武 瑞,戴文濤,張亞南,侯欣宇,彭代銀,3,韓 嵐

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,安徽 合肥 230012;2.中藥復(fù)方安徽省重點實驗室,安徽 合肥 230012;3.安徽道地中藥材品質(zhì)提升協(xié)同創(chuàng)新中心,安徽 合肥 230012)

外泌體(exosomes,Exos)是細(xì)胞通向細(xì)胞外分泌的直徑40～100 nm的囊泡樣小體,本質(zhì)是脂質(zhì)雙分子層[1]。其可由多種細(xì)胞分泌產(chǎn)生,如淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞和血小板。Exos中包含多種蛋白質(zhì)、脂類和遺傳物質(zhì),是細(xì)胞間物質(zhì)傳遞和信息交流的一種重要方式,在神經(jīng)再生、血管新生、免疫應(yīng)答、抗原呈遞以及RNA和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運等方面具有生物學(xué)功能。有研究[2]顯示,外泌體還具有穿過血腦屏障的能力。血小板來源的外泌體(platelet-derived exosomes,PLT-Exos)攜帶多種細(xì)胞因子、生長因子、凝血因子和幾種類型的RNA,并作為血小板與細(xì)胞間相互作用的主要遞質(zhì)而成為研究熱點[3-4]。研究表明,PLT-Exos可以通過升高黏附蛋白的表達(dá)水平和降低抗黏附因子的水平增強內(nèi)皮細(xì)胞的黏附能力[5-7],且對間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖、遷移和分化有積極的影響[8]。PLT-Exos能有效誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的增殖和遷移,從而改善大鼠慢性傷口的血管生成和上皮化[9]。因此,PLT-Exos逐漸成為近年來生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的一大熱點,并且在缺血性腦損傷的診斷和治療方面顯示出極大的潛能。

近年來研究[10]發(fā)現(xiàn),腦組織血管密度增高與腦缺血再灌注損傷預(yù)后的改善有關(guān)[10]。人們開始研究腦缺血再灌注損傷后的血管新生,新生血管使腦缺血后的缺血周圍組織腦血流量和腦血流體積增加,從而恢復(fù)腦卒中后損傷的神經(jīng)功能。許多傳統(tǒng)中藥復(fù)方包含多種生物活性成分,可抑制炎癥細(xì)胞因子釋放,抑制血小板和血管內(nèi)皮細(xì)胞中黏附分子的表達(dá),以及抗血栓形成[11-13],具有促進血管新生的作用。桃紅四物湯(Taohong Siwu Decoction,THSWD)源自清代吳謙所著的《醫(yī)宗金鑒》,由桃仁、紅花、熟地黃、當(dāng)歸、白芍、川芎6味藥組成,是治療血瘀證的經(jīng)典方劑。THSWD的臨床應(yīng)用非常廣泛,可治療多種血瘀證疾病。本課題組前期研究[14]表明,THSWD對腦缺血再灌注損傷具有良好的血管生成和神經(jīng)保護作用,其機制涉及促進腦血管生長,包括調(diào)控血小板所釋放的另一種膜顆粒——血小板微顆粒(platelet microparticles,PMPs)攜帶的血管生成相關(guān)信號分子和Notch信號通路的激活。本研究旨在觀察桃紅四物湯調(diào)控的血小板源外泌體(THSWD-PLT-Exos)對腦缺血再灌注模型大鼠血管新生的作用。

1 材料

1.1 儀器與試藥 CD63抗體、TSG101抗體:江蘇Affinity公司;5-溴-2′-脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2′-deoxyuridine,BrdU)、血管性假血友病因子(von Willebrand factor,vWF)、CD9抗體:北京Bioss公司;4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI):上海Beyotime公司;凝血酶:北京Solarbio公司。

高速冷凍離心機:德國Eppendorf公司;超高速離心機:美國Beckman公司;透射電子顯微鏡:美國ThermoFisher公司;Nano Sight粒徑分析儀:英國Malvern公司;激光多普勒血流儀:瑞典Perimed公司;石蠟包埋機:孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司;倒置顯微鏡:日本Olympus公司。

