潘怡霖,尚莉麗

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院,安徽 合肥 230012;2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒科,安徽 合肥 230031)

支氣管哮喘是以氣道高反應(yīng)性與氣道炎癥為特征的慢性呼吸道疾病,其臨床控制率較低[1]、疾病負(fù)擔(dān)較重[2],且兒童發(fā)病率高于成人[3]。其中,哮喘臨床緩解期(clinical remission of asthma,CRA)是控制兒童支氣管哮喘的重要治療階段[4]。醫(yī)學(xué)研究[5-6]發(fā)現(xiàn),腸道微生物與“腸肺串?dāng)_”影響著哮喘的發(fā)生發(fā)展。腸道微生物能夠產(chǎn)生組胺、短鏈脂肪酸等物質(zhì),刺激免疫調(diào)節(jié)信號,影響肺部的免疫反應(yīng)與炎癥反應(yīng)[7]。未來,微生物治療可能成為哮喘治療的發(fā)展方向[8]。

健脾補(bǔ)肺化痰方[9]是治療CRA患者的經(jīng)驗方,根據(jù)CRA患者肺脾氣虛證居多的臨床特點[10]與中醫(yī)理論而制定,臨床運用加以“態(tài)靶”思維論治。前期研究[9,11]證實,本方能減輕哮喘患兒臨床癥狀,提高臨床控制率。本研究立足于腸道菌群變化,探究健脾補(bǔ)肺化痰方治療CRA的潛在機(jī)制,尋求治療新靶點。

1 材料

1.1 動物 32只SPF級雌性健康BALB/c小鼠,(21±3)日齡,體質(zhì)量16～18 g。由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供,生產(chǎn)許可證號: SCXK(京)2021-0006;本研究由安徽中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn),倫理編號: AHUCM-mouse-2022077。

1.2 主要藥物與試劑 健脾補(bǔ)肺化痰方(黃芪20 g,太子參、白扁豆、薏苡仁各15 g,茯苓、白術(shù)、桔梗各 10 g,陳皮6 g,砂仁、炙甘草各3 g)顆粒劑:由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供;孟魯司特鈉顆粒(每袋4 mg):蘇州吳淞江制藥;雞卵清蛋白(ovalbumin,OVA):美國Sigma公司;蘇木精染液(批號03162211)、醇溶伊紅染液(批號03092215):中國Ebiogo公司;小鼠組胺(貨號JYM0450Mo):武漢基因美科技有限公司;核酸純化試劑盒:美國Beckman Coulter;Taq DNA聚合酶:中國Transgen;NovaSeq 6000試劑盒:美國Illumina。

1.3 主要儀器 Ani Res 2005動物肺功能分析系統(tǒng):北京貝蘭博科技有限公司;CX41型顯微鏡:OLYMPUS;RT-6100型酶標(biāo)儀:深圳雷杜公司;DNP-9052BS-Ⅲ型電熱恒溫箱:上海三發(fā)公司;微量分光光度計:美國10x Genomics公司;Invitrogen Qubit 3.0型熒光定量儀、ABI 2720型PCR擴(kuò)增儀:美國Thermo Scientific;Agilent 2100型生物分析儀:美國Agilent Technologies;Illumina NovaSeq 6000型測序儀:美國Illumina。

2 方法

2.1 模型制備 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后,按照參考文獻(xiàn)[12-13]的方法,遵循完全隨機(jī)原則將除空白組外的24只小鼠進(jìn)行模型復(fù)制:第1天和第12天使用含有100 μg OVA和1 mg Al(OH)3的0.2 mL致敏液進(jìn)行腹腔注射致敏;第18天至第23天每天用5% OVA進(jìn)行1次霧化(每次30 min);第26天開始5% OVA霧化頻次降至每周3次(每次30 min)。第56天時將模型復(fù)制成功的小鼠隨機(jī)分為模型組、健脾補(bǔ)肺化痰方組、孟魯司特鈉組,每組8只。模型復(fù)制成功的標(biāo)志為小鼠在霧化時出現(xiàn)煩躁不安、呼吸急促、腹肌痙攣和大小便失禁等體征。

