陳 赟,杜坤銳,王婧吉,楊晨曦,楊義萍,王 娟,張聞東

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,安徽 合肥 230061;2.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院針灸臨床研究所,安徽 合肥 230061;3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院,安徽 合肥 230012)

抑郁是一種復(fù)雜的異質(zhì)性精神系統(tǒng)疾病,發(fā)病率高且呈現(xiàn)年輕化的趨勢(shì)[1-2]。目前,抗抑郁治療藥物以5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)再攝取抑制劑為主,然而該類藥物具有起效緩慢、不良反應(yīng)大的缺點(diǎn),導(dǎo)致部分患者中途停止服藥[3]。抑郁的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,其中氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)以及突觸損傷被認(rèn)為是抑郁發(fā)生的重要機(jī)制[4]。有研究[5]表明,抑郁自殺患者腦組織表現(xiàn)出過度的氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)。而氧化損傷能促進(jìn)鈣離子依賴的蛋白降解酶calpain的功能[6]。通過復(fù)制小鼠抑郁模型,Shen等[7]報(bào)道了氧化應(yīng)激-calpain-炎癥信號(hào)軸在抑郁發(fā)生過程中的關(guān)鍵作用,該信號(hào)軸抑制氧化性損傷或calpain的功能可以改善抑郁樣行為。

電針療法可有效緩解抑郁患者和模型動(dòng)物的抑郁樣行為[8-9],且該療法具有安全性高和不良反應(yīng)小等優(yōu)勢(shì),已在全球多個(gè)國(guó)家用于治療抑郁[10]?！鞍贂?huì)-神門-三陰交”是針灸臨床報(bào)道中治療抑郁采用較多的組穴[11-12],也是本團(tuán)隊(duì)依據(jù)中國(guó)針灸學(xué)會(huì)《循證針灸臨床實(shí)踐指南》方案治療抑郁的常用處方。然而針刺“百會(huì)-神門-三陰交”組穴是否通過調(diào)控氧化應(yīng)激損傷-calpain-炎癥信號(hào)軸發(fā)揮抗抑郁的作用尚不清楚。本研究擬通過慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)抑郁模型,評(píng)價(jià)電針“百會(huì)-神門-三陰交”組穴的抗抑郁作用,以期從海馬氧化應(yīng)激-calpain-炎癥信號(hào)軸揭示其作用機(jī)制,為電針治療抑郁的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2月齡SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠48只,購(gòu)于安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,生產(chǎn)許可證號(hào): SCXK(皖)2016-0009,體質(zhì)量為20～25 g。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前,按照以下條件給予動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周:光周期為8:00～20:00,室內(nèi)濕度為45%～65%,室溫為20～24 ℃,自由飲水、進(jìn)食。本實(shí)驗(yàn)已通過安徽中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查委員會(huì)審批(審批號(hào): AHUCM-mouse-20210205),動(dòng)物處置、操作均參照中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部于2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》相關(guān)規(guī)定。

1.2 主要試劑 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性檢測(cè)試劑盒(貨號(hào) BC0175)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量檢測(cè)試劑盒(貨號(hào) BC0025):北京索萊寶;白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β酶聯(lián)免疫試劑盒(貨號(hào) JL18442)、5-HT酶聯(lián)免疫試劑盒(貨號(hào) JL12087)、血清皮質(zhì)酮(corticosterone,CORT)酶聯(lián)免疫試劑盒(貨號(hào) JL11918):江萊生物。calpain-1(貨號(hào) 2556S)、1L-1β(貨號(hào) 12703S):美國(guó)Cell Signaling Technology。