1.2 動物 SPF級SD大鼠,雄性,體質(zhì)量170～210 g,購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司[生產(chǎn)許可證號 SCXK(遼)2020-0001],經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn),動物倫理編號: AHUCM-rats-202287,常規(guī)飼養(yǎng)。

2 方法

2.1 桃紅四物湯的制備 按質(zhì)量比4∶3∶3∶2∶3∶2稱取熟地黃、當(dāng)歸、白芍、川芎、桃仁、紅花6味藥材,加入藥物總質(zhì)量10倍量的75%乙醇冷凝回流提取2 h,過濾并保留濾液,濾渣加入藥物原總質(zhì)量8倍量的75%乙醇冷凝回流提取2 h后再過濾,將兩次濾液合并,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮成1.8 g/mL的濃縮液,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 PLT-Exos的制備 取大鼠30只,分成THSWD組和正常對照組,每組15只,THSWD組按18 g/kg灌胃給予THSWD,每日1次,連續(xù)7 d;正常對照組大鼠以等量生理鹽水灌胃,每日1次,連續(xù)7 d。以超高速差速離心法[15]提取EXOS:首先采用腹主動脈取血法分別收集各組大鼠全血樣品,以9∶1的比例加入2.5%枸櫞酸鈉抗凝溶液中;200g離心12 min,上清為富血小板血漿。吸取上清至新離心管;900 g離心12 min,沉淀即為血小板;吸棄上清,2 mL Tyrodes緩沖液37 ℃重懸血小板。使用凝血酶(1 U/mL)體外處理血小板,37 ℃水浴孵育1 h,促進血小板激活和凝集。反應(yīng)之后,以2 500g離心15 min,上清為血小板分泌的細(xì)胞外顆粒。將上清移至超速離心管,加PBS至7～8 mL,其余離心管用水配平。4 ℃、20 000g離心40 min,沉淀為血小板釋放的微囊泡,上清為富Exos溶液。將上清移至新超速離心管,配平后在120 000g、4 ℃條件下離心70 min,沉淀為Exos。棄去上清后,用100 μL PBS重懸Exos。

2.3 大鼠腦缺血再灌注模型的制備 參照線栓法[16]制備大鼠腦缺血再灌注損傷模型。假手術(shù)組不作插線處理,其余手術(shù)步驟同模型組。24 h后進行神經(jīng)功能學(xué)評分,驗證動物模型是否復(fù)制成功。

2.4 分組與給藥 將復(fù)制成功的腦缺血再灌注模型大鼠分為假手術(shù)組、模型組、THSWD-PLT-Exos組、PLT-Exos組、對照組,每組3只。THSWD-PLT-Exos組通過尾靜脈注射0.5 mg/kg的THSWD-PLT-Exos;PLT-Exos組通過尾靜脈注射0.5 mg/kg的PLT-Exos;此兩組共注射3次,以星期一、星期三、星期五為時間點。模型組與假手術(shù)組在同時間點注射等量生理鹽水,對照組通過尾靜脈注射25 mg/kg的丁苯酞注射液[17]。

2.5 觀察指標(biāo)及方法

2.5.1 透射電子顯微鏡觀察PLT-Exos形態(tài) 取15 μL的樣本于銅網(wǎng)上靜置1 min。使用濾紙將銅網(wǎng)上的Exos樣本吸干后,滴加15 μL的2%醋酸雙氧鈾染色液室溫染色1 min。使用濾紙吸干液體,將染色完成的樣本置于白熾燈下照射10 min,常溫干燥,透射電子顯微鏡下觀察拍照,保存圖片。

