備方法，并系統(tǒng)考察各因素對(duì)微載體制備的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：活化溫度與時(shí)間對(duì) KGM 微球表面環(huán)氧基密度的影響顯著；利用正交試驗(yàn)優(yōu)化后，微載體蛋白偶聯(lián)量為1.16%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，靜態(tài)培養(yǎng)Vero細(xì)胞，最大細(xì)胞密度可達(dá) 1.7×106個(gè)/mL，培養(yǎng)效果與進(jìn)口膠原覆層型微載體Cytodex-3 相當(dāng)。由此可見(jiàn)，膠原覆層型KGM微載體具體巨大的應(yīng)用潛力。

4.3 膠原-電荷復(fù)合型微載體

電荷型微載體和膠原型微載體在細(xì)胞培養(yǎng)中各有特色。細(xì)胞一般帶負(fù)電荷，能快速貼附于帶正電荷的微載體上，但細(xì)胞貼附后生長(zhǎng)和增殖較慢；雖然膠原型微載體支持細(xì)胞較快生長(zhǎng)，但貼附速度較慢。如果能夠結(jié)合兩者的優(yōu)勢(shì)，將得到性能更優(yōu)越的微載體。汪少久等[32]以葡甘聚糖微球?yàn)榛|(zhì)，先通過(guò)胺化反應(yīng)偶聯(lián) DEAE，使其表面帶正電荷，再用膠原蛋白包覆，考察活化方法、蛋白來(lái)源等對(duì)微載體性能的影響，同時(shí)將膠原-電荷復(fù)合作用微載體的細(xì)胞培養(yǎng)情況與商品化電荷型微載體Cytodex-1和膠原覆層型微載體Cytodex-3進(jìn)行對(duì)照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：接種細(xì)胞2 h后，Cytodex-1上貼附的細(xì)胞數(shù)最多，其次為基于不同電荷密度的復(fù)合型微載體，Cytodex-3上貼附的細(xì)胞數(shù)最少，說(shuō)明貼附過(guò)程是電荷起主導(dǎo)作用(圖6(a))；復(fù)合型微載體的細(xì)胞貼附速度處于電荷型微載體和膠原型微載體之間，其細(xì)胞貼附速度比膠原型微載體明顯提升；從細(xì)胞生長(zhǎng)來(lái)看，接種72 h后，Cytodex-3和復(fù)合型微載體上細(xì)胞生長(zhǎng)明顯加快，在96 h開(kāi)始細(xì)胞數(shù)逐漸超過(guò) Cytodex-1；培養(yǎng)到144 h時(shí)，復(fù)合型微載體上的細(xì)胞數(shù)略高于膠原型微載體Cytodex-3，顯著高于Cytodex-1(圖6(b))。由此可見(jiàn)，復(fù)合型微載體結(jié)合了電荷型微載體和膠原型微載體的優(yōu)點(diǎn)，具有貼附速度更快、生長(zhǎng)速度更高的優(yōu)點(diǎn)。

圖6 Vero細(xì)胞在膠原-電荷復(fù)合型微載體上的貼附曲線和生長(zhǎng)曲線[30，32]Fig.6 Verocells attachment and growth curves on the collagen-charge composite microcarrier[30,32]

4.4 葡甘聚糖微球用于干細(xì)胞培養(yǎng)

干細(xì)胞和再生醫(yī)學(xué)研究是生命科學(xué)研究的制高點(diǎn)，對(duì)國(guó)民健康保障和經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展具有重要意義。干細(xì)胞和再生醫(yī)學(xué)研究已經(jīng)成為各國(guó)政府、科技界和產(chǎn)業(yè)界高度關(guān)注和大力投入的戰(zhàn)略必爭(zhēng)領(lǐng)域。具有充足數(shù)量、良好活性和功能的干細(xì)胞是開(kāi)展相關(guān)工作的基石。干細(xì)胞體外擴(kuò)增目前仍以傳統(tǒng)的 2D 培養(yǎng)為主。干細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)環(huán)境非常敏感，微載體的性質(zhì)(包括機(jī)械硬度、孔隙結(jié)構(gòu)、表面功能、粗糙度和微圖案化)都會(huì)影響干細(xì)胞的貼附、增殖、分化以及外分泌等[33]。