1.3 主要儀器 脈沖針灸治療儀(型號(hào) KWD-808):常州英迪電子醫(yī)療器械有限公司;低溫高速離心機(jī)(型號(hào) Micro-21R):美國(guó)Thermo;電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(型號(hào) EPS 600):北京天能;全自動(dòng)樣品快速研磨儀(型號(hào) JXFSTPRP-96):上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司;酶標(biāo)儀(型號(hào) Synergy LX):美國(guó)Bio-Tek;一次性無菌針灸針(0.15 mm×13 mm):蘇州醫(yī)療用品廠有限公司;電擊箱(型號(hào) 40500-001):意大利 UgoBasile 公司。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組 CUMS模型復(fù)制時(shí),采用隨機(jī)數(shù)字表法將24只小鼠分為正常組、模型組、電針組和維生素C(vitamin C,VC)組,每組6只;為進(jìn)一步揭示氧化應(yīng)激-calpain-炎癥信號(hào)軸在抑郁中的作用機(jī)制,研究按2 mg/kg劑量給予小鼠腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)復(fù)制小鼠急性抑郁模型[13]。將24只小鼠分為正常組、模型組、鈣蛋白酶抑制劑(calpeptin inhibitor,CI)組和N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)組,每組6只。

2.2 模型復(fù)制及干預(yù)措施

2.2.1 CUMS模型復(fù)制及干預(yù)措施 模型組、電針組和VC組小鼠自第2周至第7周給予14種刺激(禁食24 h,禁水24 h,浸濕墊料24 h,去除墊料24 h,傾斜鼠籠12 h,噪音刺激3 h,異味刺激3 h,束縛2 h,搖晃鼠籠5 min,夾尾5 min,晝夜顛倒,強(qiáng)度為1 mA的電流刺激3 次、持續(xù)2 s,4 ℃冷水游泳5 min,45 ℃熱水游泳5 min),每天隨機(jī)選擇2種刺激(避免連續(xù)重復(fù)的刺激源),建立CUMS模型[14]。動(dòng)物模型復(fù)制期間,每周測(cè)量并記錄體質(zhì)量。模型復(fù)制結(jié)束后,立即進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試。

從建立CUMS模型的第3周開始,正常組、模型組、電針組小鼠給予0.5 mL生理鹽水灌胃3周;VC組小鼠給予10 mg/kg VC注射液灌胃3周。電針組小鼠限制在固定裝置內(nèi),采用0.15 mm×13 mm規(guī)格針灸針,先刺“百會(huì)”穴(位于頂骨正中),再刺兩側(cè)“神門”穴(位于前肢內(nèi)側(cè)腕部橫紋尺骨邊緣)與“三陰交”穴(位于后肢內(nèi)踝尖直上約5 mm),針刺深度2～3 mm,通過脈沖針灸治療儀對(duì)“神門”穴(正極)、“三陰交”穴(負(fù)極)進(jìn)行電針刺激,頻率為2 Hz,電流為0.5 mA,每日1次,每次持續(xù)20 min,持續(xù)干預(yù)3周。取穴參照中國(guó)針灸學(xué)會(huì)制定的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常用穴位名稱與定位 第3部分:小鼠》[15]。正常組、模型組和VC組的小鼠僅被限制于同樣裝置,不予電針干預(yù)。

2.2.2 急性抑郁模型復(fù)制及干預(yù)措施 小鼠經(jīng)1周適應(yīng)后,按2 mg/kg劑量腹腔注射濃度為200 ng/mL的LPS,建立小鼠急性抑郁模型[13]。NAC組小鼠經(jīng)腦定位(前囟后0.8 mm,硬腦膜下2.0 mm)后,注射3 μL NAC至D3側(cè)腦室。CI小鼠在評(píng)估小鼠海馬炎癥因子水平之前按2 mg/kg經(jīng)腹腔注射CI。NAC和CI的給藥劑量參考文獻(xiàn)[8]。

2.3 各組小鼠體質(zhì)量比較 體質(zhì)量是機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育的一個(gè)重要指標(biāo),可以反映小鼠的生長(zhǎng)情況。實(shí)驗(yàn)開始后,采用電子天平測(cè)量每只小鼠體質(zhì)量,每周1次,連續(xù)7周監(jiān)測(cè)各組小鼠體質(zhì)量變化。