2.5.2 Western blot法檢測PLT-Exos標(biāo)志蛋白的表達(dá)水平 用50 μL蛋白裂解液重懸Exos,冰上渦旋裂解30 min;12 000 r/min、4 ℃離心15 min,將上清液吸取至干凈的EP管。按照BCA試劑盒說明書測定蛋白質(zhì)濃度。配制SDS-PAGE,電泳,轉(zhuǎn)膜,孵育一抗CD9(1∶1 000)、CD63(1∶1 000)、TSG101(1∶1 000)過夜,孵育二抗,顯影,成像。以提取的血小板作為對照。

2.5.3 納米粒徑分析儀檢測PLT-Exos粒徑 使用NanoSight N300檢測所提取PLT-Exos的粒徑。實驗前先以去離子水清洗樣本池。再次以PBS清洗樣本池,上機檢測前使用PBS稀釋Exos至合適的濃度,將稀釋好的Exos樣本注射到樣品室中,每個樣本檢測重復(fù)3次。

2.5.4 激光多普勒血流儀檢測大鼠腦血流量 采用激光多普勒檢測大鼠腦血流量的改變。大鼠麻醉后,采用手術(shù)刀于大鼠腦部同側(cè)囟門后中線外5 mm位置切開,清理顱骨表面筋膜,將探頭固定到顱骨上,連續(xù)檢測至基線穩(wěn)定,截取5 min穩(wěn)定的基線作為參考數(shù)據(jù),單位為灌注單位(perfusion unit,PU)。

2.5.5 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin ,HE)染色法觀察大鼠腦海馬組織的病理變化 將大鼠麻醉后仰臥位固定于操作臺上,打開胸腔,使用0.9%生理鹽水灌注心臟10 min 后,4%多聚甲醛水溶液灌注心臟15～20 min,取出腦組織,浸泡于4%多聚甲醛水溶液,于4 ℃保存,石蠟包埋切片。

2.5.6 免疫熒光染色法觀察大鼠腦BrdU和vWF的表達(dá)水平 模型復(fù)制后第5天,分別于8:00、10:00、12:00和14:00對大鼠腹膜內(nèi)注射50 mg/kg Brdll。于模型復(fù)制后第7天,將大鼠大腦取出。切片用一級抗體(BrdU,1∶100;vWF,1∶300)孵育,然后用熒光染料標(biāo)記的二級抗體孵育。最后,在室溫下用DAPI染色細(xì)胞核5 min,封片拍照。

3 結(jié)果

3.1 透射電子顯微鏡下PLT-Exos的形態(tài) 透射電子顯微鏡下PLT-Exos的形態(tài)特征為茶托狀或杯狀結(jié)構(gòu),直徑在100 nm以內(nèi),符合Exos形態(tài)要求。見圖1。

3.2 Western blot法檢測Exos標(biāo)志蛋白 Western blot法檢測Exos標(biāo)志蛋白CD63、CD9和TSG101,發(fā)現(xiàn)CD63、CD9和TSG101在所提取的樣本中呈陽性表達(dá),符合Exos表征蛋白的表達(dá),表明本實驗所提取的樣本為PLT-Exos。見圖1。

注:A.PLT-Exos;B.血小板

3.3 納米粒徑分析儀檢測PLT-Exos的粒徑 納米粒徑分析檢測結(jié)果顯示,外泌體樣本的實測平均粒徑為90.5 nm,提示本實驗超速離心所提取的PLT-Exos的樣本粒徑符合30～100 nm的分布范圍。見圖2。

圖2 納米粒徑分析儀實時觀察PLT-Exos(A,箭頭標(biāo)記為

3.4 大鼠缺血側(cè)腦血流量比較 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠的腦血流量明顯減少;與模型組比較,THSWD-PLT-Exos組、PLT-Exos組及對照組大鼠的腦血流量明顯增加。見圖3。

注:A.假手術(shù)組;B.模型組;C.THSWD-PLT-Exos組;D.PLT-Exos組;E.對照組;與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