2.2 給藥方法 從57天起至第78天,空白組、模型組均給予生理鹽水灌胃;健脾補(bǔ)肺化痰方組給予2.55 g/mL健脾補(bǔ)肺化痰方溶液灌胃,孟魯司特鈉組予以0.26 mg/mL孟魯司特鈉溶液灌胃。每只小鼠給藥容積為10 μL/g,灌胃劑量依據(jù)《藥理實驗方法學(xué)》[14]中人與動物藥物劑量換算方法計算獲得。

2.3 肺功能測試 使用濃度為3%的戊巴比妥鈉(75mg/kg)對小鼠進(jìn)行麻醉,按操作要求處理氣管后插入匹配的氣管插管。接著放入體描箱并連接氣路,運行Ani Res 2005程序,創(chuàng)建FVC實驗,采集數(shù)據(jù)。整個實驗過程按說明書要求操作,檢測第1秒用力呼氣量/用力肺活量( forced expiratory volume in the first second/forced vital capacity,FEV1/FVC)、用力呼氣量為25%～75%肺活量時的平均流量/FVC(mean flow to forced vital capacity at forced expiratory volume of 25% to 75% of vital capacity,FEV25-75/FVC)。

2.4 組織學(xué)檢查 將小鼠脫頸處死后,取其右肺組織、結(jié)腸組織,組織樣本由4%多聚甲醛固定2～3 d,石蠟包埋,切片后染色。然后通過光學(xué)顯微鏡觀察肺組織、結(jié)腸組織病理形態(tài)學(xué)改變。

2.5 高通量測序 根據(jù)操作要求,提取腸內(nèi)容物(糞便),用熒光定量儀提取DNA;用微量分光光度計和凝膠電泳檢測樣品的濃度、純度和完整性;以提取的DNA為模板,用正反向引物擴(kuò)增16S rRNA基因的V3-V4高變量區(qū),反復(fù)3次;將同型號PCR產(chǎn)物匯集作為模板,用引物將Illumina索引添加到文庫中,進(jìn)行PCR索引;擴(kuò)增產(chǎn)物使用凝膠電泳檢測,并使用核酸純化試劑盒進(jìn)行純化;純化產(chǎn)物在16S V3-V4庫中建立索引,通過熒光定量儀和生物分析儀評估文庫質(zhì)量;最后,在Illumina NovaSeq 6000測序儀上對匯集的文庫進(jìn)行測序,生成2×250 bp對端讀取。

2.6 夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗 檢測血清和糞便中組胺濃度,按要求提取樣本(血清、糞便上清液)標(biāo)準(zhǔn)液,根據(jù)說明書進(jìn)行操作,利用吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線計算血清、糞便中組胺的濃度。

2.7 生物信息學(xué)與統(tǒng)計分析測序方法 基于Mothur的Ribosomal Database Project(RDP) Release9 201203進(jìn)行分類操作單元(operational taxonomic Units,OTUs)分類。Beta多樣性分析(PCoA分析、PLS-DA分析、ADONIS分析)與相關(guān)性分析采用R 軟件(Vegan package,V3.3.1)進(jìn)行。其余使用GraphPad Prism 9進(jìn)行統(tǒng)計分析,多組均數(shù)比較使用單因素方差分析與Dunnett’sT3事后檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠肺功能比較 與空白組比較,模型組小鼠的肺通氣功能降低(P<0.05);與模型組比較,健脾補(bǔ)肺化痰方組與孟魯司特鈉組的肺功能改善(P<0.05)。結(jié)果提示,健脾補(bǔ)肺化痰方能夠有效提高CRA模型小鼠肺功能,改善氣道阻塞程度與小氣道通氣功能。見圖1。

注:A.空白組;B.模型組;C.健脾補(bǔ)肺化痰方組;D.孟魯司特鈉組;與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