2.4 行為學(xué)測(cè)試

2.4.1 蔗糖水偏好實(shí)驗(yàn) CUMS模型復(fù)制開始后,每周進(jìn)行蔗糖水偏好實(shí)驗(yàn)1次。每只小鼠分別飲用40 mL的自來水和40 mL的1%蔗糖水各1瓶,待24 h后,測(cè)量每只小鼠消耗的糖水量及自來水量(每次測(cè)試時(shí),隨機(jī)擺放兩個(gè)水瓶的位置),計(jì)算蔗糖偏好指數(shù)。蔗糖偏好指數(shù)=蔗糖攝入量/液體總攝入量×100%。

2.4.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 以5 min為觀察時(shí)限,對(duì)每只小鼠的活動(dòng)進(jìn)行同步視頻拍攝并記錄相關(guān)參數(shù)。采用上海欣軟信息科技SuperMaze動(dòng)物行為學(xué)視頻分析軟件分析和比較各組小鼠的運(yùn)動(dòng)總路程。

2.4.3 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(forced swim test,FST) 將小鼠放入水溫為(22±3)℃的2 000 mL玻璃容器中,使其游泳6 min,前2 min為適應(yīng)期,記錄其后4 min小鼠放棄掙扎、靜止不動(dòng)的時(shí)間。采用上海欣軟信息科技SuperMaze動(dòng)物行為學(xué)視頻分析軟件分析和比較各組小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間。

2.4.4 懸尾實(shí)驗(yàn)(tail suspension test,TST) 將小鼠放入測(cè)試房間中適應(yīng)環(huán)境1 h,固定點(diǎn)取自小鼠距尾端2 cm處,使其保持倒掛狀態(tài),臺(tái)面距頭部約50 cm,用板隔開小鼠兩側(cè)視線。實(shí)驗(yàn)共需錄制視頻6 min,前2 min為適應(yīng)期,記錄其后4 min小鼠放棄掙扎、靜止不動(dòng)的時(shí)間。采用上海欣軟信息科技SuperMaze動(dòng)物行為學(xué)視頻分析軟件分析和比較各組小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間。

2.5 ELISA法檢測(cè)小鼠海馬組織SOD活性,MDA、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、IL-1β、5-HT水平以及血清CORT水平 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)之后,經(jīng)5%異氟烷麻醉并斷頭處理小鼠,隨后用剪刀和彎鑷剝離顱骨,取出大腦,冰上提取海馬組織和血。按照試劑盒說明書,檢測(cè)小鼠血清和海馬組織SOD活性,MDA、TNF-α、IL-1β、5-HT水平以及血清CORT水平。

2.6 Western blot法檢測(cè)小鼠海馬組織calpain-1、超視交叉核生物鐘振蕩蛋白(suprachiasmatic nucleus circadian oscillatory protein,SCOP)、IL-1β蛋白表達(dá)水平 海馬組織分別加入蛋白裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)勻漿裂解。裂解液提取組織總蛋白后,經(jīng)上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜等過程。在4 ℃條件下一抗[β-actin(1∶1 000),calpain-1(1∶1 000),SCOP(1∶500),IL-1β(1∶1 000)]孵育過夜。PBST洗膜3次,每次10 min。二抗室溫下孵育2 h后,運(yùn)用化學(xué)發(fā)光試劑顯影成像。使用Image J軟件分析圖像,計(jì)算各條帶吸光度值。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠行為學(xué)比較 CUMS模型復(fù)制后第2周,小鼠體質(zhì)量開始顯著下降(P<0.05),蔗糖水偏好指數(shù)下降(P<0.05)。與模型組比較,VC組和電針組小鼠體質(zhì)量均顯著增加(P<0.05),蔗糖水偏好指數(shù)均顯著上升(P<0.05)。FST和TST中,與正常組比較,模型組小鼠不動(dòng)時(shí)間均顯著增加(P<0.05);與模型組比較,VC組和電針組小鼠不動(dòng)時(shí)間均顯著減少(P<0.05)。在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中,各組小鼠運(yùn)動(dòng)總路程比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

