占 鉆,劉 勇,劉 堅,黃 亮,曹春水

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院急診科,南昌 330006)

腹主動脈瘤(abdominal aortic aneurysm,AAA)是一種常見的動脈退行性疾病,破裂后死亡率較高,破裂風(fēng)險與瘤體直徑呈正比,對于大AAA(直徑>5.5 cm)的主要治療方法包括開放手術(shù)和介入腔內(nèi)覆膜支架植入術(shù);而對于小AAA(直徑<5.5 cm)手術(shù)并不能帶來獲益[1],治療目標(biāo)是避免其不斷進展甚至破裂,臨床上仍沒有合適的治療策略[2],多以觀察隨訪為主。因此,尋找控制和延緩小AAA不斷增大的治療策略對于降低AAA的破裂發(fā)生率和死亡率具有重要意義。課題組既往研究發(fā)現(xiàn),咖啡酸苯乙酯(caffeic acid phenethyl ester,CAPE)對小AAA可能具有保護作用[3],但具體機制有待深入研究。本研究擬通過建立大鼠AAA模型,進一步觀察CAPE的干預(yù)作用,并從炎性反應(yīng)角度探討可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SPF級雄性SD大鼠18只,8周齡,購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機分為假手術(shù)組、模型組及CAPE干預(yù)組,每組6只。

1.2 主要試劑

兔基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2多克隆抗體、兔MMP-9多克隆抗體、小鼠環(huán)氧合酶-2(COX-2)多克隆抗體購自美國Affinity公司,兔前列腺素E2(PGE2)多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司,辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1模型制作及干預(yù)

大鼠AAA模型制作參考文獻[4]。術(shù)前大鼠禁食12 h,腹腔注射10%水合氯醛麻醉,充分暴露腹主動脈向上、向下分別達左腎靜脈和左側(cè)髂總動脈水平,于左腎動脈開口下方安放無損傷微動脈夾阻斷腹主動脈,左側(cè)髂總動脈前壁穿刺置管,結(jié)扎左側(cè)髂總動脈遠端及右側(cè)髂總動脈。留置管內(nèi)緩慢推入肝素生理鹽水驗證腹主動脈是否完全封閉。模型組及CAPE干預(yù)組大鼠腹主動脈腔內(nèi)注入(豬胰)彈性蛋白酶(250 U/mL),加壓灌注60 min,松開遠端阻斷的動脈夾,檢查有無回血漏血。確定主動脈無出血后逐層縫合。術(shù)后大鼠單籠飼養(yǎng),CAPE干預(yù)組腹腔注射CAPE 10 μmol·kg-1·d-1,每日1次,持續(xù)14 d,模型組和假手術(shù)組在相同時間內(nèi)注射等劑量生理鹽水。所有大鼠在彈性蛋白酶灌注前、灌注后即刻及灌注后14 d使用游標(biāo)卡尺測量腹主動脈和AAA直徑。使用游標(biāo)卡尺測量擴張段最大直徑超過正常腹主動脈直徑的一半作為AAA造模成功的標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.2病理學(xué)研究

處死大鼠后,取腹主動脈及AAA組織置于10%中性甲醛溶液中固定,脫水、透明、包埋、石蠟切片,行蘇木素-伊紅染色法(HE)染色、Van Gieson(VG)染色,觀察病理學(xué)改變情況。免疫組織化學(xué)檢測血管壁組織COX-2、PGE2、MMP-2及MMP-9水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 CAPE對大鼠AAA直徑的影響

所有大鼠均存活,造模成功。3組大鼠灌注前腹主動脈直徑無明顯差異(P>0.05)。模型組及CAPE干預(yù)組大鼠灌注后即刻AAA直徑比較無差異[(2.38±0.18)mmvs.(2.49±0.05)mm,P>0.05],但均較假手術(shù)組腹主動脈直徑(1.44±0.08)mm明顯增大,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。灌注后14 d模型組、CAPE干預(yù)組大鼠AAA直徑較假手術(shù)組腹主動脈直徑增大[(3.32±1.23)mm、(2.42±0.14) mmvs.(1.47±0.08) mm,P<0.05)],CAPE干預(yù)組較模型組減小(P<0.05),見圖1。

a:P<0.05,與假手術(shù)組比較;b:P<0.05,與模型組比較。圖1 大鼠腹主動脈與AAA直徑比較

2.2 CAPE對大鼠AAA形成早期血管壁病理結(jié)構(gòu)的影響

HE染色顯示,模型組中動脈血管壁發(fā)生退行性病變,中膜部分組織結(jié)構(gòu)紊亂,血管壁炎癥浸潤明顯。而在CAPE干預(yù)組瘤樣擴張不明顯,組織結(jié)構(gòu)較模型組趨于完整,有炎癥浸潤,但較模型組明顯減少。VG染色顯示,與假手術(shù)組比較,模型組血管壁中膜肌纖維明顯減少,膠原纖維紊亂不連續(xù),降解明顯,外膜增厚;與模型組比較,CAPE干預(yù)組血管壁中膜肌纖維增加,膠原纖維斷裂及降解情況好轉(zhuǎn),見圖2。