3.2 各組小鼠肺組織、結(jié)腸組織形態(tài)比較 空白組肺組織與結(jié)腸組織呈健康狀態(tài)。與空白組比較,模型組肺組織存在大量炎癥細(xì)胞浸潤,肺泡腔嚴(yán)重破壞,出現(xiàn)氣道重塑,即支氣管壁與氣道平滑肌增厚,支氣管腔變窄;結(jié)腸組織存在大量炎癥細(xì)胞浸潤,且杯狀細(xì)胞排列不規(guī)律。與模型組比較,健脾補(bǔ)肺化痰方組與孟魯司特鈉組肺組織和結(jié)腸組織炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少,肺泡腔破壞得到恢復(fù),氣道重塑得到扭轉(zhuǎn),結(jié)腸組織中杯狀細(xì)胞排列趨向規(guī)律。結(jié)果提示,CRA模型小鼠的肺、結(jié)腸均存在病理改變;健脾補(bǔ)肺化痰方能夠有效改善CRA模型小鼠的肺、結(jié)腸部病變,扭轉(zhuǎn)支氣管氣道重塑。見圖2、圖3。

注:A.空白組;B.模型組;C.健脾補(bǔ)肺化痰方組;D.孟魯司特鈉組

3.3 各組腸道菌群Beta多樣性分析 空白組、模型組、健脾補(bǔ)肺化痰方組Beta多樣性的差異明顯(P<0.05),組樣本獨立。其中,ADONIS分析顯示,模型組與空白組的菌群分布距離較遠(yuǎn),健脾補(bǔ)肺化痰方組與空白組的菌群分布距離較近。結(jié)果提示,健脾補(bǔ)肺化痰方在一定程度上能夠改善腸道菌群的組成,使菌群趨于健康狀態(tài)。見圖4。

3.4 各組門水平和科水平的差異菌比較 門水平的差異菌主要是擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)。與空白組比較,模型組的擬桿菌門和放線菌門的豐度明顯降低(P<0.05),厚壁菌的豐度明顯升高(P<0.05),擬桿菌門與厚壁菌門的比值升高(P<0.05)。與模型組比較,健脾補(bǔ)肺化痰方組的擬桿菌門群落豐度和放線菌門群落豐度明顯升高(P<0.05),厚壁菌的豐度明顯降低(P<0.05),Firmicutes/Bacteroidetes(F/B)降低(P<0.05)。科水平的差異菌主要是普氏菌科(Prevotellaceae)、紫單胞菌科(Porphyromonadaceae)和毛螺菌科(Lachnospiraceae)。其中,紫單胞菌科、普氏菌科屬于擬桿菌門,毛螺菌科屬于厚壁菌門。與空白組比較,模型組的普氏菌科群落豐度明顯降低(P<0.05),毛螺菌科群落豐度有提高趨勢。與模型組比較,健脾補(bǔ)肺化痰方組的普氏菌科群落豐度有提高趨勢,紫單胞菌群落豐度明顯升高(P<0.05),毛螺菌科群落豐度明顯降低(P<0.05)。與空白組比較,健脾補(bǔ)肺化痰方組的普氏菌科和毛螺菌科群落豐度明顯降低(P<0.05),紫單胞菌科群落豐度明顯升高(P<0.05)。結(jié)果提示,健脾補(bǔ)肺化痰方能調(diào)節(jié)CRA模型小鼠腸道菌群在門水平與科水平上的群落豐度。見圖5、圖6。

注:A.空白組;B.模型組;C.健脾補(bǔ)肺化痰方組;與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

注:A.空白組;B.模型組;C.健脾補(bǔ)肺化痰方組;與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

3.5 各組小鼠血清、糞便組胺水平比較 與空白組比較,模型組血清與糞便的組胺水平均升高(P<0.05);與模型組比較,健脾補(bǔ)肺化痰方組血清與糞便的組胺水平均下降(P<0.05)。結(jié)果提示,健脾補(bǔ)肺化痰方能下調(diào)血清和糞便中菌群產(chǎn)生的組胺。見圖7。

注:A.空白組;B.模型組;C.健脾補(bǔ)肺化痰方組;與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