注:A.正常組;B.模型組;C.VC組;D.電針組;與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

3.2 各組小鼠海馬組織5-HT、血清CORT水平比較 與正常組比較,模型組小鼠海馬組織5-HT水平顯著降低(P<0.05),CORT水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,VC組和電針組小鼠海馬組織5-HT水平顯著升高(P<0.05),CORT水平顯著降低(P<0.05)。見圖2。

注:A.正常組;B.模型組;C.VC組;D.電針組;與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

3.3 各組小鼠海馬組織SOD活性和MDA水平比較 與正常組比較,模型組小鼠海馬組織SOD活性顯著下降(P<0.05),MDA水平顯著上升(P<0.05);與模型組比較,VC組和電針組小鼠海馬組織SOD活性顯著升高(P<0.05),MDA水平顯著下降(P<0.05)。見圖3。

注:A.正常組;B.模型組;C.VC組;D.電針組;與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

3.4 各組小鼠海馬組織calpain-1、SCOP和IL-1β表達(dá)水平比較 與正常組比較,模型組小鼠海馬組織calpain-1、IL-1β表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),SCOP表達(dá)水平顯著下降(P<0.05);與模型組比較,VC組和電針組小鼠海馬calpain-1、IL-1β表達(dá)水平顯著下降(P<0.05),SCOP表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見圖4。

注:A.正常組;B.模型組;C.VC組;D.電針組;與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

3.5 各組小鼠海馬組織1L-1β、TNF-α水平比較 與正常組比較,模型組小鼠海馬組織TNF-α、1L-1β水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,CI組和NAC組小鼠海馬組織TNF-α、1L-1β水平顯著下降(P<0.05)。見圖5。

注:A.正常組;B.模型組;C.CI組;D.NAC組;與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

4 討論

CUMS是一種可以誘導(dǎo)動(dòng)物出現(xiàn)抑郁樣行為和類似抑郁患者生理病理狀態(tài)的方法[16]。本實(shí)驗(yàn)通過復(fù)制CUMS小鼠模型,探討電針改善小鼠抑郁樣行為的內(nèi)在機(jī)制。結(jié)果顯示,電針“百會(huì)-神門-三陰交”組穴可以改善CUMS小鼠的抑郁樣行為,其作用機(jī)制可能是通過對(duì)小鼠海馬氧化應(yīng)激-calpain-炎癥信號(hào)軸的調(diào)控實(shí)現(xiàn)的。

針灸作為一種替代療法,具有不良反應(yīng)小、療效佳等優(yōu)點(diǎn),尤其在治療神經(jīng)退行性疾病方面有顯著的臨床療效[17]。百會(huì)歸屬于督脈,位于頭部,具有醒腦開竅、安神益智、益精填髓之功[18];三陰交歸屬于足太陰脾經(jīng),是足太陰脾經(jīng)、足厥陰肝經(jīng)、足少陰腎經(jīng)之交會(huì)穴,具有健脾、疏肝、益腎、調(diào)和氣血等作用[19];神門歸屬于手少陰心經(jīng),位于腕部,具有寧心定悸、化痰定志、調(diào)和陰陽(yáng)、安神利眠等作用[20]。因此,筆者選用 “百會(huì)-神門-三陰交”組穴進(jìn)行研究。行為學(xué)測(cè)試結(jié)果顯示,各組小鼠的運(yùn)動(dòng)總路程無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),表明CUMS模型復(fù)制以及電針干預(yù)對(duì)小鼠的運(yùn)動(dòng)功能沒有影響;而電針干預(yù)可以改善CUMS小鼠抑郁樣行為,但不會(huì)影響小鼠的自主活動(dòng)。5-HT假說認(rèn)為,5-HT能神經(jīng)傳遞的減少是導(dǎo)致抑郁發(fā)生的病理生理基礎(chǔ)[21];下丘腦-垂體-腎上腺軸功能的改變是抑郁癥的特征之一,故通過檢測(cè)抑郁相關(guān)的特征性生化指標(biāo)——5-HT和CORT的水平,可以觀察抑郁的發(fā)生及改善情況。本研究發(fā)現(xiàn)CUMS模型復(fù)制后,小鼠海馬組織5-HT水平下降,而血清CORT水平升高,說明小鼠表現(xiàn)出抑郁特征,而電針能逆轉(zhuǎn)二者的異常,進(jìn)一步說明電針對(duì)抑郁有正向的干預(yù)作用。