3.5 各組大鼠腦海馬組織病理變化 假手術(shù)組大鼠海馬區(qū)的腦組織結(jié)構(gòu)完整,神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)正常、邊界清晰、排列規(guī)則,細(xì)胞核完整,核膜連續(xù),細(xì)胞質(zhì)飽滿;模型組大鼠海馬區(qū)腦組織結(jié)構(gòu)比較疏松,神經(jīng)細(xì)胞損傷比較嚴(yán)重、邊界不清、排列不規(guī)則,細(xì)胞核固縮,核膜不完整,細(xì)胞周圍間隙增大,胞質(zhì)中可見空泡;THSWD-PLT-Exos組、PLT-Exos組大鼠海馬組織均呈輕度缺血性改變,損傷程度較模型組輕,細(xì)胞狀態(tài)較好,核大而圓,核仁較清晰,各項病理改變均有明顯改善;對照組大鼠海馬組織損傷情況較輕,細(xì)胞核皺縮和間質(zhì)水腫的情況較模型組有較大減輕。見圖4。

注:A.假手術(shù)組;B.模型組;C.THSWD-PLT-Exos組;D.PLT-Exos組;E.對照組

3.6 各組大鼠腦組織BrdU和vWF免疫熒光表達(dá)水平比較 免疫熒光染色結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較,模型組腦組織中BrdU和vWF的表達(dá)水平明顯增高(P<0.05);與模型組比較,THSWD-PLT-Exos組和PLT-Exos組腦組織中BrdU和vWF的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。見圖5。

注:免疫熒光圖(左圖);BrdU/vWF熒光信號的定量(右圖);A.假手術(shù)組;B.模型組;C.THSWD-PLT-Exos組;D.PLT-Exos組;E.對照組;與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

4 討論

大量研究表明,腦缺血所導(dǎo)致的腦損傷是一個復(fù)雜的病理過程,發(fā)病早期以大量氧自由基的產(chǎn)生、腦水腫及興奮性氨基酸毒性為主;中期以炎癥、神經(jīng)元凋亡為主;后期以神經(jīng)再生、血管新生和膠質(zhì)細(xì)胞增殖等腦重構(gòu)表現(xiàn)為主。而腦血管新生為神經(jīng)元重構(gòu)提供了關(guān)鍵的神經(jīng)血管底物,能及時恢復(fù)局部腦供血,對損傷后功能恢復(fù)非常關(guān)鍵[18]。缺血性腦卒中血管的新生在很大程度上依賴于血流量的恢復(fù)。新形成的血管將增加腦血流量,從而增加氧和營養(yǎng)物,使腦內(nèi)的能量狀態(tài)趨于穩(wěn)定,腦組織得以生存。因此,血管新生對腦損傷后的恢復(fù)起著重要作用。

對Exos進行研究,首先應(yīng)提取高純度Exos并對其進行鑒定。常見的Exos分離方法主要有5種,包括超速差速離心法、超濾法、沉淀法、免疫親和法和微流體分離法。目前,大多數(shù)研究者選用超速差速離心法分離Exos。此方法通過逐步遞增的離心力和離心時間,以去除細(xì)胞、細(xì)胞碎片和較大的細(xì)胞外囊泡,從而獲得純度較高的Exos。國際細(xì)胞外囊泡學(xué)會在指南中給出了鑒定Exos的方法,即采用NTA、透射電子顯微鏡和標(biāo)志蛋白的檢測進行鑒定[19]。本研究首先分離出經(jīng)THSWD灌胃1周的大鼠全血中的血小板,再通過逐步離心提取PLT-Exos,經(jīng)過上述NTA和透射電子顯微鏡觀察,選取CD9、CD63、TSG101標(biāo)志蛋白對Exos進行鑒定,確定PLT-Exos已被成功提取分離。