3.6 門水平腸道菌群與其他指標(biāo)的相關(guān)性分析 差異菌的厚壁菌門、放線菌門和擬桿菌門與肺功能、組胺均有相關(guān)性。厚壁菌門群落豐度與血清、糞便中組胺呈正相關(guān),與肺功能(FEF25-75/FVC、FEV1/FVC)呈負(fù)相關(guān)。厚壁菌門、放線菌門的群落豐度與血清中組胺水平具有顯著的負(fù)相關(guān)性(P<0.05);放線菌門群落豐度與糞便中組胺水平具有顯著的負(fù)相關(guān)性(P<0.05)。并且厚壁菌門、放線菌門與擬桿菌門群落豐度與肺功能(FEF25-75/FVC、FEV1/FVC)均顯著相關(guān)(P<0.05)。結(jié)果提示,門水平差異菌的群落豐度變化與疾病變化存在相關(guān)性。見圖8。

注:具有顯著差異的腸道菌群以粗體突出顯示;*P<0.05

4 討論

腸道菌群可通過其代謝產(chǎn)物經(jīng)血液循環(huán)達(dá)到肺部宿主細(xì)胞,或者作用腸道黏膜,刺激黏膜免疫,影響呼吸道功能[15-16]。炎癥性腸病與慢性肺疾病存在潛在關(guān)聯(lián)[11-12],且肺系疾病患者的腸道癥狀與肺部病情的嚴(yán)重程度高度一致[10]。本研究發(fā)現(xiàn),CRA模型小鼠存在肺腸共病的情況,各組小鼠肺、腸組織的病理變化存在程度一致性。這些發(fā)現(xiàn)表明小鼠的肺、腸宿主細(xì)胞間存在關(guān)聯(lián),并為探究腸道菌群與其代謝產(chǎn)物提供科學(xué)性基礎(chǔ)。

在腸道群落中,擬桿菌門群落與放線菌門群落是健康人體內(nèi)更豐富存在的細(xì)菌群落[17],厚壁菌門群落是哮喘患者體內(nèi)更豐富的細(xì)菌群落[18]。此外,厚壁菌門與擬桿菌門的比值升高可作為腸道生態(tài)失調(diào)的標(biāo)志[19]。屬于擬桿菌門的紫單胞菌科群落、普氏菌科群落是健康受試者中更為豐富的厭氧菌,可發(fā)酵為丁酸等短鏈脂肪酸,促進(jìn)免疫細(xì)胞的募集和成熟,調(diào)節(jié)肺的免疫反應(yīng)[20-22]。而毛螺菌科群落是在兒童哮喘患者中更豐富的屬厚壁菌門的細(xì)菌群落[23],其豐度降低具有保護(hù)腸道屏障的作用[24]。本研究發(fā)現(xiàn),健脾補(bǔ)肺化痰方能夠有效調(diào)節(jié)CRA模型小鼠中擬桿菌門、放線菌門、厚壁菌門、紫單胞菌科、普氏菌科、毛螺菌科群落的豐度,并使這些腸道菌群趨于健康狀態(tài)。

在哮喘的免疫反應(yīng)中,組胺從被激活的肥大細(xì)胞中釋放,作用T細(xì)胞反應(yīng),促進(jìn)支氣管收縮[25-26]。在腸道中,組胺由擬桿菌、厚壁菌等微生物群落產(chǎn)生,可作為一種細(xì)菌信號作用調(diào)節(jié)宿主代謝與免疫[27]。FVC試驗是臨床應(yīng)用極為廣泛的一種判斷哮喘患者肺功能的檢測手段[28-29]。肺功能與氣道微生物具有相關(guān)性[30]。本研究發(fā)現(xiàn),CRA模型小鼠血清和糞便的組胺水平較高,肺功能較低,健脾補(bǔ)肺化痰方可有效降低其組胺水平與提高肺功能。本研究表明,腸道菌群與疾病發(fā)展呈動態(tài)相關(guān),并且糞便中菌群可能通過調(diào)控組胺而影響哮喘的免疫反應(yīng)。

綜上所述,健脾補(bǔ)肺化痰方治療CRA模型小鼠療效顯著,可能通過調(diào)控特定的腸道菌群與代謝物組胺影響哮喘的免疫反應(yīng)而起到治療作用。本研究結(jié)果對哮喘治療與健脾補(bǔ)肺化痰方治療CRA的研究提供了新的著力點。