當(dāng)機(jī)體遭受有害刺激時(shí),機(jī)體內(nèi)活性氧產(chǎn)生過多,而致機(jī)體氧化程度與氧化物的清除能力嚴(yán)重失衡[22]。SOD水平的降低以及自由基產(chǎn)生劑MDA水平的升高,可以反映機(jī)體氧化應(yīng)激的進(jìn)展?fàn)顟B(tài)[23]。電針干預(yù)后,小鼠海馬SOD活性顯著提高,而MDA水平顯著降低,說明電針干預(yù)可以有效降低CUMS小鼠海馬組織的氧化應(yīng)激水平。此外,前期亦有研究[22]顯示,針刺“百會(huì)-三陰交”能夠抑制氧化性損傷,說明“百會(huì)-三陰交”組穴參與了調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng),從而改善了小鼠抑郁樣行為。本研究中,筆者使用具有較強(qiáng)抗氧化性的VC作為陽(yáng)性對(duì)照藥,VC也有抑制CUMS造成的氧化應(yīng)激損傷的作用,同時(shí)也展現(xiàn)了較好的抗抑郁樣作用,該結(jié)果與前期文獻(xiàn)結(jié)果一致[24-25]。

氧化應(yīng)激是誘導(dǎo)calpain異常激活和炎癥反應(yīng)的一個(gè)重要原因,因而calpain可以連接氧化應(yīng)激和炎癥[26]。因此,筆者檢測(cè)了calpain-1及其底物SCOP的表達(dá)和炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵遞質(zhì)——細(xì)胞因子IL-1β。本研究結(jié)果表明,電針可以抑制CUMS小鼠海馬組織calpain-1的表達(dá),促進(jìn)其底物SCOP的表達(dá)。為進(jìn)一步驗(yàn)證calpain作為電針發(fā)揮抗炎作用的核心靶點(diǎn),筆者使用calpain抑制劑CI,探索其發(fā)揮抗炎作用的內(nèi)在機(jī)制。研究結(jié)果顯示,CI能抑制LPS誘導(dǎo)的海馬組織炎癥反應(yīng),表明了CI在抑郁發(fā)生過程中有調(diào)控炎癥反應(yīng)的作用。本次研究進(jìn)一步評(píng)價(jià)了抗氧化劑NAC對(duì)LPS誘導(dǎo)的海馬炎癥反應(yīng)的抑制作用,進(jìn)而證明了電針可能通過調(diào)控氧化應(yīng)激-calpain-炎癥信號(hào)軸發(fā)揮抗抑郁的作用。

綜上,電針“百會(huì)-神門-三陰交”組穴可以有效改善CUMS小鼠的抑郁樣行為,其內(nèi)在機(jī)制可能是通過調(diào)控氧化應(yīng)激-calpain-炎癥信號(hào)軸實(shí)現(xiàn)的。該研究為針灸治療抑郁提供了重要的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。然而,研究中依然存在一些不足之處,如電針如何調(diào)控氧化應(yīng)激,其深層次的機(jī)制仍然需要探究。有研究[27]報(bào)道電針能啟動(dòng)核因子E2相關(guān)因子2/血紅素加氧酶1的抗氧化體系,然而電針是否通過該體系發(fā)揮抗抑郁的作用仍然需要進(jìn)一步探索。