James等[34]發(fā)現(xiàn)，調(diào)整細(xì)胞外環(huán)境的硬度能夠影響細(xì)胞的生物力學(xué)特性，當(dāng)細(xì)胞受到細(xì)胞外環(huán)境硬度的力學(xué)刺激后，會(huì)對(duì)細(xì)胞骨架的力學(xué)特性產(chǎn)生影響，細(xì)胞骨架在感知這一力學(xué)刺激之后，做出響應(yīng)使骨架重排，細(xì)胞張力也隨骨架的重排發(fā)生改變；細(xì)胞骨架在做出細(xì)胞張力改變的響應(yīng)后，細(xì)胞膜表面的黏附位點(diǎn)也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的改變，最終使細(xì)胞形態(tài)和黏附、鋪展發(fā)生改變。但是，微載體的硬度對(duì)于干細(xì)胞規(guī)模培養(yǎng)到底是怎樣的影響規(guī)律仍未得到透徹研究。Yan等[35]通過(guò)調(diào)控微球中葡甘聚糖的含量(8%、10%、12%和16%)，得到硬度為0.18～9.73 MPa的電荷型微載體，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)：對(duì)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)隨載體硬度的增加而增大，當(dāng)微載體的硬度為2～4 MPa時(shí)，細(xì)胞的增殖情況最好，培養(yǎng)11 d后約增殖27倍，是Cytodex-1的1.7倍(圖7)；但微載體硬度繼續(xù)增加時(shí)，會(huì)導(dǎo)致增殖倍數(shù)的下降；對(duì)MSCs的三系分化能力進(jìn)行測(cè)定后發(fā)現(xiàn)，在最優(yōu)硬度(2～4 MPa)下MSCs在KGM微載體上的分化潛能是Cytodex-1的3.2倍(圖8)?？梢?jiàn)，具有可控硬度的KGM微載體有望成為適于MSCs規(guī)模擴(kuò)增的優(yōu)良材料。

圖7 12%KGM微載體與商品化微載體Cytodex-1上MSCs細(xì)胞擴(kuò)增的比較[35]Fig.7 Comparation of MSCs proliferation between 12%KGM microcarriers and commercial microcarriers Cytodex-1[35]

圖8 12%KGM微載體與商業(yè)微載體Cytodex-1的三系分化潛能比較[35]Fig.8 Comparation of trilineage differentiation potential between 12%KGM microcarriers and commercial microcarriers Cytodex-1 with Western blotting analysis[35]

5 結(jié)論與展望

本文介紹了魔芋葡甘聚糖微球的制備和作為分離介質(zhì)、細(xì)胞/干細(xì)胞培養(yǎng)微載體的高值化利用。葡甘聚糖進(jìn)行降解后，通過(guò)懸浮擴(kuò)散法、膜乳化技術(shù)得到粒徑可控的葡甘聚糖微球，通過(guò)膠團(tuán)溶脹法制備大孔型KGM微球。在分離純化方面，葡甘聚糖微球本身能夠用于凝膠過(guò)濾和脫鹽，通過(guò)DEAE衍生得到離子交換分離介質(zhì)，介質(zhì)性能穩(wěn)定，分離純化效果良好。由于葡甘聚糖具有豐富的可調(diào)控性，針對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的需求，發(fā)展了電荷型、膠原型、膠原-電荷復(fù)合型微載體，用于Vero、CHO-K1、MDCK、Wish以及L929細(xì)胞的培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)效果達(dá)到或超過(guò)進(jìn)口微載體。將硬度可控的KGM微載體用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，硬度為2～4 MPa的微載體最適于MSCs的增殖，培養(yǎng)11 d后，細(xì)胞數(shù)目擴(kuò)增倍數(shù)達(dá)到27倍，優(yōu)于商品化的微載體。

葡甘聚糖微球作為分離純化介質(zhì)在保證微球親水性的同時(shí)，提高其力學(xué)強(qiáng)度和分離純化性能，作為細(xì)胞培養(yǎng)微載體滿足常規(guī)細(xì)胞系規(guī)模培養(yǎng)需求、針對(duì)干細(xì)胞的“個(gè)性化”培養(yǎng)設(shè)計(jì)適宜的結(jié)構(gòu)和表面功能將是未來(lái)的研究重點(diǎn)。葡甘聚糖微球系列產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)以及作為生化工程材料的應(yīng)用，開(kāi)辟了葡甘聚糖的新應(yīng)用領(lǐng)域，為葡甘聚糖的高值化利用提供參考。

僅以此文獻(xiàn)給敬愛(ài)的歐陽(yáng)平凱院士！