相關(guān)研究[20]表明,THSWD具有干預(yù)血小板活化的抗凝祛瘀作用,包括抑制大鼠血小板聚集,降低血瘀大鼠血漿中血栓素B2(thromboxane B2,TXB2)、vWF等因子水平,調(diào)節(jié)血小板釋放血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial cell growth factor, VEGF)及內(nèi)皮抑素。PLT-Exos是從活化的血小板上脫落的脂膜,具有與血小板類似的生物功能[21],可將其生物內(nèi)容物傳遞到受體細(xì)胞,參與血小板和內(nèi)皮細(xì)胞的活化及凝血的調(diào)節(jié)[22]。有研究表明,PLT-Exos具有抗凝的作用,可以在體外抑制血小板聚集,并減少血小板與體內(nèi)受損血管中膠原的黏附。PLT-Exos降低了血小板的反應(yīng)性,抑制血管血栓的形成。如在動脈粥樣硬化中,活化的PLT-Exos可顯著降低血小板Ⅱ型清道夫受體CD36的表達(dá)水平,從而減少血小板聚集,抑制血栓形成[23]。

Exos具有的生物特點優(yōu)勢,可以使其可穿過血腦屏障。研究[24]表明,Exos可作為載體將藥物傳遞至靶器官,一些中藥可以干預(yù)某些細(xì)胞或其所釋放的Exos,影響其中攜帶的內(nèi)容物如蛋白、miRNA,從而達(dá)到治療效果。如通過補陽還五湯調(diào)控后的間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的Exos可增加腦缺血大鼠腦血管的生成,其作用可能是補陽還五湯上調(diào)了間充質(zhì)干細(xì)胞Exos中血管生成相關(guān)miRNA和血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)水平。經(jīng)黃芩苷干預(yù)的大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞Exos,對血腦屏障中緊密連接蛋白具有上調(diào)作用[25]。課題組前期研究已驗證了THSWD可調(diào)節(jié)多種血小板微顆粒中攜帶的血管生成相關(guān)蛋白,包括生長因子、基質(zhì)金屬蛋白酶、趨化因子等[14]。因此,本研究觀察THSWD-PLT-Exos對缺血大鼠腦的作用,發(fā)現(xiàn)THSWD-PLT-Exos對大鼠腦血管新生的作用優(yōu)于PLT-Exos,推斷THSWD-PLT-Exos存在,并且THSWD對PLT-Exos具有一定的調(diào)控作用,但其機制需進一步研究。

血管生成在腦缺血損傷后被激活,目前普遍認(rèn)為血管新生改善了缺血區(qū)的血液供應(yīng)[26]。臨床常依據(jù)腦血流灌注量判斷缺血性腦卒中患者的病情[27]。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)THSWD-PLT-Exos處理的大鼠腦血流量明顯上升。病理切片結(jié)果顯示,THSWD-PLT-Exos組大鼠海馬區(qū)細(xì)胞形態(tài)較完整、排列整齊,核仁和胞漿界限清晰,病變程度有明顯改善。免疫熒光染色中,BrdU用于標(biāo)記最近增殖的細(xì)胞,vWF由內(nèi)皮細(xì)胞和巨核細(xì)胞釋放,是一種大型多聚體糖蛋白,通過涉及VEGFR-2 信號傳導(dǎo)和血管生成素-2的多種交叉通路調(diào)節(jié)血管生成[28],因此,vWF被認(rèn)為是內(nèi)皮細(xì)胞損傷的標(biāo)志。本研究發(fā)現(xiàn),兩組Exos組中,腦組織中BrdU和vWF的表達(dá)水平較高。這表明THSWD-PLT-Exos可以促進新生細(xì)胞的增殖,并增加損傷后的血管內(nèi)皮細(xì)胞,說明其具有神經(jīng)和血管生成的作用。

前期研究結(jié)果表明,THSWD對腦缺血再灌注損傷具有良好的血管生成和神經(jīng)保護作用,包括促進PMPs所攜帶血管生成相關(guān)信號分子的調(diào)節(jié)和Notch信號通路的激活。本研究發(fā)現(xiàn),THSWD作為治療缺血性腦卒中的藥物,經(jīng)其干預(yù)后提取的PLT-Exos也具有一定的血管生成和神經(jīng)保護作用,其原因可能是調(diào)控了PLT-Exos中所攜帶的血管生成相關(guān)蛋白。今后將對其所攜帶的相關(guān)蛋白的表達(dá)進一步研究,以探討其作用機制。