圖2 大鼠腹主動脈及AAA血管壁組織HE染色(400×)和VG染色(100×)對比

2.3 CAPE對大鼠AAA形成早期血管壁組織COX-2、PGE2、MMP-2及MMP-9水平的影響

與假手術(shù)組腹主動脈血管壁組織比較,模型組及CAPE干預(yù)組AAA血管壁組織COX-2、PGE2、MMP-2及MMP-9水平明顯升高(P<0.05)。與模型組比較,CAPE干預(yù)組AAA血管壁組織COX-2、PGE2、MMP-2及MMP-9水平明顯降低(P<0.05),見圖3、表1。

表1 各組大鼠血管壁組織COX-2、PGE2、MMP-2和MMP-9水平比較

圖3 免疫組織化學(xué)檢測各組大鼠血管壁組織COX-2、PGE2、MMP-2及MMP-9水平(400×)

3 討 論

AAA的主要病理學(xué)改變包括炎性反應(yīng)、血管平滑肌細胞(VSMC)減少及細胞外基質(zhì)的降解和重塑[5]。其中,炎性反應(yīng)在AAA發(fā)生和發(fā)展中的作用尤為重要,貫穿了從形成至破裂的全過程。研究發(fā)現(xiàn),在AAA血管壁存在大量的炎癥細胞浸潤[6],巨噬細胞是血管瘤炎性反應(yīng)的主要效應(yīng)細胞[7],其高表達于動脈內(nèi)膜和中膜。有研究發(fā)現(xiàn),抑制進入主動脈壁的免疫及炎性反應(yīng)可能影響AAA的進展[8-9]。

CAPE是蜂膠中提取出的一種生物活性成分,被廣泛應(yīng)用于燒傷、腫瘤、心血管疾病、糖尿病、局部創(chuàng)傷和皮膚等的治療,已被證明其具有抗炎癥、抗氧化應(yīng)激、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤等多重的生物活性且無毒副作用[10-13]。本實驗研究發(fā)現(xiàn),CAPE可抑制AAA不斷增大,CAPE治療后AAA血管壁炎癥細胞浸潤減少,組織破壞減輕,提示CAPE對大鼠早期AAA形成的抑制作用與抑制炎性反應(yīng)有關(guān)。

PGE2是與炎性反應(yīng)密切相關(guān)的一種前列腺素類化合物,具有促炎作用,其生物合成主要受磷脂酶A(phopholipase A,PLA)、COX-2及前列腺素E2合酶(mPGES-1)的調(diào)控。AAA作為一種慢性炎癥性疾病,PGE2同樣在其發(fā)病過程中起著重要作用[14]。研究表明,PGE2介導(dǎo)的炎性反應(yīng)失調(diào)可導(dǎo)致AAA,人AAA組織COX-2和PGE2呈高表達,通過服用非甾體類抗炎藥物抑制PGE2的合成能明顯減慢AAA的增大速度[15]。通過COX-2/PGE2信號通路的抑制或基因敲除干擾PGE2的合成亦可抑制AAA的進展[16]。

MMPs與AAA的形成及破裂密切相關(guān)[17],其中MMP-9及MMP-2在AAA組織中表達水平明顯升高[18],其活性增強可以加速血管壁彈性蛋白降解,降低主動脈壁穩(wěn)定性,進而導(dǎo)致動脈壁瘤樣擴張[19]。研究顯示,PGE2能夠刺激巨噬細胞分泌MMP-2和MMP-9,從而增加動脈粥樣斑塊的不穩(wěn)定性,而通過降低COX-2、mPGES-1水平減少PGE2的產(chǎn)生,則能增加其穩(wěn)定性[20]。PGE2在AAA中調(diào)控MMPs的具體機制仍不明確,MAMUN等[21]研究發(fā)現(xiàn)通過抑制PGE2的受體EP4通路可降低MMP-2及MMP-9水平,從而抑制動脈瘤進展。

本研究免疫組織化學(xué)檢測顯示,CAPE干預(yù)后可有效抑制大鼠AAA血管壁組織COX-2、PGE2、MMP-9及MMP-2水平的升高,提示CAPE對早期AAA的保護作用機制可能與抑制上述指標(biāo)相關(guān),但具體機制仍需進一步通過基因干擾等體內(nèi)外研究驗證。